单液滴数字聚合酶链反应对热点地区突变的综合和同步检测

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以准确地量化一个目标区域的多基因变化, 在单一的反应使用下拉 ddPCR 和一个独特的对水解探针。

摘要

液滴数字聚合酶链反应 (ddPCR) 是一种高度敏感的定量聚合酶链反应 (PCR) 方法, 以样品分馏为基础, 以数以千计的纳米水中油的个体反应。最近, ddPCR 已成为循环肿瘤 DNA (ctDNA) 检测最准确、最灵敏的工具之一。标准 ddPCR 技术的主要限制之一是限制数量的突变, 可以筛选每个反应, 因为特定的水解探针承认每个可能的等位基因版本是必需的。另一种方法, 即下拉 ddPCR, 增加了吞吐量, 因为它只需要一双探针来检测和量化目标区域中可能发生的所有基因改变。ddPCR 对常规 ddPCR 的检测具有相当的敏感性, 其优点是在单个反应中发现更多的突变。它是成本效益, 保存宝贵的样品材料, 也可以作为一个发现工具, 当突变是未知的先验。

引言

数以千计的躯体突变与癌症的发展已经报告了¹。其中, 有几个是靶向治疗^2、3的疗效预测指标, 这些突变的基因筛选现在是常规的临床实践。液滴数字 PCR (ddPCR) 技术可用于监测存在或没有突变的高检测精度, 并高度兼容非侵入性液体活检^4,5。然而, 目前的 ddPCR 化验主要是为了检测已知的突变先验。当突变未知时, 这严重限制了 ddPCR 作为发现工具的使用。事实上, 在传统的 ddPCR 设计中, 识别野类等位基因的水解探针与识别突变等位基因 (物探针) 的特定探针竞争 (图 1A)。具有较高亲和性的探针 hybridizes 模板并释放其荧光, 表明相应的等位基因的性质。为每个液滴获得的荧光数据可以在一个散射图中可视化, 表示由物探针在不同尺寸中发射的荧光。在图 1A中, 给出了常规 ddPCR 检测的典型结果的示意图表示法。在本例中, 蓝云对应于含有由小波探针识别的物等位基因的水滴, 而红云对应于由物探针放大和识别的水滴。根据反应中载入的 DNA 数量, 物 amplicons 的双正液滴会出现 (绿云)。浅灰色云对应于空滴。

由于大多数平台允许检测有限数量的显影 (通常为 2, 但高达 5), 常规 ddPCR 的吞吐量是有限的。因此, 针对有多个相邻突变的区域, 需要设计技术上具有挑战性的多重 ddPCR 检测, 或使用针对每种突变的多个反应并行。ddPCR 策略, 克服了这一限制, 因为它可以在一个目标区域内使用一个独特的对小波水解探针来检测任何基因改变。第一探针 (探头 1) 覆盖一个非变量序列, 与目标区域相邻, 第二探针 (探头 2) 与预期的突变目标区域的小波序列互补 (图 1B)。当第一探针量化反应中的 amplifiable 分子总量时, 第二探针通过亚优杂交对突变序列进行物等位基因的鉴别。探针2可以识别目标区域中的多种突变 (单个或多个核苷酸替代、删除等)⁶。与传统的 ddPCR 一样, 浅灰色云对应于不含 DNA 分子的水滴。重要的是要记得, 在这种类型的检测, 最佳分离的重量和物云是取决于数量的 DNA 负载在反应中, 因为含有重量和物目标等位基因的水滴不能区别于只含有重量的水滴形式。因此, 这种化验要求大多数的水滴包含的目标基因不超过一份。

研究方案

这里提出的议定书遵循居里研究所的道德准则。所有的人体样本都是在居里研究所的机构审查委员会批准的研究中获得的, 经知情同意后, 由患者登记。

1. 血液收集、血浆储存和无细胞 DNA 提取

注: 从任何类型的 "组织" 提取的 DNA 可以使用 (如新鲜或甲醛固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织, 细胞在培养或血液样本)。在这里, 我们提供了关于血液收集, 血浆隔离和储存, 和无细胞 DNA (cfDNA) 提取的详细说明。

1. 血液收集和血浆储存 (图 2B)
   1. 收集7毫升 EDTA 管中的血样。建议用两根管子收集大约4毫升的等离子。
   2. 离心管为10分钟在 820 x g以内的3小时的血液绘制, 以分离红细胞 (红细胞), 白血球 (白细胞) 和血浆。取样和离心之间的时间对于获得高质量的 cfDNA (即cfDNA 不受白细胞释放的 DNA 污染) 至关重要。
   3. 仔细吸管上清 (血浆) 使用1毫升吸管不接触白细胞层;大约2毫升血浆通常被恢复每 EDTA 管。
   4. 将等离子传输到2毫升管, 离心机的整除数在 1.6万 x g 10 分钟在15°c, 以去除细胞碎片。
   5. 仔细吸管上清 (血浆) 而不干扰颗粒。将等离子分布在2毫升低温管中, 储存在-80 摄氏度, 直到需要。
2. cfDNA 提取(图 2B)
   注: 在这里, 我们提出了使用手动提取工具包的过程。还可以为 cfDNA 隔离执行制造商说明之后的自动化版本。
   1. 将400µL 蛋白酶 K 放入50毫升管中。添加4毫升血浆 (经常使用的体积) 和3.2 毫升的裂解缓冲 ACL (包含1.0 µg 载波 RNA) 从试剂盒。关闭管和混合涡流三十年代, 以获得一个均匀的解决方案。孵育60°c 30 分钟。
   2. 将7.2 毫升的缓冲 ACB (从试剂盒) 添加到裂解液中, 以优化循环核酸对二氧化硅膜的结合, 并用涡流对15–30进行混合. 在冰上孵化管子5分钟。
   3. 将柱和20毫升扩展器放入真空泵中。关闭未使用的位置以允许真空吸入。
   4. 将裂解-缓冲 ACB 混合物小心地应用到管道扩展器中 (简要离心管收集裂解-缓冲 ACB 混合物的最大值), 在真空泵上切换, 并使裂解物完全通过柱体绘制。卸下并丢弃管道扩展器。
   5. 将缓冲区 ACW1 的600µL 应用于该列。当缓冲区 ACW1 通过该列绘制时, 添加750µL 缓冲 ACW2, 最后添加750µL 乙醇 (96–100%)。然后, 将柱放在干净的2毫升收集管和离心机上全速 (2万 x g), 以3分钟的速度消除乙醇。
   6. 将该列放入一个新的2毫升收集管。打开盖子, 孵育56°c 10 分钟, 完全干燥膜。
   7. 将该列放入一个干净的1.5 毫升 DNA 低结合管。小心地应用36µL RNase 水与0.04% 叠氮化钠 (缓冲大道)。关闭盖子, 在室温下孵育3分钟。
   8. 离心机在全速 (2万 x g) 为1分钟洗脱核酸并且存放在-20 °c 直到需要。
3. cfDNA 量化
   注: cfDNA 量化是与荧光计使用制造商的协议后立即提取或解冻的样品在室温 (RT), 使用前。避免多次冻结/解冻循环。
   1. 根据预期的 cfDNA 量, 采用高灵敏度测定法, 通常少于100毫升血浆。cfDNA 浓度范围从2–10的健康捐献者, 但可以高达100毫升/ml 患者的转移性疾病。
   2. 确保所有试剂在 RT 和混合199µL 的荧光计稀释缓冲器与1µL 染料 (200x) 每反应 (N 数量的样本 + 2 标准校准荧光计), 以获得一个工作解决方案。
   3. 彻底涡旋 cfDNA 溶液, 以确保均匀性和简要离心机收集在管底部的内容。
   4. 将每个 cfDNA 样品的5µL 与工作溶液的195µL 混合。
   5. 混合10µL 的每个标准与190µL 的工作解决方案。
   6. 涡流彻底所有管 2–3 s, 以确保均匀性和简要离心机收集的内容在底部的管。
   7. 在黑暗中孵育2分钟。
   8. 使用 "ng/µL" 输出模式阅读荧光计中的管道
   9. 计算等离子体的最终浓度: ng/µL x 36 (cfDNA 洗脱液的体积)/4 (血浆提取量)。

2. ddPCR 探头和底漆设计 (图 2A)

注: 在 ddPCR 试验中, 靶向分子的扩增遵循类似的 qPCR 原则。每个底漆和探头都是用传统的专用软件 Primer3⁷ (http://primer3.ut.ee/) 设计的。

1. 底漆设计
   1. 在 "常规设置" 窗口中, 将价阳离子的浓度改变为 3.8, "dNTPs" 浓度为 0.8, 并将"mispriming/重复库"转换为正确的有机体。
   2. 在 "提前设置" 窗口中, 将"热力学参数表"和"盐浓度公式"更改为圣卢西亚1998。
   3. 选择 T_m在55和70°c 之间 (以50毫米为盐集中和300毫微米为寡核苷酸集中)。
   4. 使用 PrimerBlast 等工具检查底漆的特异性。
   5. 避免具有二级结构的区域。
   6. 选择具有 50–60% GC 内容的序列。
   7. 避免 Gs 和 Cs 的重复时间超过3个基地。
   8. 在可能的情况下, 选择 3 ' 端的 Gs 和 Cs 的底漆。
   9. 确保 3 ' 两端的配对底漆没有显著的互补性, 以避免底漆脂肪酸。Amplicons 应该小于 150 bp, 以有效地放大 cfDNA (平均大小是 170 bp⁸) 和从 FFPE 提取的 DNA, 这往往是支离破碎的。
2. 探头设计
   注: 水解探针在 5 ' 末端和一个淬火在 3 ' 末端被标记与一个荧光记者。它们提供高特异性, 高信噪比, 如果需要, 允许多路复用。双通道液滴读取器与家族和十六进制或维克染料相兼容, 并分析了多色/十六进制或多维耦合探头。
   1. 设计水解探针, 补充目标区域和相邻非变量区域的小波序列。
   2. 选择位于先前设计的底漆对所定义的扩增子内的探头。底漆序列不能与探针序列重叠, 尽管它们可能彼此相邻。
   3. 选择比 Gs 具有更多 Cs 的链. 探测器必须有 GC 内容30-80%。
   4. 选择长度介于13和30核苷酸之间的探头。较长的探头倾向于显示较高的背景荧光, 因为荧光和淬火之间的距离影响荧光记者的淬火。
   5. 选择探针的 t_m , 比引物的 t_m高3到10°c, 以确保在底漆退火和延伸过程中进行探针水解。建议 t_m增强剂达到所需的 t_m , 同时保持探针短, 因为较短的探针更有效地区分单核苷酸变种。探针不应该有 G 在 5 ' 末端, 因为这止渴荧光信号甚而在水解以后。
   6. 设计下拉式探头如下: 5 '-(维克)-变异区域的互补的小波序列-(MGB NFQ)-3 ' 和参考探针: 5 '-(6)-非可变区域的互补序列-(MGB NFQ)-3 '。其他的记者/淬火的组合也是可能的。

3. ddPCR 反应的优化 (图 2A)

注意: 例如, 在这个步骤中使用的野生类型和突变 DNA 控制可以从细胞系、肿瘤样本或商业上获得的 dna 参考标准中获得。

1. 使用热梯度特征对热循环仪进行常规 pcr, 验证所设计的引物所放大的 pcr 产物的特异性。
   1. 准备一个独特的 PCR 反应组合, 如下面的步骤 4.1 (没有探针) 在野生类型的 DNA 控制模板, 至少有8的反应, 每一个温度最少的反应。
   2. 使用步骤4.3.2 中描述的程序运行放大, 以及围绕引物的理论退火温度的一系列退火温度。
   3. 负载 PCR 产品的3% 琼脂糖凝胶, 以选择退火温度提供特定的产品。
2. 使用上面描述的参数执行一系列的下拉 ddPCRs, 但这次包括两个探头。
   1. 使用100% 的 dna, 100% 物 dna 和物 dna (例如50% MUT/50%wt) 的混合物, 以确定清晰分离和物雾滴云的最佳条件。
   2. 选择在步骤4.1 中选择的温度以上的退火温度范围。
   3. 选择退火温度, 允许特定检测的物信号时, 使用100% 的 dna 或100% 物 dna, 最好的分离和物雾滴云。
   4. 退火时间和底漆/探针浓度也可以进行调整, 以改善云的分离和减少的水滴与中间荧光 (雨效应) 的数量。
3. 评估试验的空白 (LOB) 的背景或限制。
   1. 使用3.2 中选择的退火参数和引物/探针浓度, 至少执行48个单独的降 ddPCR 反应, 并采用控制 DNA。
   2. 对于每个反应, 计算突变的等位基因频率 (农林) 如下: (突变滴数/填充液滴数) x 100。
      注: LOB 被定义为假阳性的平均和关联 SD, 95% 置信区间 (95% CI) 被计算出来。LOB = (假阳性的平均值) + 95% CI。
4. 评估检测的限度 (LOD)。
   1. 使用物 dna 序列稀释在 ddPCR 中进行脱落反应, MAFs 范围从5% 到 0.01% (每种情况下≥8个)。使用退火参数和引物/探针浓度选择在3.2。
      注意: LOD 被定义为最小的农林值, 用于复制当前平均值和 LOB 上方的 SD (见 Decraene等。⁶有关详细信息)。

4. ddPCR 协议 (图 2B)

注: 与常规 ddPCR 类似, 下拉 ddPCR 协议包括4步骤: (i) pcr 混合制剂, (ii) 雾滴生成, (iii) pcr 扩增和 (iv) 数据采集。

1. PCR 混合制剂
   1. 遵循标准的预防措施, 如戴手套, 使用干净的 PCR 罩, 清洁吸管, 和 RNase, DNase 无水的蒸馏水, 以避免污染。
   2. 在 RT 中解冻和平衡反应成分。
   3. 在蒸馏水中准备20x 引物/探针混合, 每个底漆在18µM, 探头在5µM。
   4. 对于所有个别 PCR 反应, 准备一个样本组合, 结合 2x ddPCR supermix (10 ul), 1 µL 20x 引物/探针混合和多达 10 ng DNA 样本qsp 20 µL 的蒸馏水。
   5. 涡流反应混合, 以确保均匀性和简要离心机收集的内容在底部的管配药前。在使用前, 请不要犹豫对每个反应组合重复此步骤。
2. 水滴生成
   1. 将 ddPCR 墨盒插入托架中, 并将含有样品的反应混合物的 20 ul 载入到墨盒的中间井中, 以用于产生水滴 (图 2B中的绿色位置), 使用8通道吸管。
   2. 将雾滴发生器油的 70 ul 添加到井底井中 (黄色位置)。
   3. 在液滴发生器中插入带垫圈的墨盒;水滴将产生在顶部油井的墨盒 (蓝色位置)。
   4. 吸入和分配缓慢和轻轻 (避免剪切) 40 ul 的水滴从墨盒成一个96井 PCR 板。使用多通道吸管来优化水滴的转移。
3. PCR 扩增
   1. 在转移水滴后立即用铝箔封住最终的 PCR 板, 以避免蒸发。简要地离心板在井的底部收集内容。
   2. 使用以下程序在热循环仪上运行常规 PCR 放大:95 °c 10 分钟, 40 个周期 [94 °c 三十年代, 经验证的退火 T°六十年代], 98 °c 10 分钟 (坡道 2.5°C/秒)。在每次运行中包括没有输入 dna 和野生类型 dna (≥3复制) 的控件。
   3. 当运行完成后, 简要的离心板, 以收集的内容在井底。
4. 数据采集
   1. pcr 放大后, 根据制造商的指示, 使用滴读器计数 pcr 阳性和 pcr-阴性滴。
      注: 液滴读取器通常提供双色光学检测系统, 与显影、维克或十六进制的兼容。

5. 数据分析 (图 2C和图 3)

注: pcr 阳性和 pcr-负滴被计算为在靶区的物和超等位基因提供绝对量化。所分配的水滴用于计算每个井中的农林。水滴定量和分析的脱落化验可以使用 ddPCR R 包 (https://github.com/daattali/ddpcr) 开发的雅克阿塔利和同事^9,10。此 R 包自动将水滴归类为空的, 部分的 "雨" (由于低效放大), 或充满了一个真正的正面信号 (图 3)。下面一节介绍分析的不同步骤是作者编写的算法的描述性插图的简短版本 (参见 https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/算法。Rmd 了解更多详情)。数据导出为逗号分隔值文件 (FileName_Amplitude), 并将其上载到 ddPCR 包中, 以便直接在 R 或通过专用 web 界面进行分析。

1. 参数调整
   注: 每一个跌落试验设计结果在特定的最终水滴分布和变化的云形式, 分离或立场是预期的。为了确保高效的自动化分析, 需要对一组参数进行调整。如果一个井有一个意外的配置文件, 它可能导致整个板块的分析失败, 导致错误信息。问题的井将必须被辨认并且从自动分析被去除。
   1. 使用 (REMOVE_FAILURES) 识别故障井。使用 TOTAL_DROPS_T (默认值为 5000) 可以调整每个井中的最小水滴数。使用 EMPTY_LAMBDA_LOW_T (默认值为 0.3) 和 EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (默认值为 0.99), 以调整评估预期的雾滴云 (空、物、小波) 及其质量的度量标准。
      注: 有太多的空滴是一个迹象表明, 没有足够的 amplifiable 模板在反应。
   2. 使用 (REMOVE_OUTLIERS) 识别异常滴。使用 TOP_PERCENT (默认值为 p = 1%), 以在整个板块中, 在每个信号维度 (FAM、维克/十六进制) 中, 调整具有最高信号值的水滴的最高 p 百分比。使用 CUTOFF_IQR (默认值为 5) 可调整最高信号最大 p 百分比的异常阈值。
   3. 使用 (REMOVE_EMPTY) 识别空滴。使用 CUTOFF_SD (缺省为 7) 调整探头1值的低 (空水滴) 高斯分布的标准偏差。
   4. 门滴使用 (分类)。使用 CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (缺省为 3) 调整探头1值的较高 (填充液滴) 高斯分布的标准偏差。使用 ADJUST_BW_MIN (缺省值为 4) 和 ADJUST_BW_MAX (默认值为 20) 调整 k_min 和 k_max 参数, 以估计探针2值的核密度, 并判别水滴的物和小波云。
      1. 使用 SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (默认值为 p=1%) 和 SIGNIFICANT_P_VALUE (默认值级别 s = 0.01%) 将井分类为突变体或 wildtype。
         注意: 在这个算法中, 一个突变体被定义为有一个在统计学上显著高于 p% 的农林。
2. 自动化分析
   注意: 对于本节中介绍的每个参数, ddPCR R 包的作者根据其专门知识及其数据提出了默认值。但是, 可以修改所有参数以提高分析的质量 (图 3)。
   1. 识别失败的油井。
      1. 使用四质量控制指标 (设置: REMOVE_FAILURES) 来识别失败的油井;第一个是一个井应该包含的最小滴数。另外三的重点是为空的, 可能是家族 + 和十六进制 +/维克 + 水滴的有效候选群体。从下游分析中删除无法满足这些标准的油井。
   2. 识别异常滴。
      1. 为了避免倾斜滴浇口, 通过设置上边界阈值 (设置: REMOVE_OUTLIERS), 从进一步分析中移除异常高度 (即具有异常高的十六进制/VIC 或 FAM 值的水滴)。
   3. 识别空滴。
      1. 识别空水滴以减少数据的维数 (在典型的井中, 它们将占去大部分的水滴), 并消除由于存在大量无用信息而导致的统计偏差, 因为只有包含模板的水滴才存在 (设置: REMOVE_EMPTY)。
   4. 执行液滴浇口。
      1. 将剩余的水滴归类为突变体、wildtype 或降雨 (设置: 分类)。
   5. 识别雨滴。
      1. 由于雨滴的效果是低效的放大, 排除了从家族 + 或十六进制 +/维克 + 云。使用探测器1值确定其簇的边框 (设置: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD)。
   6. 识别突变体与野型水滴。
      1. 由于分析的重点是突变体和 wildtype 模板之间的区别, 所以在这个阶段将所有剩余的水滴识别为二者之一。因为他们应该有相似的探针1值, 使用探针2价值最佳地预测他们各自的自然 (设置: ADJUST_BW_MIN 并且 ADJUST_BW_MAX)。
   7. 将水井分类为突变体与野生型。
      1. 在确定了物和重量的水滴后, 计算出颗粒。利用每个井的突变频率和相关 p 值, 可以对它们进行分类 (设置: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) 为小波 (包含主要的水滴) 或物井 (包含统计学上相当数量的物水滴)。
3. 浏览和导出数据
   1. 探索和导出数据的数量的水滴, 异常点, 空的水滴, 浓度或图表, 可进一步定制的最佳表示。

结果

在一项概念验证研究中, KRAS外显子2突变 (密码子12和 13) 和EGFR子外显子的19删除被调查的 FFPE 组织和血浆样本从癌症患者使用的辍学 ddPCR 战略⁶。

KRAS下降探针询问了一个 16 bp 区域包含多基因突变的KRAS基因的外显子 2, 其中的95% 的已知KRAS突变在人类癌症¹¹。参...

讨论

为了设计一种高效的降 ddPCR 检测方法, 优化是至关重要的, 必须严格遵循该协议。引物和探针的每个组合都具有独特的 PCR 反应效率。因此, 在对有价值的测试样品使用之前, 必须对对照样品进行仔细的验证。优化和验证是保证峰值信号检测和评估特异性和灵敏度的重要因素。如《议定书》所述, "探测 2" 所涵盖的目标区域内的所有突变都可能被审问。尽管如此, 建议对位于 "探针 2" 的 5 ' 或 3 ' 端点?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer