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摘要

在这里, 我们提出了一个分离健康和功能的原发性小鼠肝细胞的协议。通过非放射性标记基底检测肝新生蛋白合成的说明, 帮助了解肝脏能量代谢稳态背景下蛋白质合成的机理。

摘要

肝细胞是肝脏的实质细胞, 参与多种代谢功能, 包括蛋白质的合成和分泌对系统能量稳态至关重要。从小鼠肝脏分离的原发性肝细胞构成了一个重要的生物工具来了解肝脏的功能特性或变化。本文介绍了一种通过两步胶原酶灌注技术分离和培养原发性小鼠肝细胞的方法, 并讨论了其在蛋白质代谢研究中的应用。成年小鼠肝脏依次用乙二醇-双四乙酸酸 (EGTA) 和胶原酶灌流, 其次是肝细胞与密度梯度缓冲液的分离。这些分离的肝细胞在培养板上是可行的, 并保持肝细胞的大部分赋存特征。这些肝细胞可用于评估蛋白质新陈代谢, 包括新生的蛋白质合成与非放射性试剂。我们表明, 分离的肝细胞是易于控制, 并包含更高的质量和体积稳定性与能量代谢相关的蛋白质合成, 利用化疗选择性结扎反应与四甲基罗丹明 (塔姆拉) 蛋白检测方法和西方印迹分析。因此, 该方法对研究与能量稳态有关的肝新生蛋白合成具有重要意义。下面的协议概述了分离高质量原代小鼠肝细胞和检测新生蛋白质合成的材料和方法。

引言

蛋白质是一个重要的营养元素, 人体干重的大约50% 是由具有多种生物学特性和功能的蛋白质组成的1。因此, 蛋白质合成是最消耗能量的事件之一, 蛋白质代谢的改变与疾病的发展密切相关, 包括代谢疾病2,3,4。在肝脏中, 蛋白质生物合成占总能量消耗的大约 20–30%5,6。此外, 蛋白质不仅作用于肝脏的被动或构建块, 而且还有主动信号调解因子潜伏或给予调节系统代谢7。例如, 血清白蛋白的水平降低, 由肝脏合成和分泌, 血浆中最丰富的蛋白质8, 增加2型糖尿病发展的风险9,10, 11, 而更高浓度的血清白蛋白是预防发展代谢综合征12。此外, 干扰或中断分泌或膜束缚肝蛋白, 调节胆固醇稳态, 包括脂蛋白, LDLR, 和 LRP1, 可能导致胰岛素抵抗, 高脂血症, 或动脉粥样硬化的发展13. 因此, 鉴定肝脏蛋白质代谢紊乱中涉及的分子病理生理学机制及其相关代谢并发症可能有助于发现新的药理学延缓发病或治疗代谢性疾病的方法, 如胰岛素抵抗、糖尿病和无酒精脂肪肝。

蛋白质合成与细胞能量状态密切相关 (例如, 在蛋白质合成的伸长步骤中形成一个肽键, 需要4磷酸二酯键14), 并通过分子通路来调节细胞间和内营养的可用性15,16。AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 是维持能量稳态17的细胞内能量传感器之一。一旦 AMPK 被激活时, 细胞能量水平变得较低, AMPK 及其靶向基底功能刺激分解代谢通路和抑制合成代谢过程, 包括蛋白质合成18,19。蛋白质合成的调节通过多种转化因子和核糖体蛋白的磷酸化介导20。值得注意的是, 雷帕霉素复合物 1 (mTORC1) 的哺乳动物靶点是蛋白质合成的主要驱动力, 是 AMPK21的主要靶点之一。激活 mTORC1 通路通过刺激蛋白质转化和自噬20,21提高细胞生长和增殖。因此, AMPK 活化能抑制 mTORC1-mediated 蛋白合成22是合乎逻辑的。事实上, 激活 AMPK 抵消和直接 phosphorylates mTORC1 对苏氨酸残留 2446 (2446) 导致其失活23和抑制蛋白质生物合成24。此外, AMPK 可以间接抑制 mTORC1 功能的磷酸化和活化的结节性硬化复合 2 (TSC2)25是 mTORC1 信号级联的上游调节器。简而言之, 这些途径在肝脏中的失调经常与代谢疾病的发展有关, 因此迫切需要建立有效的实验工具来研究这些途径在调节能源和肝细胞蛋白质代谢。

分离的原发性肝细胞和体内肝细胞的功能特性与体外肝细胞系26、27、28之间有较强的相似性。结果表明, 原代人肝细胞与肝活检有77% 相似之处, 而 HepG2 细胞是分化良好的肝癌细胞, 广泛用于研究肝功能, 在其背景下显示小于48%。基因表达谱29。因此, 利用原发性肝细胞, 而不是永生化培养细胞, 对肝脏功能和生理研究具有重要意义, 并可用于原代肝细胞的分离与培养。特别是从大鼠30,31。虽然大鼠肝细胞是有用的在一个相对较高的产量, 小鼠肝细胞在许多科学方面有更大的潜力, 因为转基因小鼠的广泛可用性。然而, 从小鼠分离健康和丰富的原发性肝细胞的细胞和分子的评估有几个技术挑战: 首先, 套管插入灌注肝用缓冲试剂是非常困难的处理由于小而薄小鼠门静脉或下腔静脉;其次, 在分离过程中, 细胞的操作时间越长, 细胞数量和质量就会降低;第三, 非酶机械分离方法可能导致严重的损伤, 并产生低产量的存活的分离原代肝细胞32,33。在二十世纪八十年代, 采用胶原酶灌注技术, 从动物肝脏中分离肝细胞34。这种方法是基于胶原酶灌注肝35、36、37、肝灌注钙螯合剂溶液38、39、酶消化和肝实质的机械解离35。在第一步, 小鼠肝脏灌流与钙 [ca2 +] 免费缓冲区包含 [ca2 +] 螯合剂 (乙二胺四乙酸酸, EDTA)。第二步, 小鼠肝脏灌入含有胶原酶的缓冲液, 以水解细胞外基质的相互作用。与第一步中使用的缓冲液不同, 在第二步的缓冲液中存在 [Ca2 +] 离子是有效的胶原酶活性所必需的, 之后消化的肝脏必须进一步轻柔地与机械分离, 使用钳肝囊和薄壁组织。最后, 通过过滤去除结缔组织, 随后离心分离非实质细胞和非活体肝细胞的可行肝细胞与使用密度梯度缓冲液40,41 ,42。在本研究中, 我们展示了一种改良的两步法胶原酶灌注技术, 用于分离小鼠肝脏的原代肝细胞, 用于蛋白质合成分析。

蛋白质的简単被广泛用于量化的表达水平, 更替率, 并确定蛋白质的生物分布43由于高灵敏度的放射性检测44。然而, 使用放射性同位素需要高度控制的研究环境和程序45。替代性的非放射性方法已得到发展, 越来越受到欢迎。四甲基罗丹明 (塔姆拉) 蛋白检测方法的化疗选择性结扎反应是其中之一, 是基于叠氮化物和炔烃基团之间的化学选择性反应46, 可用于分析细胞事件, 如检测新生蛋白合成和用叠氮化物组修饰的糖蛋白子类。对于新生的蛋白质合成, l-Azidohomoalanine (l-AHA, 一种叠氮化物改性氨基酸) 可以代谢纳入蛋白质和检测通过使用塔姆拉蛋白检测方法47。通过在原代小鼠肝细胞中使用这种检测方法, 我们表明, 新生的蛋白质合成速率与线粒体和 AMPK 活化 ATP 的可用性密切相关 (图 1)。

总之, 利用主鼠肝细胞是研究蛋白质和能量代谢和量化新生蛋白质合成的重要因素, 这对于深入了解与发展相关的通路的生理作用是有价值的。肝细胞相关疾病的治疗。

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研究方案

本协议包含实验室小鼠的使用。动物护理和实验程序是按照辛辛那提儿童医院医疗中心动物保育委员会批准的程序进行的。

1. 原代小鼠肝细胞的分离

  1. 预隔离准备
    1. 如表 1所述, 准备450毫升40% 密度梯度缓冲器, 保持在4摄氏度 (15 mL/鼠标)。
    2. 准备500毫升威廉姆斯的培养基, 如表 1所述, 保持在4摄氏度。
    3. 准备500毫升的 DMEM 如表 1所述, 并保持在冰 (30 毫升/鼠标)。
    4. 准备500毫升的 HBSS (-) 缓冲区, 如表 1所述, 并保持在42摄氏度在水浴 (40 毫升/鼠标)。
    5. 准备500毫升的 HBSS (+) 缓冲液与0.3 毫克/毫升胶原酶类型 X 如表 1中所述, 30 分钟孵育在42摄氏度在水浴 (40 毫升/鼠标)。
    6. 通过在闭锁脚踏板上放置静脉注射 (i. V) 管, 并检查无气泡冲洗液的流动, 设置灌注泵。
    7. 加热管加热器在 42摄氏度。
    8. 将离心机冷却至4摄氏度。
  2. 麻醉和灌注
    1. 清洁工作区域和泵。
    2. 用70% 乙醇彻底冲洗泵连接的 IV 管10分钟。
    3. 用 DDW 完全冲洗10分钟, 从泵连接的 IV 管中除去残余乙醇。
    4. 用70% 乙醇擦拭剪刀和镊子。
    5. 将鼠标放在塑料容器中, 网格底部和2毫升异氟醚浸泡纱布在网格下方, 以避免直接接触。
    6. 通过踏板反射 (坚定的脚趾捏) 的麻醉深度。
    7. 当鼠标到达所需的麻醉深度时, 将其取出。
      注: 麻醉的诱导时间不应超过1分钟。
    8. 使用15毫升锥形管, 用1毫升异氟醚浸泡垫推到管子末端, 构造一个鼻锥。
    9. 通过移动鼻锥靠近或远离鼠标鼻孔控制麻醉深度。
    10. 将鼠标放在工作平台上, 腹侧朝上。
    11. 喷雾70% 乙醇在鼠标的腹部, 然后打开腹腔通过使用锋利的剪刀和齿钳进行大横切口真皮和腹膜。
    12. 然后, 垂直切割腹部层, 直到所有腹部器官完全暴露通过使用锋利的剪刀和齿钳。
    13. 将小和大的肠道向鼠标左侧移动, 用蒸压棉尖端, 直到肝脏、门静脉和下腔静脉 (IVC) 明显暴露。
    14. 将 24 G 导管插入静脉腔中, 只需在与右肾静脉的分岔处仔细, 无需握手即可避免静脉和出血的损伤。
      注意: 如果出血发生, 当你插入导尿管进入静脉, 然后你应该尝试插入新导管到门静脉。
    15. 取出导管的针头并控制套管的位置, 以避免脱离静脉, 然后使用连接器连接 24 G 套管与灌注管。
      注意: 在开始灌注之前, 避免出现气泡。
    16. 以温暖的 HBSS (-) 以4毫升/分钟的流速开始肝脏灌注, 用剪刀快速切断脾静脉以排出体内血液。
      注意: 如果插管成功, 肝脏将开始漂白由于缓冲区的回流分布从静脉到肝静脉。门静脉由脾和肠系膜上静脉联合形成;因此, 它是相当安全的切除脾静脉, 因为它是大和远端从肝脏。
    17. 继续灌注35毫升温暖 HBSS (-)。
      注意: 如果灌注足够, 肝脏将变得苍白, 并且在这个阶段麻醉下的老鼠仍然活着。
  3. 消化和萃取
    1. 灌注鼠肝与温暖的35毫升的 HBSS (+), 包括胶原酶类型 X 在流速4毫升/分钟。
    2. 每隔几分钟, 用镊子固定脾静脉到十年代, 使整个 HBSS (+) 的体积扩散到肝脏的所有解剖部分。
      注: 由于缓冲堵塞导致脾静脉夹紧, 肝脏开始肿胀。
    3. 在灌注过程结束时, 将5毫升准备好的温热 HBSS (+) 与胶原酶 X 注入 100 mm 培养皿中。
    4. 在停止泵以避免血液回流到肝脏、用钳子除去胆囊, 然后用纸巾轻轻擦拭肝脏以除去血液后, 切断从身体其余部分灌注的肝脏。
    5. 将肝脏转移到含有5毫升准备好的温热 HBSS (+) 的培养皿中, 用直尖钳轻轻取出肝脏胶囊。
      注: 肝脏胶囊是围绕肝脏的结缔组织的薄层。
    6. 使用镊子仔细地分散实质组织。在培养皿中加入15毫升冷 DMEM。
      注: 如果肝脏消化良好, 培养基会因实质细胞而变多云。
    7. 轻轻摇动撕裂的肝脏, 将残余的实质细胞释放到培养基中, 再添加15毫升冷 DMEM 到培养皿中, 以获得细胞的其余部分。
    8. 通过100微米细胞过滤器将 DMEM 与溶解肝脏转移到50毫升锥形管中, 并保持在冰中。
  4. 净化
    1. 离心细胞悬浮液在 60 x g 2 分钟在4摄氏度, 小心地去除上清通过真空吸入和重悬的球团在10毫升 DMEM。
    2. 将重悬颗粒添加为40% 密度梯度缓冲液顶部的薄层, 在 800 x g处离心10分钟, 无刹车 4摄氏度。
    3. 小心移除上层 (DMEM) 和中间层 (死亡或非实质细胞), 但不包括下层 (颗粒: 原发性实质肝细胞)。
    4. 重悬的主要细胞与的的的的的中和威廉毫升威廉的中等 E, 并转移到新的50毫升管, 以避免在管壁上的死细胞的污染。
    5. 加入7-8 毫升威廉的中等 E, 轻轻混合, 离心在 800 x g 1 分钟, 在4摄氏度。
    6. 小心地删除上清的真空吸, 然后再次重悬颗粒与 10, 20 或30毫升威廉的中等 E (根据颗粒的大小)。
    7. 使用自动单元格计数器对单元格进行计数。
    8. 种子与威廉的培养基 E, 保持板在一个孵化器在 37摄氏度为2-3 小时, 然后取代中等 with10%fbs DMEM 培养基与抗反移除死或未独立的细胞和过夜孵育在37摄氏度。
    9. 第二天, 主鼠肝细胞已准备好进行实验使用。

2. 化学选择性结扎反应法检测新生蛋白合成

  1. 新陈代谢标签
    1. (前处理)用37摄氏度的热 PBS 洗涤原代肝细胞, 并添加无蛋氨酸 DMEM 培养基30分钟, 以消耗细胞质蛋氨酸储量。
      注意: l-Azidohomoalanine, 是一种氨基酸和模拟到蛋氨酸, 包含一个叠氮基团, 可以在细胞蛋白质合成过程中纳入蛋白质, 使细胞质蛋氨酸的耗尽将提高喂养和合并Azidohomoalanine 对原代肝细胞新合成蛋白的研究。
    2. 治疗洗涤原代肝细胞37摄氏度温暖 PBS 两次, 并添加无蛋氨酸 DMEM 培养基与25微米哈 (l-Azidohomoalanine) 为 4–6 h。
    3. 添加任何特定的化学物质 (即10 微米鱼藤酮) 在培养基中为 4–6 h 在 AHA 的存在, 以调查其对新生蛋白表达水平的影响。
    4. 孵育后, 用真空吸除培养基, 用冷 PBS 洗涤原肝细胞三次。
    5. 加入200微升裂解缓冲液到板上, 在冰上孵育15-30 分钟, 然后倾斜板, 将整个细胞裂解物转化为1.7 毫升管。
      注意: 你应该观察细胞裂解液在细胞采集过程中非常黏稠。
    6. 通过使用探针超声仪溶解蛋白质和分散 DNA, 在冰上油脂实验细胞裂解物 5 s 三倍。
    7. 涡旋细胞裂解液5分钟, 在 21130 x g 离心细胞裂解物10分钟, 在 4 oC, 然后将清上清液转移到一个新的管。测量蛋白质浓度两次。
      注意: 在这个阶段, 蛋白质样品可以储存在-20 摄氏度, 如果他们不立即使用。
  2. 对叠氮化物修饰的新生蛋白进行标记
    1. 通过向组件 (B) 添加60微升组件 (a) 来准备组件 (a + B)。
      注: 在将组件 (A) 添加到 (B) 后, 该解决方案会在颜色中变为亮粉色。
    2. 根据协议准备缓冲区 (D) 和 (E)。
    3. 服用20–40微克细胞裂解液, 加入50微升2x 反应缓冲器 (组件 A + B), 然后通过增加 5 s 的 DDW 和涡旋来调节体积至80微升。
    4. 添加5微升 CuSO4 (组件 C), 涡旋为 5 s。
    5. 加入5微升反应缓冲添加剂 1 (刚准备好的组件 D), 然后涡旋5秒, 等待3分钟。
    6. 添加10微升重组反应缓冲添加剂 2 (组件 E), 然后涡流 5 s 和旋转样品20分钟在4°c 通过使用多回转机。
      注: 在添加组件 (E) 后, 解决方案在颜色中变为亮橙色。在旋转过程中, 样品应受到保护。
    7. 加入300微升甲醇和涡旋 5 s, 加入75微升氯仿和涡旋 5 s, 然后添加200微升 DDW 和涡旋 5 s。
    8. 在 21130 x g 和 4摄氏度离心样品5分钟, 然后丢弃水上清液并保持颗粒。
    9. 添加250微升甲醇到管, 涡旋, 再旋转5分钟在 21130 x g.
    10. 丢弃上清液, 然后用无绒毛组织覆盖样品, 使颗粒在室温下风干15分钟。
  3. 页面分析和西方印迹
    1. 溶解在20微升的加载缓冲液中的颗粒,没有β巯基乙醇, 涡10分钟, 热量在70摄氏度通过使用热块10分钟。然后将样品装入 10% SDS 凝胶 (1.5 mm), 用于四甲基罗丹明 (塔姆拉) 检测。
    2. 使用可变模式激光扫描仪检测 AHA 信号, 以精确定量新生蛋白质。
    3. 用 DDW 洗涤凝胶15分钟。
    4. 然后, 染色 10% SDS 凝胶与快速和灵敏的考马斯染料试剂15–60分钟检测总蛋白作为一个控制。
    5. 利用紫外荧光成像仪对 DDW 的凝胶进行脱污, 获得图像。

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结果

主要的小鼠肝细胞隔离导致约 20 x 106总细胞/小鼠的产量。组织学, 活体和附着的原代肝细胞出现多边形或典型的六角形与明确概述的膜边界后24小时孵育 (图 2)。

为了证实孤立细胞是否为原代肝脏, 我们比较了分离的原代小鼠肝细胞 (PMHs)、小鼠胚胎成纤维细胞 (MEFs)、小鼠肝癌细胞系 (Hepa 1-6) 和小?...

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讨论

虽然一些永生化的肝细胞系已经提出并用于调查肝功能49,50,51,52, 这些细胞一般缺乏重要的和基本的正常肝细胞的功能, 如白蛋白的表达 (图 3)。因此, 人们普遍认为, 利用原发性肝细胞是检查肝脏生理学和文化新陈代谢的一个有价值的选择, 尽管这些细胞的培养和维护的挑战。在?...

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披露声明

作者表示他们没有利益冲突。

致谢

我们感谢 Drs Joonbae Seo 和维薇安的科学投入和讨论。这项工作得到了国家卫生研究院 (NIH) (R01DK107530) 的支持。T.N. 得到日本科技署的支持。这项研究的一部分是由 NIH (P30DK078392) 为辛辛那提的消化系统疾病研究核心中心提供资助的。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
HEPES bufferFisher ScientificBP310-500
D-glucoseFisher ScientificD16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acidAmericanBioAB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol redGibco14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)Fisher ScientificC79-500
Density gradient bufferGE Healthcare17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvateGibco11885-084
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x)Gibco1897141
Williams medium E, no glutamineGibco12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplementGibco35050-061
Collagenase Type XWako Pure Chemical Industries039-17864
Perfusion pumpCole-ParmerMasterflex L/SEquipment
IV administration setEXELINT29081Equipment
A water bathREVSCIRS-PB-200Equipment
Tube heaterFisher ScientificIsotempEquipment
EthanolDecon Lab, Inc0-39613
IsofluranePHOENIX10250
Autoclaved Cotton TipsFisherbrand23-400-124
100 mm Petri DishTPP93100
Connector (Male Luer Lock Ring)Cole-Parmer instrumentEW-4551807
24 G cathetersTERUMOSurflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS)VWR10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNEInvitrogenC33370
AHA (L-azidohomoalanine)InvitrogenC10102
DMEM (methionine free)Gibco21013024
L-Cystine DihydrochlorideSIGMAC2526
Laemmli sample bufferBioRad161-0737
Protease Inhibitor CocktailSIGMAP9599
SDS solution (20%)BioRad161-0418
Tris-HCL (1M)American BioanalyticalAB14044-01000
Phosphatase Inhibitor CocktailSIGMAP5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)BioRad500-0207
6-well tissue culture plateTPP92006
Digital HeatblockVWR12621-092Equipment
Multi-RotatorGrant-bioPTR-60Equipment
Ultrasonic SonicatorCole-ParmerGE130PBEquipment
Standard Heavy-Duty Vortex MixerVWR97043-566Equipment
A variable mode laser scannerGE Healthcare Life ScienceFLA 9500Equipment
Coomassie-dye reagentThermo Scientific24594
Inverted microscopeOlympusCKX53Equipment
Western Blotting apparatusBioRad1658004Equipment
CentrifugeEppendorf5424REquipment
Automated cell counterBioRadTC20Equipment
FluorChem R systemproteinsimple-Equipment
p-Ampka (T172) antibodyCell signaling2535
Total-AMPK antibodyCell signaling5832
Albumin antibodyCell signaling4929
beta actin antibodySanta Cruzsc-130656
Fine scissors and forceps

参考文献

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