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摘要

提出了一种 dCACHE 周质配体结合域的复用过程, 该方法由包涵体化学感受器 Tlp3 和纯化, 产生毫克量的蛋白质.

摘要

chemoreceptors 和结构研究的天然配体的鉴定, 旨在澄清配位特异性的分子基础, 可大大促进了毫克量的纯, 折叠配体结合域的生产。试图 heterologously 表达周质配体结合域的细菌 chemoreceptors 在大肠杆菌 (大肠杆菌) 往往导致他们的目标纳入纳入机构. 本文采用空肠弯曲菌 (周质) 化学感受器 Tlp3 的 dCACHE 配体结合域为例, 提出了从包涵体中提取蛋白质、复性和纯化的方法.该方法涉及的兴趣蛋白的表达与裂解他的6标签, 分离和尿素介导 solubilisation 的包涵体, 蛋白质复用尿素耗竭, 并通过亲和层析纯化,其次是标签去除和大小排除色谱。循环二色谱光谱学用于确认纯蛋白的折叠状态。已经证明, 该协议一般是有用的生产毫克量的 dCACHE 周质配体结合域的其他细菌 chemoreceptors 在可溶性和 crystallisable 的形式。

引言

趋化和运动已被证明在空肠弯曲菌发病机制中发挥重要作用, 通过促进细菌的殖民和入侵主机1,2,3。随着化学信号的引导, 趋化使细菌朝着最佳的生长环境迈进。这个过程包括通过一组称为 chemoreceptors 的蛋白质 (Tlps) 识别细胞内和环境化学线索。大多数 chemoreceptors 是膜嵌入蛋白与 extracytoplasmic 配体结合域 (LBD), 跨膜领域和细胞质信令域, 后者与胞浆信号蛋白相互作用, 传输讯号到鞭毛马达4,5,6,7。

十一种不同的 chemoreceptors 已在C.菌基因组4,8中确定。到目前为止, 只有其中一些 chemoreceptors 的特点和配体特异性的 Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, Tlp1113是已知的。通过生产折叠和高度纯净的重组化学感受器LBDs14、, 可以极大地促进该物种中剩余 chemoreceptors 的天然配体的鉴定, 以及其他细菌中的许多 chemoreceptors.15, 16. 然而, 在大肠杆菌中 heterologously 表达周质 LBDs 细菌 chemoreceptors 的尝试往往导致将其定向到包含机构 17, 18, 19.然而, 这种现象可以方便地分离和恢复现有的蛋白质。本文以周质化学感受器 Tlp3 的 LBD 为例, 提出了一种从包涵体中提取蛋白质、复性和纯化的方法. 之所以选择此示例, 是因为 Tlp3-LBD 属于 dCACHE 家族20 , 这些传感域大量发现在双组分组氨酸激酶和 chemoreceptors 中, 原核生物20, 21,22,23。

在这种方法中, 基于 pET151/D-TOPO 向量的表达式构造被设计为将 N 终端合并为其6标记, 后跟一个烟草蚀刻病毒 (TEV) 蛋白酶解切站点, 用于随后的标记删除19。该协议描述了蛋白在大肠杆菌中的过度表达, 分离和尿素介导的 solubilisation, 以及尿素耗竭的蛋白质复用。在复性后, 用亲和层析法纯化样品, 采用选择性标记去除和粒度排斥层析。用循环二色谱光谱法确定纯化蛋白的折叠状态。这是以前开发的方法的修改版本, 用于恢复和纯化不同化学感受器、幽门螺杆菌TlpC19 的 LBD。此过程在图 1中总结, 产生 10-20 毫克的纯, 未标记的 Tlp3-LBD 每 1 L 细菌培养, 蛋白质纯度 > 90% 按 SDS 页估计。

研究方案

1. 他的6-Tlp3-LBD 在大肠杆菌中的表达

  1. 接种150毫升不育 Luria Bertani (LB) 汤, 含有50µg 毫升-1氨苄西林, BL21 密码子加 (DE3) RIPL 细胞, 用 pET151/D-TOPO 向量变换, 用于表达其6Tlp3-LBD (氨基酸残留 42-291), 并孵化它在37°c 在一个振动筛 (轨道直径, 25 毫米) 与 200 rpm 隔夜。
  2. 准备六2升锥形烧瓶, 含800毫升不育 LB 汤和50µg 毫升-1氨苄西林。接种每瓶20毫升的隔夜文化从步骤1.1 获得。孵化他们在37°c 与连续震动在200转每分钟, 直到光学密度在600毫微米到达0.6。
  3. 从其中一个烧瓶中取一个1毫升的整除 (uninduced 控制样品), 用台式离心机 (1.3万 x g, 4 °c, 10 分钟) 的颗粒, 并丢弃上清。将细菌颗粒贮存在-20 摄氏度, 用于后续的 SDS 页分析。
  4. 通过将1毫米异丙基-β-d (IPTG) 添加到每瓶的培养中, 诱导蛋白表达。继续孵化的烧瓶在37°c 在 200 rpm 的一个额外的4小时。
  5. 以 5000 x g 为15分钟, 在4摄氏度处离心, 并丢弃上清, 以此来收割细胞。
    注意: 在这一点上, 该过程可以暂停, 将细胞颗粒放入一个-80 °c 冷藏库储存。

2. 包涵体的分离和变性

  1. 将步骤1.5 中获得的所有细胞颗粒转移到250毫升烧杯中, 并添加100毫升的缓冲器 a (10 毫米三盐酸, pH 8.0, 150 毫米氯化钠).允许细胞完全解冻 (如果冻结), 并并用重悬颗粒。把样品放在冰上, 除非另有说明。
  2. 通过高压 homogeniser 三倍的悬浮细胞溶解细胞并确保基因组 DNA 的完全剪切。
  3. 离心裂解液在 1万 x g 15 分钟在4摄氏度。收集1毫升的上清 (可溶性分数) 样本, 并将其存储在-20 °c, 用于后续的 SDS 页分析。扔掉剩下的上清, 把小球放在冰上。
    注: 这个小球是白色的颜色 (很容易区分从完整的细胞, 这是褐色的颜色的阴影), 并包含身体。
  4. 并用重悬在20毫升的冰冷缓冲器 B (10 毫米三盐酸 pH 8.0, 0.2 毫米 phenylmethanesulfonyl 氟 (PMSF), 1% 海卫 X-100) 中, 包裹体颗粒彻底。这促进了膜和膜蛋白的 solubilisation。漩涡 1-2 分钟, 以帮助泥沙。
  5. 离心样品在 1万 x g 15 分钟在4°c 和放弃上清。
  6. 并用重悬在20毫升冰冷缓冲器 B 中彻底地将球团涡流 1-2 分钟. 确保颗粒破碎成小块。吸管样品向上和向下, 以帮助颗粒泥沙。
    注: 必须彻底并用重悬颗粒, 以获得不含杂质的包裹体。
  7. 重复步骤2.5。如果上清是多云或有色, 重复步骤2.6 和 2.5 (按顺序), 直到上清是明确和无色。
  8. 并用重悬20毫升冰冷缓冲器 C (10 毫米三盐酸 pH 8.0, 0.2 毫米 PMSF) 的颗粒, 通过涡流管为 1-2 分钟。
  9. 重复步骤2.5。
  10. 加入25毫升冰冷变性缓冲 D (10 毫米三盐酸 pH 8.0, 8 米尿素, 10 毫米 dithiothreitol (德勤), 0.2 毫米 PMSF), 以溶解包裹体颗粒。并用重悬彻底由涡流 1-2 分钟, 或直到颗粒被分解成小块。
  11. 采用轴向旋转的方法将悬浮液混合, 旋转速度为 30 rpm, 在4摄氏度时为 30-120 分钟。
  12. 用离心法澄清变性蛋白溶液的 3万 x g, 4 °c 30 分钟, 将上清液放在冰上并丢弃颗粒。
  13. 使用布拉德福德测定法测定蛋白质浓度。24为 SDS 凝胶分析整除, 并将其放置在-20 摄氏度。
    注意: 在这一点上, 该过程可以暂停的 aliquoted 样品在液氮, 并保持在-80 摄氏度的存储。

3. 蛋白质复用

  1. 在0.4 毫升烧杯中制备250毫升的缓冲 E (3 米尿素, 100 毫米三盐酸 pH 8.0, 20 米精氨酸盐酸盐, 2 毫米还原 l-谷胱甘肽, 500 毫米氧化 l-谷胱甘肽), 冷却缓冲液降至4摄氏度。
  2. 添加60毫克变性蛋白混合物, 其中包含他的6-Tlp3-LBD 在步骤2.13 到250毫升的缓冲 E, 同时搅拌缓冲区在 500 rpm。在4°c 的情况下孵育复混混合物, 连续搅拌 500 rpm, 24-48 小时。此步骤中的最终蛋白质浓度为0.2 毫克 mL-1。
  3. 在 8-10 l 桶中准备 7 l 的缓冲器 A, 并将其冷却到4摄氏度, 以准备下一步 (步骤 3.4), 该步骤将在 24-48 h 中进行 (请参见图 1中的流程图)。
  4. 浸泡50厘米的透析油管28毫米充气直径, 与分子量切断在 12-14 kDa 成200毫升的10毫米乙二胺四乙酸钠盐 (EDTA-Na2) 和加热它在气体火焰, 直到沸腾。用200毫升的 ddH2O 冲洗透析膜。
  5. 将透析膜的一端夹入透析导管闭合, 并将步骤3.2 中获得的250毫升复性混合物转移到透析管中。用另一夹钳关闭开口端。检查膜的完整性, 确保没有泄漏。
  6. 将透析管放在透析桶中, 并在步骤3.3 中准备好缓冲液的预冷7升。放置一个磁力搅拌棒, 确保它不会接触透析油管, 而搅拌。
  7. 透析样品在4°c 与继续搅动在500转每分钟和改变缓冲至少四次在 12 h 期间。最后一个缓冲区更改后, 将该示例留在透析过夜。
    注: 在透析过程中, 尿素 (~ 3 米) 的过量会逐渐从变性蛋白溶液中去除, 从而使蛋白质再折叠餐巾。在透析结束时可以观察到重蛋白沉淀。
  8. 从水桶中取出透析管, 将其内容转移到500毫升烧杯中。在冰上保留蛋白质溶液, 除非另有说明。
  9. 将蛋白质溶液通过0.43 µm 孔径膜过滤成500毫升玻璃瓶, 以除去任何沉淀的蛋白质。

4. 用固定金属离子亲和层析纯化其6标记蛋白

  1. 电荷和平衡5毫升预螯合柱。
    1. 将该列连接到蠕动泵, 确保连接油管中没有空气滞留。
    2. 通过通过 25-50 毫升 ddH2O 来清洗该列。
    3. 通过加载3毫升0.1 米 NiCl2然后通过 ddH2O 的 25 mL, 对该列进行充电。
    4. 平衡柱与25毫升缓冲 F (装载缓冲, 20 毫米三 HCl pH 值 8.0, 500 毫米氯化钠, 20 毫米咪唑)。
  2. 将步骤3.9 中获得的折叠蛋白样品加入2.5 毫升的1米三盐酸 pH 8.0, 25 毫升的5米氯化钠和2.5 毫升的2米咪唑库存溶液, 以此来调节缓冲 F 的组成。
  3. 以5毫升/分或更少的速率将样品装载到柱上, 并丢弃流经 (未绑定的蛋白质)。
  4. 用 50-100 毫升的缓冲 F 清洗柱体, 去除非特异的束缚蛋白, 并丢弃流经。
  5. 洗脱他的 6-Tlp3-LBD 与25毫升的缓冲 G (洗脱缓冲器, 20 毫米三 HCl, 500 毫米氯化钠, 500 毫米咪唑) 和池的流动通过分数包含的蛋白质 (如使用布拉德福德试剂确定).
  6. 使用布拉德福德测定法测定汇集样品中的蛋白质浓度。采取一个小整除为 SDS 页分析和地方在-20 °c。

5. 他的6-标签去除使用 TEV 蛋白酶 (可选)

  1. 准备, 冷却到4摄氏度, 4 升的缓冲 H (TEV 裂解缓冲液, 10 毫米三盐酸 pH 值 8.0, 150 毫米氯化钠, 1% (v/v) 甘油, 2 毫米。
  2. 切开大约 5-7 cm 透析油管 (直径 2-3 cm) 并且浸泡它在200毫升 ddH2O。
  3. 将他的6标记的 TEV 蛋白酶添加到他在步骤4.5 中准备的6标记蛋白质中, 最终摩尔比 1 TEV: 8 蛋白。
  4. 夹紧油管的一端与透析油管闭合, 并填充它与蛋白质/TEV 蛋白酶混合物。关闭另一端, 确保没有泄漏。
  5. 将透析管放入缓冲 H 的预冷4升 (从步骤 5.1), 并在4摄氏度下孵化, 连续搅拌2小时. 改变缓冲和继续透析过夜, 以允许 TEV 介导的裂解反应完成。
  6. 同时, 准备和冷却 (4 °c) 4 升的缓冲 I (10 毫米三盐酸 pH 值 8.0, 150 毫米氯化钠, 1% (v/v) 甘油) 准备第二天。
  7. 在隔夜透析以后, 交换缓冲到缓冲我在步骤5.6 和透析准备了进一步 1-2 h 在4°c。
  8. 从透析桶中取出管子, 松开管的一端, 将蛋白质溶液转移到50毫升的猎鹰管上。过滤解决方案通过0.43 µm 孔径注射器过滤器, 并保持在冰上, 除非另有说明。
  9. 测量样品的体积并调整三个, 氯化钠和咪唑浓度对缓冲 F 的组成 (例如在缓冲器 J 中的25毫升蛋白质溶液中添加0.25 毫升1米三盐酸盐, 1.75 毫升氯化钠, 5 毫升的0.25 米咪唑)。
  10. 按照步骤4.1 中的描述, 准备一个5毫升 HiTrap 螯合 HP 柱。
  11. 将样品装载到柱上 (流速: 5 毫升/分) 并收集流经, 其中含有未加标签的 Tlp3-LBD (残滓 42-291)。Uncleaved 的蛋白质, 他的6标记和他的6-TEV 由列保留。
  12. 用5毫升缓冲 F (加载缓冲器) 冲洗柱, 使所有未加标签的蛋白质都能流经并收集洗脱液。
  13. 在步骤5.11 和5.12 中获得的洗脱液, 并测量蛋白质浓度。采取一个小整除, 并存储在-20 °c 的 SDS 页分析。

6. Tlp3-LBD 的尺寸排除层析 (凝胶过滤)

  1. 准备 1 L 的缓冲 a (10 毫米三盐酸 pH 值 8.0, 150 毫米氯化钠) 和过滤它使用0.43 µm 膜。
  2. 平衡26/60 大小排除列, 缓冲区 a 的流速为4毫升/分钟。
  3. 将步骤5.13 中获得的蛋白质样品浓缩为 3-4 毫升的体积, 使用15毫升离心选矿机, 10 kDa 切断 (4 °c, 4000 x g)。
  4. 通过离心 1.3万 x g, 4 摄氏度, 以30分钟的方式澄清蛋白质溶液, 去除任何沉淀的蛋白质。
  5. 将样品装入预平衡26/60 凝胶过滤柱上。以4毫升/分的流速在缓冲器 a 上进行色谱检测. 监测紫外线痕迹。Tlp3-LBD elutes 210-220 毫升的保留体积。池的峰值分数。
  6. 测量蛋白质浓度。用一个小整除进行 SDS 页分析。

7. 在蛋白质纯化各个阶段收集的样品的 SDS 页分析

  1. 准备 1 L 的 SDS 页运行缓冲 (缓冲 J), 包含25毫米三, 250 毫米甘氨酸 pH 值 8.3, 和 0.1% (w/v) 月桂钠硫酸盐 (SDS)。
  2. 准备10毫升的 5x SDS 页加载缓冲 (缓冲 K), 其中包含0.25 米三盐酸 pH 6.8, 10% (瓦特/v) SDS, 50% (v/v) 甘油, 1 毫米, 和0.05% 溴酚蓝色。
  3. 允许在纯化过程的不同步骤中收集的整除数 (步骤1.3、2.3、2.13、4.6、5.13、6.6) 解冻。
  4. 对于每个样本, 将对应于总蛋白的15µg 的体积与2µL 的 5x SDS 页加载缓冲区混合, 并使用 ddH2O 将卷调整为10µL。
  5. 将样品加热95摄氏度, 5-10 分钟, 在三十年代将它们旋转 1万 x g, 然后将样品转移到干净的管子中。
  6. 用15% 聚丙烯酰胺分离凝胶 (5 毫升: 2.5 毫升 30% (w/v) 双丙烯酰胺, 制备一个 SDS 页凝胶, 1.2 毫升1.5 米三盐酸盐 pH 8.8, 1.2 毫升 ddH2O, 50 µL 10% (w/v) SDS, 50 µL 20% (w/v) 过硫酸铵 (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED)和5% 聚丙烯酰胺堆积凝胶 (2 毫升: 340 µL 30% (w/v) 双丙烯酰胺, 250 µL 1 米三 pH 6.8, 1.37 毫升 ddH2O, 20 µL 10% (w/v) SDS, 20 µL 20% (w/v) ap, 2 µL TEMED)。
  7. 按照制造商的建议, 组装电泳设备并填写 1x SDS 页面运行缓冲区。
  8. 载入步骤7.5 中制备的蛋白质分子量标记和样品。在 25 mA 的恒定电流下进行电泳。
  9. 将凝胶放入容器中, 用 ddH2将其冲洗干净. 添加150毫升的考马斯蓝染色溶液, 含 25% (v/v) 异丙醇, 10% (v/v) 醋酸和 0.03% (瓦特/v) 灿烂的蓝色 R-250。在室温下将容器放置在水平旋转平台上30分钟。
  10. 用 ddH2O 将凝胶冲洗, 放入含有 5% (v/v) 甲醇和 7% (v/v) 乙酸的脱色溶液中。Destain 同时使用水平旋转平台进行1小时的混合。
  11. 图像的凝胶和分析。

8. 循环二色谱 (CD) 折叠纯蛋白二次结构的光谱分析

  1. 将步骤6.6 中获得的 0.5-1 毫克折叠蛋白转移到透析管中, 并将其放置在含有 5 l 的缓冲 l (50 毫米磷酸钠 pH 值 7.4) 的透析桶中, 预换热器到4摄氏度。透析样品在4°c 与连续搅动和执行至少 3-4 缓冲变动在 2-4 h 之前在离开样品到透析过夜。
  2. 使用 10 kDa 离心浓缩器将透析蛋白溶液浓缩为0.06 毫克 mL-1 。
  3. 通过离心在 1.3万 x g, 4 °c 为30分钟澄清溶液。
  4. 使用具有 20 nm 最小-1扫描速率的 spectropolarimeter, 将样本的远紫外 CD 光谱记录在波长范围为 200-260 nm 的25摄氏度。使用透析缓冲区作为空白控件。重复记录, 并生成平均频谱。
  5. 通过使用 CDSSTR 程序从 DichroWeb 服务器25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk) deconvoluting CD 频谱, 计算辅助结构内容。

结果

重组表达他的6-Tlp3-LBD 在大肠杆菌导致蛋白质沉积在包涵体。在步骤2.13 中计算出的细菌培养 1 L 的表达率是其6-Tlp3-LBD 在包涵体中的大约100毫克。这里描述的蛋白质隔离过程和图 1中所说明的, 是通过亲和层析、标记去除和大小排除色谱的方法, 包括包含体的 solubilisation、蛋白质的复用和纯化。, 并产生 10-20 毫克纯, 未加标签的 T...

讨论

本文介绍了细菌化学感受器 Tlp3 周质 LBD 中包涵体的表达和复性的简便方法。纯蛋白的制备涉及在大肠杆菌中对 pET 质粒编码基因的过度表达, 包括体的纯化和 solubilisation, 变性蛋白的复性及其纯化的连续亲和性和尺寸排除色谱步骤。尿素促进变性和稀释/透析介导的复性是该议定书的关键步骤, 最优化往往需要确保适当复存放在包含体的蛋白质26。

Tlp3-LB...

披露声明

作者声明没有竞争的财政利益。

致谢

我们感谢 Tlp3-LBD 的早期工作。Mayra. Machuca 感激 Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS 为博士奖学金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Tris baseAMRESCO497
Sodium chloride (NaCl)MERK MILLIPORE1064041000
AmpicillinG-BIOSCIENCESA051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)MERCK52332
Triton x-100AMRESCO694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDAST0487
UreaAMRESCOVWRC0568
DithiothreitolASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDC-1029
L-arginine monohydrochlorideSIGMA-ALDRICHA5131
Reduced L-glutathioneSIGMA-ALDRICHG4251
Oxidized L-glutathioneSIGMA-ALDRICHG4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)SIGMA-ALDRICH7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)SIGMA-ALDRICH10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)AMRESCOVWRC20302.260
ImidazoleSIGMA-ALDRICHI2399
GlycerolASTRAL SCIENTIFIC PTY LTDBIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2)SIGMA-ALDRICH339350
GlycineAMRESCOVWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS)SIGMA-ALDRICHL4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa)NEW ENGLAND BIOLABSP7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore)MERCKUFC901096
50 mL Falcon tubeFALCONBDAA352070
Dialysis tubingLIVINGSTONE INTERNATIONAL PTYDialysis
Snakeskin dialysis tubingTHERMO SCIENTIFIC™68100
Prepacked HiTrap Chelating HP columnGE HEALTHCARE LIFE SCIENCES17-0408-01
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniserAVESTINEmulsiFlex™ - C5
Peristaltic Pump P-1GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES18-1110-91
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES28989336
JASCO J-815 spectropolarimeterJASCOJ-815

参考文献

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