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摘要

一种简单、多功能、低成本的体外水培系统成功地进行了优化, 使得在无菌条件下进行大规模实验。该系统促进了化学物质在溶液中的应用, 并为分子、生物化学和生理学研究提供了有效的根系吸收。

摘要

植物生物学的广泛研究是利用水培培养进行的。在这项工作中, 提出了一种用于评估植物对化学物质和其他物质的反应的体外培水生长系统。该系统高效地获得了 c3和 c4型拟南芥和狗尾草贝的均匀健康苗。无菌栽培避免了藻类和微生物的污染, 这是植物正常生长和栽培发展的已知限制因素。此外, 该系统具有可伸缩性, 能够大规模地收获植物材料, 具有较小的机械损伤, 而且如果需要, 还能收获植物的各个部分。详细的协议表明, 该系统有一个简单和低成本的组装, 因为它使用吸管架作为种植植物的主平台, 提供。采用拟南芥苗对该系统的可行性进行了验证, 以评价雷帕霉素 (TOR) 激酶靶化学抑制剂 AZD-8055 药物的作用。在根和芽 AZD-8055 治疗后, 早期30分钟有效检测 TOR 抑制。此外, AZD-8055-treated 植物显示预期淀粉过剩表型。我们建议这种水培系统作为植物研究人员的理想方法, 目的是监测植物诱导剂或抑制剂的作用, 以及使用同位素标记化合物评估代谢通量, 一般来说, 需要使用昂贵的试剂。

引言

种植植物使用水培的优势已被广泛认可, 在生产大型和均匀的植物, 使可再生的实验1,2,3。在该系统中, 营养液的组成可以在植物生长发育的各个阶段得到适当的控制和循环利用。此外, 根系不受非生物胁迫, 如土壤生长的植物, 如养分饥饿和缺水4。随着植物的生长培呈现出与土壤中培养的形态和生理特征相当相似的生物, 该系统在研究中得到了广泛的应用, 因为它允许监测根/芽的生长及其收获, 而不伤害2,5。

由于有可能改变营养液的成分和浓度, 大多数使用水培条件的研究已经完成, 以表征微-和营养素1,3 的功能。,6,7,8。然而, 该系统已证明是非常有用的广泛的应用于植物生物学, 如阐明激素和化学物质在植物中的作用。例如, 发现 strigolactones 作为一个新的类激素9和加速生长表型触发 brassinosteroid 应用10是在水培条件下进行的。此外, 该系统还可以进行标记同位素的实验 (例如, 14n/15n 和13CO2)11,12 , 以评估其纳入蛋白质和代谢物通过质谱分析。

考虑到该系统在植物研究中的重要性, 在过去几年中设计了大量的水培技术, 包括使用 (i) 将幼苗从盘子转移到水培容器3的系统, 13;(二) 西斯尔, 限制进入根系发育的早期阶段2、14、15;(iii) 聚乙烯颗粒为浮动体, 使小分子/处理的均匀应用困难16;或 (iv) 植物数量减少9,17。其中许多协议中描述的水培池体积通常很大 (体积从 1-5 升到32升)18, 这使得化学品的应用极为昂贵。虽然很少有研究表明在无菌条件下的水培栽培8,19, 系统的装配通常是相当费力的, 包括完美的调整尼龙网格成塑料或玻璃容器5,8,17,20。

由于拟南芥作为模型植物的重要性, 大多数的水培系统是为这个物种1,2,8,14,18,19,20. 尽管如此, 还有几项研究报告了其他植物的水耕生长特性, 并对种子进行预处理, 以改善它们在体外8、16 的发芽和同步速率..为了进行大规模的工作, 我们制定了一项协议, 建立一个简单和低成本的维修水培系统, 使种植植物的无菌条件, 包括一. 芥和其他物种, 如草狗尾草贝。本方法适用于不同的实验, 因为幼苗生长可以最大化, 同步, 易于监测。此外, 该系统具有以下优点: (一) 其装配简单, 可重复使用;(二) 使不同的化学品易于在液体介质中应用;(iii) 幼苗在培养基中发芽并直接生长, 不需要迁移到水培系统;(iv) 可密切监督苗根发育/生长, 并无损伤地收获幼苗;并且 (v) 它使有可能大规模地工作, 保持生理条件。

研究方案

1. 液体和固态培养基的制备

  1. 用半强力 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基与维生素 [0.0125 毫克/升氯化钴五水合物, 0.0125 毫克/升铜 (ii) 硫酸盐五水, 18.35 毫克/升的 ethylenediaminetetraacetate 铁钠, 3.10 毫克/升硼酸, 0.415 毫克/升的碘化钾, 硫酸锰的8.45 毫克/升, 钼酸钠的0.125 毫克/升, 硫酸锌水合物的4.30 毫克/升, 氯化钙的166.01 毫克/升, 磷酸二氢钾85毫克/升, 950 毫克/升硝酸钾, 硫酸镁90.27 毫克/升, 825 毫克/升的硝酸铵, 1 毫克/升的甘氨酸, 50 毫克/升的肌醇, 0.25 毫克/升的烟酸, 0.25 毫克/升的盐酸哆, 和0.05 毫克/升的盐酸硫胺胺] 补充0.25 克/升的MES, 并调整 pH 值为5.8 与10米 KOH。
  2. 添加10克/升的琼脂, 使一个半强度的 MS 固体培养基。蒸压釜的介质在121°c 20 分钟前使用。

2. 水培系统组装

注: 应严格遵循这些步骤, 建立水培系统。

  1. 材料灭菌
    1. 包装在蒸压袋的吸管尖端机架 (无盖), 将用作 minitanks。蒸气压机架在121°c 20 分钟, 15 psi。
      注: 我们使用的聚丙烯吸管尖架有以下尺寸: 120 毫米 (长) x 89 毫米 (宽) x 55 毫米 (高度)。吸管尖端平坦的表面必须有一个区域, 以增加培养基。其他刀尖架可以使用 (见材料表)。
      注: 在整个水培系统的组装过程中, 有必要使用一个层流罩, 必须在使用前用70% 乙醇清洗和消毒。实验者必须穿上实验室的外衣, 洗手和暴露的皮肤, 用70% 乙醇消毒。手套是可选的, 除了药物应用。
    2. 在进入层流罩之前, 用70% 乙醇清洁所有上面描述的附件 (一次性塑料盒、胶带、吸管、剪刀和镊子)。如果引擎盖允许, 在水培系统的组装之前打开紫外线10分钟, 以保持工作区域被净化。
  2. Minitank 装配
    1. 用胶带封住吸管尖端的上表面 (图 1B)。如有可能, 将其留在紫外线照射下10分钟。
    2. 使用多通道吸管 (图 1C), 在每个井中添加180µL 的熔融固体 MS 培养基 (稍暖)。
      注: 在准备许多坦克时, 使用热板防止 MS 介质凝固。
    3. 允许介质完全凝固 (约30分钟)。
      注: 在凝固期间, UV 光可以打开。
    4. 完全用液体 MS 培养基 (图 1D) 填满吸管尖端架, 确保固体和液体介质之间有密切的接触。
    5. 卸下吸管尖端平面上表面的胶带, 仔细地将其安装在机架上。水培系统现在已经准备好接收被灭菌的种子。

3. 种子杀菌

  1. 在1.5 毫升的微细中放置 500拟南芥种子。根据实验所需的植物数量, 尽可能多地使用管内。
  2. 用70% 乙醇洗净种子, 用温和的搅拌2分钟。让种子安定下来, 然后小心地去除乙醇。
  3. 添加1毫升的10% 次氯酸钠溶液含有2µL 的吐温20洗涤剂。搅动解决方案为5分钟. 仔细删除解决方案。
  4. 用无菌蒸馏水冲洗种子, 直到全部漂白残渣全部清除 (大约 5x)。
    注: 在表面杀菌后, 种子浸泡在无菌蒸馏水中, 在黑暗中分层4摄氏度, 以同步发芽。
    注:狗尾草贝(加入 A10.1) 的种子在浓硫酸中 preincubated 15 分钟 (打破物理休眠), 在无菌蒸馏水中彻底冲洗, 然后用5% 次氯酸钠溶液杀灭。包含0.1% 吐温20为5分钟以温和的鼓动21。其余的灭菌步骤与所描述的拟南芥种子相同。

4. 种子应用

  1. 用一把不育的手术刀, 稍微切开200µL 尖端的肢体。
  2. 将拟南芥种子吸进吸管尖平面上表面的固体培养基中。注意介质不从单位松开;否则, 种子将被着色, 幼苗不会正常生长 (图 1E)。
    注: 对狗尾草种子使用无菌镊子 (胚向上定位)。
  3. 储存尽可能多的 minitanks 在一次性塑料盒内保持高湿度和保持环境免受微生物 (图 1F)。
  4. 用胶带密封一次性塑料盒, 避免污染。
  5. 将水培系统放入生长室中, 适当的生长条件为感兴趣的植物。
    注: 在这项工作中, 使用了以下条件: 75% 的湿度, 150 µmol m-2 s-1的辐照度和春分条件 12 h 光 (21 °c)/12 h 暗 (19 °c) 为拟南芥, 或300µmol m-2 s-1的狗尾草的辐照度和 12 h 光 (28 °c)/12 h 暗 (25 °c) (图 1G和1H)。

5. 验证使用该水培系统抑制雷帕霉素激酶的靶向性

注: 这一水培系统最初是为了促进对植物的化学管理而开发的, 一般来说, 在大型实验中应用是非常昂贵的。作为一个概念的证明, atp 竞争抑制剂 AZD-8055, 这是已知的专门针对 atp 结合部位的 tor 蛋白激酶22, 被用来跟踪抑制 tor 活动的种子, Columbia-0 幼苗 ( 诺丁汉拟南芥股票中心, NASC ID: N22681)。这里简要描述了所使用的协议。

  1. 根据上文所述的气候条件, 将种子培至1.04 级, BBCH23级 (约 11 d)。用含有0.05% 亚砜 (控制)、2µM AZD-8055 (TOR 抑制剂) 稀释的亚砜中的新鲜培养基取代营养液, 或在夜间 (EN) 结束时不进行治疗 (模拟)。
  2. 在治疗后, 在不同的时间点收获一些幼苗, 并将它们分离成根和芽。将样品冷冻在液氮中, 将其研磨成机械磨床中的细粉 (见材料表), 并将粉末贮存在-80 摄氏度, 直至使用。
  3. 应用免疫印迹对40S 核糖体蛋白 S6 (RPS6) 的磷酸化和非磷酸化形式进行了研究。24。
  4. 漂白完整的幼苗为样品脱色, 洗涤他们在蒸馏水, 浸泡他们在碘溶液中5分钟25, 并且相片显微镜的幼苗 (0.63X 目标, 20x 近似, 和7.5x 大小) 为淀粉含量的定性评价。
  5. 在酶降解和释放葡萄糖 spectrophotometrically 的测定后, 将其与 NADP+ 26、27的还原量相耦合, 量化淀粉。
  6. 进行总 RNA 提取、cDNA 合成和定量 rt-pcr 检测, Caldana等。28评估与不同类型的应力相关的基因的表达水平。
  7. 可选, 在类似气候条件下, 在 0.1 L 容量的塑料罐中种植园艺基质的幼苗 [60% 的湿度, 150 µmol m-2 s-1的辐照度, 和春分条件 12 h 光 (21 °c)/12 h 暗 (19 °c)] 为了比较它们与幼苗生长的培。
    注: 用于基因表达测定的靶基因为ABF3 (At4g34000)、 ASN1 (At3g47340) 和TPS5 (At4g17770), 其表达水平采用增量 Ct 法29 ACT2 (At3g18780) 或PDF2 (At4g04890) 作为内部参考基因, 假设100% 的 PCR 放大效率横跨所有样品。用于定量 PCR 的寡核苷酸对: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC;TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG;GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC;AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG;CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) 和PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC;GTTCTCCACAACCGCTTGGT)。

结果

TOR 激酶是一种主要的调节剂, 它集成了营养和能量信号, 促进了所有真核生物的细胞增殖和生长。在植物中阐明 tor 功能的努力包括通过 RNA 干涉或人工 microRNA28、30、31, 产生含有 TOR 条件压制的拟南芥转基因线。考虑到 TOR 击倒植物的胚胎致死表型32,33

讨论

这种优化的培水结构能够成功地培养植物的体外培养。种子在吸管尖端平坦表面的固体培养基上发芽良好, 与种子浸泡在营养液中的系统相比, 有相当大的增益。该系统的一个很好的优点是在幼苗发育过程中, 根直接接触液体培养基, 而不需要迁移。此外, 化学处理可以很容易地应用于液体介质中, 减少体积。湿度保持高, 避免了养分溶液的蒸发和补给。此外, 在幼苗建立过程中, 可以很容易地?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到圣保罗研究基金会 (FAPESP) 的支持;格兰特 12/19561-0) 和普朗克社会。Araújo (FAPEMIG 14/30594), 卡罗莱纳 c. 蒙特卡罗 (FAPESP;赠款 14/10407-3), Valéria 马夫拉 (FAPESP;赠款 14/07918-6) 和薇薇安妮 (海角/CNPEM 24/2013) 感谢研究金。作者感谢 Bourgin (INRA, 凡尔赛, 法国) 的基督教迈耶, 慷慨地为 RPS6 提供抗体。作者感谢室温硫化 UNICAMP 和 Aparecido de 索萨 Manoel 在录音过程中的技术支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolMerck100983
Sodium hypochlorite solutionSigma-Aldrich425044
Polysorbate 20  Sigma-AldrichP2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins Duchefa BiochemieM0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrateDuchefa BiochemieM1503
Agar Sigma-AldrichA7921
Potassium hydroxideSigma-Aldrich484016
Laminar flow hoodTelstarBH-100
HotplateARECF20510011
Growth chamberWeiss TechnikHGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm)Uniglass189.006
200 μL pipette tip racks KasviK8-200-5 *
300 μL multichannel pipetteEppendorf3122000060
300 μL pipette tipsEppendorf30073088
200 μL pipette Eppendorf3120000054
200 μL pipette tipsEppendorf30000870
ScissorsTramontina25912/108
TweezerABC Instrumentos702915
Scalpel bladeSigma-AldrichS2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m)Scotch 3M5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H)Maxipac32771

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