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摘要

本手稿描述了如何在培养的上皮细胞单分子膜切口样病变, 方便模型伤口愈合在体外, 允许成像的共焦或激光扫描显微镜, 并能提供高质量定量和定性数据, 用于研究细胞行为和参与迁移的机制。

摘要

细胞迁移是伤口愈合的一个必需的方面。在研究动物模型上制造人工伤口往往导致昂贵和复杂的实验程序, 但可能缺乏精确性。体外上皮细胞系的培养为研究创面愈合过程中细胞迁移行为和治疗对这些细胞的影响提供了一个合适的平台。上皮细胞的生理学在 non-confluent 条件下经常被研究;然而, 这种方法可能不像自然伤口愈合的条件。通过机械手段破坏上皮细胞的完整性产生了一个现实的模型, 但可能会阻碍分子技术的应用。因此, 显微技术是最理想的研究上皮细胞迁移的体外.在这里, 我们详细介绍了两种具体的方法, 人工伤刮法和人工迁移前分析法, 可以分别获得定量和定性的数据, 对上皮细胞的迁移性能。

引言

细胞迁移是需要的伤口愈合, 因为它是负责最后关闭的上皮间隙和恢复破坏表面1。在动物模型中执行人工伤口允许在近生理条件下复制这个复杂的过程2。然而, 这种方法往往导致昂贵和复杂的实验程序, 可能缺乏精确的研究不同的过程, 由于复杂的性质, 伤口愈合过程。

体外上皮细胞系的培养为研究这些细胞在创伤愈合中所起的作用以及治疗对细胞迁移行为的影响提供了一种有益的替代动物模型。利用 non-confluent 培养的分子技术, 经常研究上皮细胞的生理特性3,4,5,6;然而, 上皮完整性的破坏通常是通过细微的机械切口来实现的。在细胞培养中, 这意味着可忽略的细胞数可能暴露在伤口间隙, 它们代表了一个太小的样本分子生物学技术。然而, 这些病变可以在显微镜下进行研究, 利用一些上皮细胞系的固有迁移特性, 如水貂肺上皮细胞 (Mv1Lu) 或自发永生化的人角质形成细胞 (HaCaT)。线.

在这里, 我们描述了一种显微镜方法, 它是适合获得定量数据的上皮细胞迁移在伤口愈合的情况下3,4,7,8。此外, 我们提出的其他方法, 有助于研究的定性分子和形态学的变化发生在上皮膜的迁移。总的来说, 这些方法提供了一个框架来研究的动力学和形态学的变化涉及上皮细胞的行为和反应的治疗过程中伤口愈合。

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研究方案

1. 定量研究的人工伤口划痕法

  1. 细胞单层制备
    1. 在无菌条件下工作, 用血清补充培养基在培养瓶中种 Mv1Lu 或 HaCaT 上皮细胞。每24-48 小时刷新一次介质。在单元格达到80% 汇合后, 使用适当的方法分离单元格,即, trypsinization9。
      注: Mv1Lu 和 HaCaT 上皮细胞系分别用 EMEM 和 DEMEM 培养基培养, 并辅以2毫米 l-谷氨酰胺, 在37° c 下孵育 5% CO2的受控气氛。每一个细胞线必须进行彻底的检测, 以确定细胞浓度和时间需要达到完全70-100。通常为 Mv1Lu 或 HaCaT 细胞, 2-4 x 104或 4-6 x 104单元格/好, 分别在 175 cm2培养烧瓶中播种, 在80% 汇合处的收益率高达 35 x 106 Mv1Lu 或 1 x 107 HaCaT 单元格。
    2. 在12井或24井培养板, 种子在每井2毫升的细胞。每24-48 小时刷新一次介质, 确保电池数量足够高, 可以在2或3天后达到100% 汇合。
    3. 细胞到达汇合处后, 取出血清补充培养基, 用新鲜无血清培养基冲洗两次。在刮伤前24小时将细胞保持在无血清培养基中。
      注: Mv1Lu 或 HaCaT 细胞没有特殊的承印物要求;然而, 对于易在无血清条件下自发分离的细胞系, 使用聚 l-赖氨酸溶液的培养板表面的预应考虑为10。
  2. 单层刮伤
    1. 在无菌环境中工作, 通过牢固地拖动20µL 或200µL 无菌微尖端的窄端, 根据所需的划痕宽度, 从头开始培养单层。保持尖端与培养面垂直, 最大限度地提高间隙均匀性。
      1. 将培养皿放置在深色表面上, 以清楚地监视细胞单分子。如果需要, 在每个井上执行两个垂直划痕 (十), 以研究多达4迁移区。
    2. 通过轻轻去除培养基, 轻轻地加入新鲜无血清培养基, 洗涤分离细胞。重复两次, 或直到大多数未连接的单元格被移除。
  3. 实验程序和数据收集
    1. 采用一台倒置的相衬显微镜, 结合 CCD 相机, 以每井的划痕间隙为中心的4前处理参考图像。通过将显微镜场的边缘与划痕的相邻交叉点对齐, 选择感兴趣区域。
      注意: 通常, 图像是使用10x 放大倍数和 1280 x 1024 像素图像大小获取的。如上所述, 选择感兴趣的区域有助于方便地定位和验证每井4测量。
    2. 一旦所有的图像获得, 指定治疗井;用含有选定处理的新鲜培养基在井中交换培养基。
      注: 另外, 对于不干扰培养基同质性的化学品或化合物, 可以直接将治疗接种到培养基中。
    3. 孵育刮板 (37 ° c 与控制气氛包含 5% CO2), 直到观察到的条件达到90% 划痕间隙闭合。避免完全关闭。
      注: 总间隙闭合使后处理图片收集无法检测, 无法确定间隙闭合的时间基准。在 Mv1Lu 或 HaCaT 细胞的情况下, 需要16-19 小时达到90% 汇合。
    4. 通过固定细胞来阻止细胞迁移;在 PBS 中用1毫升4% 福尔马林轻轻地取代实验培养基。在 RT 处孵育15分钟。
    5. 清洗细胞去除过量福尔马林;用新的 PBS 将溶液轻轻地替换在井中。重复至少两次。
      注: 在这个阶段, 在密封之后, 板材可以被存放在4° c 无限期地。
    6. 从划痕后捕获的原始参考区域中对每一个井后的参考图像进行处理。使用相同的设备 (倒置光学相衬显微镜, 结合 CCD 相机) 和匹配的图片设置 (放大和数字分辨率/密度)。
      注意: 对于单独迁移并填补间隙的单元格, 独立于相干锋的形成 (例如, MDA-MB-231 乳腺癌人细胞), 时效图像可能允许计算单个细胞迁移速度。
  4. 图像分析与迁移量化
    1. 使用图像处理软件 (例如, ImageJ), 定义划痕间隙限制, 并确定在预处理图片中多达四测量的间隙表面。将数据记录为 "预处理间隙曲面" (PREGAP)。对后处理图片重复相同的过程。将数据记录为 "后处理间隙曲面" (POSTGAP)。
      1. 使用 ImageJ 打开录制的图像。在 "图像" 菜单中, 将图像类型设置为8位。在 "进程" 菜单中, 转到 "过滤器" 子菜单并应用 "方差" 过滤。
      2. 在 "图像" 菜单中, 输入 "调整" 子菜单, 并将阈值设置为黑白 (B 和 #38; W), 确保未选中 "暗背景"。在 "进程" 菜单中, 转到 "二进制" 子菜单, 然后选择 "填充孔"。
      3. 在 "分析" 菜单中, 选择 "设置测量" 并激活 "区域"。然后绘制在迁移边缘轮廓之后的可测量区域, 从而划定间隙。
      4. 在 "分析" 菜单中, 选择 "分析粒子" 并记录绘制区域表面的 "总面积" 值。
    2. 在电子表格中引入 PREGAP 和 POSTGAP 的总面积值, 以量化每个样本集的绝对迁移, 作为间隙表面测量的差异: PREGAP − POSTGAP [任意单位]。另外, 将每个条件的绝对迁移数据规范化为控制样本: (采样/控制) * 100 [%]。
      注意: 对于单独迁移和填充间隙的单元格, 独立于相干锋的形成, (例如, MDA-MB-231 的乳腺癌人细胞), 绝对迁移可以通过计数细胞侵入中心地带, 无论是在控制或处理过的样品。
    3. 绘制量化输出 (请参见图 1)。必要时进行统计分析。
当比较两个条件或方差检验的分析时, 考虑学生的 t 检验, 以得到更多的条件。

2. 地形研究的人工迁移前沿试验

  1. 细胞单层制备
    1. 在无菌条件下工作, 将一层消毒的圆形片放在空的培养基中, 直到盘子表面完全覆盖。
      注: 最多12和33片适合5厘米和10厘米直径的板材, 分别。
    2. 在培养基上, 在2或3天后, 轻轻地将足够数量的细胞聚集在一起, 使100% 汇合。确保没有片重叠相邻的片和防止片的浮动, 应用温和的压力与无菌微提示。每24-48 小时刷新介质。
      注意: 每一个细胞线必须进行彻底的检测, 以确定细胞浓度和时间需要达到完全70-100。通常为 Mv1Lu 或 HaCaT 单元格, 分别为 2-3 x 106或 2.5-4 x 106 cells/10 cm 直径板。对于较小的板材, 必须缩小单元格数。
    3. 细胞到达汇合处后, 取出血清补充培养基, 用新鲜无血清培养基代替。在进行人工伤口前, 将细胞保持在无血清培养基中24小时。
      注: Mv1Lu 或 HaCaT 细胞没有特殊的承印物要求;然而, 对于易在无血清条件下自发分离的细胞系, 使用聚 l-赖氨酸溶液预的培养表面应考虑为10。
  2. 单层伤
    1. 使用无菌镊子, 轻轻地移动一个片到一个干净的10厘米板含有新鲜的无血清培养基。用镊子在外围片, 避免损坏单层。避免过度的压力, 可能导致片破损。
    2. 通过在片中心的横线上拖动一条消毒的刀片来制造人为的伤口。拖3-4 毫米来回, 为了完全删除中央单层带。确保没有细胞残骸附着在受伤的边缘。
      注: 在直径为12毫米的圆片上, 切口是在片的中部进行的。确保在主前侧留有足够大 (至少2毫米宽) 的细胞, 以避免片在以下步骤中倾斜。
    3. 将受伤的片与面对向上的细胞转移到一个干净的6井板上, 其中含有至少2毫升新鲜无血清培养基。可容纳4受伤的片/井。
    4. 用新鲜无血清培养基轻轻冲洗两次, 去除分离细胞。
  3. 实验程序和取样
    1. 用含有选定处理的新鲜培养基轻轻地在井中交换培养基。
      注: 另外, 对于不干扰培养基同质性的化学品或化合物, 可以直接将治疗接种到培养基中。谨慎行事, 避免任何潜在的细胞脱离。
    2. 保持板在细胞孵化器 (37 ° c, 5% CO2) 为期望的实验时间。
    3. 通过固定细胞来阻止细胞迁移;在 PBS 中用1毫升4% 福尔马林轻轻地取代实验培养基。在 RT 处孵育15分钟。
      注: 对于时间课程的实验, 从培养基中取出样品, 并将其固定在一个单独的盘子中, 以避免甲醛烟雾影响其他的, 正在进行的实验条件。
    4. 清洗细胞去除过量福尔马林;用新的 PBS 将溶液轻轻地替换在井中。重复至少两次。
      注: 在这个阶段, 在密封之后, 板材可以被存放在4° c 无限期地。
  4. 免疫荧光 (IF) 和拓扑分析
    1. 如在其他地方所描述的那样对个别片进行染色和成像3,4,11。
      1. Permeabilize 在 PBS 的0.3% 海卫 X-100 溶液中浸泡片10分钟。
      2. 使用以下阻断液块30分钟: 0.3% 牛血清白蛋白;10% 胎牛血清;5% 脱脂牛奶;0.3% 海卫 X-100 解决方案在 PBS。
        注: 不含牛奶的堵塞液可提前准备并贮存在-20 ° c。
      3. 在潮湿的室内, 在室温下孵育1小时, 在无牛奶的阻断溶液中稀释初级抗体。将片倒置在15µL 抗体溶液中, 以确保适当的分布。
        注意: 抗体工作稀释是可变的, 将取决于使用的抗体。例如, 兔 anti-c-六月抗体需要1/100 的稀释。
      4. 洗涤三次, 蘸片在0.1% 海卫 X-100 解决方案在 PBS。
      5. 在无奶阻塞缓冲液中稀释的二次抗体中孵育片30分钟。
        注意: 抗体工作稀释是可变的, 将取决于使用的抗体。例如, 山羊抗兔 (488) 需要1/400 稀释以获得最佳的分辨率。其他标记试剂, 如笔和 Hoechst-33258 可以添加到孵化缓冲在这个阶段。
      6. 洗涤三次, 蘸片在0.1% 海卫 X-100 解决方案在 PBS。
      7. 将片倒置在10µL 安装介质放置 (例如, Vectashield) 放置在显微镜幻灯片上。在夜间将幻灯片留在室温下, 以使安装介质硬化。之后, 在黑暗中无限期地存放在4° c。
    2. 获得荧光或共聚焦显微镜图像的结构变化发生在迁移前边缘。
      注意: 拓扑研究可以通过平铺图片从迁移前到内单层。通过基于软件的局部荧光强度分析, 可以进行半定量研究。

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结果

定量研究的人工伤口划痕法: 评估表皮生长因子 (EGF) 促进迁移:

EGF 是一个众所周知的诱导上皮细胞增殖和迁移, 从而对量化迁移促进的积极控制。Mv1Lu 和 HaCaT 细胞单分子膜用于创面划伤的检测, 并获得了预处理图像。在接种 10 ng/毫升 EGF 后, 细胞孵育19小时前固定和后处理图片。通过维持血清饥饿状况, 使其增殖保持在最低限度。?...

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讨论

在皮肤或粘膜的破坏, 屏障功能恢复的行动, 许多细胞类型, 包括成纤维细胞或上皮和免疫细胞。共同, 这些细胞经历了一个复杂的过程, 涉及细胞凋亡, 增殖, 分化, 重要的是, 成纤维细胞和上皮组织迁移, 这是最终的机制, 负责修复被破坏的组织和浅上皮间隙闭合1,12因此, 研究细胞迁移有助于精确描述上皮细胞的生理行为, 同时也确定伤口治疗的调节电位?...

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披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们要感谢实验室的老成员, 帮助改善和完善这些技术的实际状态: Dr. 西莉亚。Dr. 安娜 Mrowiec, Dr., 拉肯纳和 Dr.-加西亚。我们感谢医院 Clínico 体育馆圣女 Arrixaca 大力支持这些技术的发展。还有干杯卡洛斯三世, 基金 de 门多萨市 Sanitarias。计划国家 i + D + i 和干杯研究所-Subdirección 总 de Evaluación y 调值研究 (批准号: PI13/00794);www.isciii.es. Fondos 菲德 "manera de hacer 欧罗巴"。我们还感谢穆尔西亚、IMIB-Arrixaca 和 FFIS 的行政支助和援助。最后, 我们要特别感谢 Dr. 伊莎贝尔-马丁内斯-Argudo 和 Facultad de Ciencias Ambientales Bioquímica, 校园 Tecnológico de Fábrica 武器, 卡斯蒂利亚 la 恰尔, 托莱多为他们的亲切的支持自愿割让生物医学和生物技术实验室, 使本论文的拍摄部分成为可能。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FranceL0102-500Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)LonzaBE12 -662FOptional 10 % FBS supplement
L-GlutamineLonzaBE17-605EUse at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USADE17603A
Trypsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT4049Dilute as appropriate
Poly-L-LysineSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)Gibco by Life Technologies14200-067Dilute to 1x
24-well culture platesBD FALCON//SARSTED734-0020
6-well culture platesSARSTEDT83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAE9644Used 10 ng/mL
Round cover glassMENZEL-GLÄSERMENZCB00120RA020SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743Martor (through VWR)MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tipsVWR732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tipsVWR732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscopeMotic SpainMoticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscopeZEISS Microimaging, GermanyLSM 510 META
10 cm Culture dishBD FALCON353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibodySanta Cruz Biotechnologysc-1694Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488InvitrogenA11008Used 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA14530Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)InvitrogenA12381Used 1:100
Bovine Serum AlbuminSanta Cruz BiotechnologySC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT9284
Skim milkBD DIFCO232100
ImageJNational Institutes of Health, USARelease 1.50i
Zen LSM 510 image processing softwareZEISS Microimaging, GermanyRelease 5.0 SP 1.1

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