预组装塑料微流体芯片在原生小鼠神经元分割中的应用

摘要

该协议描述了使用塑料芯片培养和分割主要小鼠神经元。这些芯片是预装的, 用户友好的, 并与高分辨率, 活的和荧光成像兼容。该方案描述了如何在这些芯片内对大鼠海马神经元进行平板治疗, 并进行流控分离、轴切和免疫染色。

摘要

微制造的神经元分割方法已成为许多神经科学家必不可少的工具。该协议描述了使用一个商业上可用的预组装塑料芯片, 以分割培养的原代大鼠海马神经元。这些塑料芯片包含在标准显微镜幻灯片的占地面积内, 与高分辨率、实时成像和荧光成像兼容。该协议演示了如何通过使用修改后的狂犬病毒编码荧光蛋白的孤立轴突逆行标签神经元, 在一个隔间内创建孤立的微环境, 并在芯片上进行轴切和免疫细胞化学。神经元在塑料芯片内培养 gt;3 周, 说明了这些芯片对长期神经元培养的兼容性。

引言

传统的神经元培养方法会导致轴突和树突的随机生长, 从而阻止神经元在其独特的极化形态中的研究。在过去10-15 中, 微制造的多隔间装置已成为神经科学家公认和使用良好的研究工具 (选定的高调^{出版物参考1,2,3,4 个,5,6,7.,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}). 这些装置将神经元分割开来, 并提供了一种物理和化学方法来操作神经元的亚细胞区域, 包括 somata、树突、^轴突和突触 18, 19^.它们还提供了多种实验范式, 不可能使用随机培养, 包括轴突转运、轴突蛋白合成、轴突损伤再生和轴向-soma 信号的研究。基本的2室配置由两个平行的微流体通道组成, 由一系列较小的垂直微沟槽隔开。原代或干细胞衍生神经元被镀成微流控通道之一, 沉淀并附着在设备的底面上, 并在几天内延伸神经元。许多生长锥进入微沟槽, 微沟槽足够小, 可以阻止细胞体进入。由于生长锥受到物理限制, 无法在微沟槽内掉头, 它们直接生长到相邻的隔间 (轴突隔间), 在那里它们被隔离。

从历史上看, 这些器件是使用多 (二甲基硅氧烷) (pdms) 从光刻图案的主模具中成型的, 或者是在调查人员实验室内部制造的, 或者是商业购买的。使用 pdms 的主要缺点之一是它的疏水性²⁰。pdms 可以暂时进行亲水性, 但在非水环境^中, pdms 会在数小时内迅速变得疏水20。因此, 设备在使用时必须连接到玻璃覆盖件或其他合适的基板上。预组装的塑料多隔间芯片现已在注塑塑料中上市 (例如, XonaChips)。这些芯片是永久亲水的, 简化了设备的润湿性, 并允许芯片的预组装与薄膜的循环烯烃共聚物 (coc) 包围底部的微流体通道。这些芯片是在适用于高分辨率荧光成像的光学透明塑料中制造的。

该方案的目的是演示使用预先组装的塑料微流体芯片的多个实验范式进行使用小鼠海马或皮质神经元。该协议描述了如何在芯片内使用改良的狂犬病毒逆行标记神经元。还介绍了轴突损伤和再生研究的轴突切开术。最后, 该协议演示了如何与该器件一起进行荧光免疫染色。

研究方案

注: 塑料多隔间芯片的示意图如图 1a、 b所示。芯片的大小是一个标准的显微镜幻灯片 (75 毫米 x25 毫米)。芯片的特点, 包括主通道或隔间、水井和微槽都有标签, 供今后参考。图 1c是芯片的照片, 显示了隔间的流体隔离。

1. 多隔间芯片的制备和涂层

1. 在生物安全柜中, 将芯片放入培养皿或其他合适的无菌容器中。
2. 在芯片的左上井添加100μl 的预涂层溶液, 使其能够通过主通道流入相邻的井。
   注: 预涂层溶液用于预涂层微流体通道, 以消除在芯片内捕获气泡的可能性。
3. 用100μl 的预涂液将左下角很好地填充。等待 5分钟, 让溶液流经微槽。
4. 在右上井添加100μl 的预涂层溶液, 使其能够通过主通道流入相邻的油井。用100μl 的预涂液填充右下角。
5. 从每口井中吸收溶液。从主通道中吸气, 以避免从主通道中去除液体 (图 2 a)。立即在左上角的左井中加入150μl 的磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。等待1.5 分钟。
   注意: 不要从封闭的主通道中吸入所有液体。
6. 在左下角的井中加入 150μl pbs。等待 5分钟, 让液体流经微槽。在右上井加入 150μl pbs。在右下角的井加入 150μl pbs。等待10分钟。
7. 重复步骤 1.5-1.6, 进行第二次 pbs 清洗。
8. 检查组织培养显微镜下的芯片是否有主要通道中的气泡。如果存在气泡, 请执行以下过程。如果不存在气泡, 请跳到步骤1.9。
   1. 从井中吸气 pbs 将管道尖端与通道开口倾斜 (图 2a)。
   2. 将100μl 的预涂层溶液放入上井, 将管道的尖端与通道开口附近的地方倾斜 (图 2b)。气泡应通过通道进入较低的井。等待1.5 分钟。
   3. 重复步骤1.3-1.8。
9. 从井中吸气 pbs 将管道尖端与通道开口倾斜 (图 2a)。
10. 在芯片左上井加入 100μl 0.5 mgml 聚 d-赖氨酸 (pdl)。等待1.5 分钟, 用100μl 的 pdl 将左下角充满。
11. 在芯片右上井添加100μl 的 pdl。等待1.5 分钟, 在右下角的井加入100μl。
12. 关闭培养皿, 并将芯片放置在37°c 的孵化器中1小时。
13. 重复 pbs 清洗步骤 1.5-1.6 两次, 以去除多余的 pdl。
14. 从设备中吸收 pbs。
15. 立即在芯片左上井添加100μl 细胞培养基。等待1.5 分钟, 将介质添加到左下角。在右上角添加介质。等待1.5 分钟, 在芯片右下井添加100μl 介质。
16. 将芯片放入37°C 孵化器, 直到准备好将细胞装上板。

2. 将神经元播种到多隔间芯片中

1. 根据已建立的方案^{21、22 制备}离离小鼠海马神经元的细胞悬浮液, 产生约 12x10^{6 细胞}的密度。
   注: 可使用3至 12x10^{6 细胞}的电池悬浮密度。如果使用较低的密度, 添加到芯片中的细胞悬浮液体积可能会增加 (见下文)。下面描述的程序适用于小鼠离解的皮质或海马神经元。其他神经元类型的最佳细胞密度可能会有所不同。
2. 去除芯片每口井中的大部分介质, 在每口井中留下约5μl。从主通道中吸气, 以避免从主通道中去除液体 (图 2 a)。
   注意: 不要从封闭的主通道吸气。如果流体从主通道吸气, 气泡可能会被困在芯片中。
3. 在右上井装入5μl 的细胞悬浮液, 在右下井装载5μl 的细胞悬浮液 (总共约 120, 000个细胞)。通过在主通道附近点胶来加载电池 (图 2b)。检查下显微镜下, 以确保神经元是在主通道。等待 5分钟, 让细胞连接。
   注: 神经元可以装入任一隔间。为便于解释, 体细胞隔间是右侧的主要通道, 但任何一个隔间都可以用作体细胞隔间。可以使用较低的细胞密度, 使每个芯片的细胞减少到 60, 000个。最多10μl 的细胞悬浮液可以添加到体细胞室的每口井中, 同时细胞悬浮液的细胞悬浮液比上述细胞更少。
4. 在右上、右下井加入约150μl 的神经质培养基, 然后在左上、下井加入150μl 的培养基。将芯片放入 5% co2 37°c 孵化器中的加湿托盘中。
5. 24小时后, 通过从井中取出介质来执行介质更改。确保主通道保持已满。在每个顶部井中添加150μl 的介质, 然后填充井底。
6. 将芯片放回孵化器中, 以获得所需的天数。
   注: 每隔几天监视介质, 以确保介质保持浅粉色。如果介质为黄色, 则用新鲜介质替换50%。如果液位较低, 请确保有足够的湿度和适当的二次封闭的芯片, 以防止蒸发。使用二次封闭和使用聚四氟乙烯 (ptfe)-fep 薄膜覆盖含有芯片的盘, 可以最大限度地减少甚至消除介质变化。

3. 芯片内神经元的逆行标签

注: 逆行标记可以使用多种技术进行, 包括使用改良霍乱毒素和狂犬病毒。下面是使用 g 删除的 rabies-mcherry 或-egfp 病毒标记神经元的说明。根据当地组织的指导方针处理潜在的传染性材料。可能需要额外的培训。

1. 将新鲜神经元培养基加热至37°c。估计每个芯片有 ~ 400μl 的介质。
2. 使用从轴突隔间的任何一种井中提取的介质, 在总共50μl 中稀释 100, 000 病毒病毒单位。
   注: 根据组织批准的协议处理与病毒接触的提示和管道。
3. 将剩余的介质从轴状隔间的井中轻轻移开, 并在37°c 的离心管中储存。
4. 在轴突隔间加入150μl 的新鲜温热培养基和50μl 的稀释病毒。在37°c 孵化器孵育2小时。
5. 取出含有病毒的介质并正确处置。
   注: 如果流体从主通道吸气, 气泡可能会被困在芯片中。
6. 轻轻将75μl 的新鲜培养基添加到一个轴突井中, 使其流入另一个轴突井。
7. 从第二个轴突井中取出流经, 并正确处置。
8. 重复步骤3.6 和3.7 一次。
9. 将存储的介质添加回轴形隔间。如有必要, 加入约50μl 新鲜培养基, 以保持足够的体积, 并将细胞返回孵化器。
   注: 荧光蛋白表达可见 48小时, 并持续长达8天。在神经元培养基中, 神经元在室温下可以成像30分钟。培养基也可以用加热的二氧化碳_独立冬眠 e 取代 b27, 成像时间更长。神经元也可以在37°c 和 5% co 2 的高湿环境室内成像.在这种情况下, 加湿对于最大限度地减少芯片内的蒸发损失至关重要, 而加热会加剧蒸发损失, 从而损害神经元的健康。

4. 芯片内轴相隔间的流体隔离

1. 从轴突隔间的左下井取出 20μl, 放在体细胞隔间的右上井。等待2分钟内的流量在每个通道平衡。
2. 从轴形隔间中取出50μl 的介质。在此介质中加入0.3μl 的 1 mm 亚历克莎氟化物488酰亚胺, 通过管道混合, 返回到轴突隔间。芯片已准备好进行成像。
   注: 可以添加其他感兴趣的化合物。建议添加具有类似分子量的荧光染料作为感兴趣的化合物, 以监测流体分离随着时间的推移。

5. 在芯片内进行轴切

1. 从轴形隔间中取出介质, 使移液器尖端远离主通道入口 (图 2a), 并将其存储在离心管中。
2. 完全吸气轴突隔间, 将抽吸器放置在轴突隔间主通道的任意一个入口附近 (图 2b)。继续吸气 1-2分钟, 确保溶液从隔间中完全取出。
   注: 吸气的真空压力必须至少为18英寸汞, 轴切手术才能正常工作。
3. 用存储的介质替换轴突隔间, 并通过在显微镜下观察芯片来确认轴突被切断。
   注: 如果更换介质时轴形隔间中形成气泡, 请重复步骤 5.1-5.2。
4. 将芯片返回到孵化器。

6. 在芯片内进行荧光免疫保存

1. 在 pbs 中制备4% 的甲醛固定溶液 (4% 甲醛, 1μm mgcl 2, 0.1μm ccl 2, 120 mm 蔗糖₎
2. 取出芯片井中的大部分介质 (不要干燥内部隔间)。
3. 立即在轴突和体细胞隔间的顶井上加入100μl 的固定溶液。
4. 1分钟后, 在井底加入100μl 的固定溶液。在室温下固定30分钟。
5. 从芯片的井中取出大部分溶液 (不要干燥内部隔间)。立即将150μl 的 pbs 添加到轴突和体细胞隔间的每个顶井中。等待 2分钟, pbs 流入底井。
6. 重复步骤6.5 两次。
7. 从芯片的井中取出大部分 pbs。立即在轴状和体细胞隔层的每个顶井上添加150μl 的 pbs, 并将0.25% 的 TritonX-。等待15分钟。
8. 从芯片的井中取出大部分液体, 并立即在轴状和体细胞隔层的每个顶井中加入150μl 的阻滞溶液 (pbs 中10% 的正常山羊血清)。等待15分钟。
   注: 有效的阻滞溶液应特定于二级抗体,例如, 对于驴抗绵羊二级抗体, 在阻断溶液中使用驴血清。
9. 从芯片的井中取出大部分液体, 并立即在 pbs 1% 的正常山羊血清中添加100μl 的原代抗体 (或抗体), 加入到轴状和体细胞隔间的每个顶井中。盖, 以尽量减少蒸发, 并等待1小时在室温或4°c 过夜。
10. 从芯片的井中取出大部分溶液 (不要干燥内部隔间)。立即将150μl 的 pbs 添加到轴突和体细胞隔间的每个顶井中。等待 5分钟, pbs 流入底井。
11. 重复步骤6.10 两次。
12. 从芯片的井中取出大部分液体, 并立即在 pbs 中添加100μl 的二级抗体 (或抗体) 到轴状和体细胞隔间的每个顶井。盖, 以尽量减少蒸发, 并在室温下等待1小时。
    注: 有关推荐的二次抗体稀释, 请参阅制造商的说明。
13. 重复步骤6.10-6.11。
14. 如果在免疫染色的1天内进行成像, 请保持芯片充满 pbs。如果芯片在成像前1天的时间内储存时间超过 1天, 请将含有芯片的盘包装在石蜡膜中, 以防止蒸发, 并将其存放在 4°c, 直到准备成像。
15. 对于样品的长期存储, 可以使用安装介质 (例如, 氟通 g)。
    1. 从芯片的井中取出大部分液体。使用1毫升一次性塑料管, 在轴状和体细胞隔间的每个顶井中添加2滴安装介质。
    2. 倾斜芯片以鼓励安装介质通过通道的流动。5分钟后, 添加2滴到底井。成像前等待1小时。
       注: 使用安装介质后, 将无法重新探测其他目标。

结果

在芯片内大约5-7 的神经元生长后, 轴突生长是显而易见的。这些芯片与相位对比成像兼容, 如图 3所示, 图为24小时的神经元生长。芯片还与荧光成像兼容 (图 4、图 5、图 6和图 7)。狂犬病病毒通过轴突室感染三天后, 在芯片中成像了轴突的 mcherry 阳性神经元 (图 4)。为了证明以流体方式分离隔间的能力, 在轴形隔间中添加了一种低分子量的荧光染料 (亚历克莎氟化物488联酰亚胺)。这些结果可与基于 pdms^的17 腔进行比较, 并证明了塑料芯片是否适合相位对比和荧光成像。

为了说明神经元的生长与塑料芯片和 pdms 设备, 我们培养神经元在这两个平台和监测神经元的生长随着时间的推移。图 5显示了培养过程中 3 ~ 22天的神经元生长;这些结果代表了3个独立的实验结果。在两个平台内, 神经生长在培养时间长达 15天, 但在较长的培养年龄 (和 gt;21 天), 塑料芯片内的孤立轴突看起来更健康, 珠子更少 (图 5a)。为了进一步可视化轴突在轴突隔间内, 我们免疫抑制β-管蛋白 iii, 显示健康的轴突生长在塑料芯片内在22天的培养 (图 5b)。

轴突损伤和再生研究是常用的微流体分门别类装置。为了证明这些研究的适宜性, 逆行标记神经元在轴切术前和24小时后成像 (图 6)。在切开术后, 收缩球茎和再生轴突都很明显。这些结果相当于使用基于 pdms 的设备^14、17发布的数据。

免疫细胞化学是在多隔间装置中进行的一种常用技术, 用于可视化蛋白质定位。培养24天后, 芯片内的神经元分别被固定并染色, 用于兴奋和抑制突触标记 vglut1 和 vgat (图 7)。逆行标记的樱桃神经元也被成像 (图 7c)。成像是使用与60xo 硅油浸入目标的纺盘共聚焦进行的, 证明了执行高分辨率成像的能力。重要的是, 树突刺在一个放大的区域是显而易见的, 这表明在芯片内培养的神经元正在形成成熟的突触。

图 1: 预先组装的塑料双室微流体芯片, 用于将神经元分割开来.(a)显示上井和下井位置的多隔间芯片的示意图表示。(b)芯片的放大原理图, 显示连接隔间的主通道 (或隔间) 和微槽。主要通道约为 1.5 mmx7x0.060 mm (宽 xlxh)。微槽的宽度和高度分别约为0.01 毫米 x0.005 毫米。微槽的长度因配置的不同而不同, 0.15 毫米至0.9 毫米. ( c)在每个主要通道或隔间中含有食品着色染料的具有代表性的多隔间芯片的照片, 显示了流畅的能力隔离每个通道。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 使用塑料多隔间芯片时所需的移液技术。(a)在添加和吸气介质进行清洗时, 移液器尖端应与主通道入口倾斜, 如图所示。(b)在加载神经元或进行轴切时, 移液器尖端应朝向主通道的入口。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 相对比显微镜显示培养过程中 2 4天芯片内典型的神经元生长.胚胎海马神经元被播种到右体细胞隔间。从5-7 开始, 轴突隔间中就可以看到 axonal 的生长。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 逆行标记神经元表达 mcherry 荧光蛋白, 并将轴突延伸到流体分离的轴突隔间。(a)一个合并的荧光显微镜显示活逆行标记神经元感染通过修改后的樱桃狂犬病病毒简要应用于轴突隔间。在培养中, 神经元在感染后3天被成像。在轴突隔间内创造一个孤立的微环境, 可以通过应用低分子量染料亚历克莎氟化物488氨酰亚胺来证明。(b) (a) 的合并图像, 包括差分干涉对比度 (dic) 图像, 以可视化芯片的微槽区域。激光扫描共聚焦显微镜使用 30x/1.05 n. a. 硅油 (ne = 1.05) 物镜获得图像。请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: 对多隔间 pdms 设备和塑料芯片内的神经元生长进行并排比较。(a)两个平台的相位对比显微图在3、7、15天和22天的培养。在底部, 包括一个更高的放大区域从图像在 22天, 以说明在这个年龄的轴突增长在这两个平台。芯片内的轴比这个年龄的 pdms 设备更连续、更健康。(b)在培养22天时, 在 pdms 装置和塑料芯片的轴突室内, 制备了β-管蛋白 iii 染色轴突的倒置免疫荧光显微图。利用 20x·0. 45 n. a. 物镜, 用旋转盘共聚焦成像系统获得图像。所有刻度条均为 100μm. 请点击此处查看此图的较大版本.

图 6: 在塑料多室芯片内的海马神经元的切开术和再生。(上图)在培养过程中, 神经元在改良的樱桃狂犬病病毒前逆行标记, 然后在切开术前进行成像。图像使用 "fire" 颜色查找表进行伪着色。(底部)在顶部面板中成像的同一神经元是轴创后24小时的成像。白色虚线显示微槽屏障的边缘。在左虚线的位置进行了轴开。白色箭头显示一个收缩灯泡。白色箭头表示正在再生的轴突。利用 20x/0.45 n. a. 物镜, 利用旋转盘共聚焦成像系统获得图像。请点击这里查看此图的较大版本.

图 7: 在塑料多隔间芯片内培养的海马神经元之间形成突触.在培养过程中进行了24天的免疫染色, 并使用60xo 硅油浸入镜片在体细胞隔间内成像。神经元表达(a)兴奋突触标记, vglut1 (绿色) 和(b)抑制突触标记, vgat (蓝色)。(c)逆行标记的 mcherry 神经元 (红色) 是通过应用于轴突隔间的改良狂犬病病毒感染的。(d) vglut1、vgat 和 mcherry 的合并荧光微图。(e)用白色框表示的 (d) 中的放大区域显示树突刺, 即接收其他神经元突触输入的部位。使用 60x/1.3 n. a. 硅油 (ne = 1.406) 物镜的纺盘共聚焦成像系统获得图像。请点击这里查看此图的较大版本.

塑料多隔间芯片	pdms 多室设备
分离轴突	分离轴突
建立微环境	建立微环境
轴突神经元	轴突神经元
光学透明	光学透明
与高分辨率成像兼容	与高分辨率成像兼容
与荧光显微镜兼容	与荧光显微镜兼容
完全组装	所需的基板组装
健康轴突和 gt;21 天	健康轴突和 gt;14 天
亲水性培养表面	疏 水
气体不透水	透气性
圆形微槽和通道	直的微凹槽
更少的准备步骤	顶部是可拆卸的, 用于在微槽内染色
与激光烧蚀不兼容	小分子和有机溶剂的吸收
与矿物油浸没油不兼容 (硅基油很好)

表 1:用于培养神经元的塑料和 pdms 多隔间平台的比较.

讨论

塑料多隔间芯片为神经元的分割提供了一个易于使用的选择, 提供了长期的神经元培养 (和 gt;3 周)。该协议详细介绍了如何在这些芯片内培养皮质和海马小鼠神经元。还讨论了可溶性微环境的产生以及如何逆行标记神经元, 进行轴切, 并执行免疫细胞化学。重要的是, 这些芯片与高分辨率、荧光和实时成像兼容。

塑料多隔间芯片提供了许多与基于 pdms 的分区化器件相同的功能, 但具有优点、缺点和一些显著的特点。表 1提供了塑料芯片和基于 pdms 的设备的功能比较。首先, 芯片是预先组装和永久亲水性, 这有利于润湿, 使他们更容易使用。塑料不是气体渗透性, 不像 pdms, 所以如果气泡意外地形成在渠道内, 他们不容易逃逸, 必须被删除。一种预涂液, 主要含有乙醇和其他一些专有药物, 可消除气泡的形成。

在芯片内对荧光蛋白转导后的投影进行实时成像 (图 4), 且没有检测到的塑料自体荧光。需要注意的是, 与芯片一起用于高数值孔径目标的浸油必须是硅油为基础的, 而不是以矿物油为基础的。矿物油可引起与循环烯烃共聚物的不良反应。对于光场成像, 需要注意的是, 芯片中的微槽在末端是圆形的, 并且主要通道的 z 方向逐渐向微槽屏障倾斜, 导致在在明亮场成像过程中的微凹槽 (图 3)。由于芯片是预组装的, 因此抗体在微米大小的微凹槽中的渗透可能不均匀 (如永久粘合的 pdms 设备);因此, 免疫染色后的定量分析应在通道/隔间进行。通过在隔间之间创建体积差异来帮助抗体和荧光体流入微沟槽, 可以改善微沟槽内神经元投射的免疫染色。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
XonaChip	Xona Microfluidics, LLC	XC150	150 µm length microgroove barrier
	Xona Microfluidics, LLC	XC450	450 µm length microgroove barrier
	Xona Microfluidics, LLC	XC900	900 µm length microgroove barrier
XC pre-coat	Xona Microfluidics, LLC	XC Pre-Coat	included with XonaChips
XonaPDL	Xona Microfluidics, LLC	XonaPDL
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats	Charles River	24100564
neuronal culture media:
- Neurobasal medium	ThermoFisher Scientific	21103049
-B-27 Plus Supplement (50x)	ThermoFisher Scientific	A3582801
-GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
-Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermoFisher Scientific	15240112
fluorinated ethylene propylene film	American Durafilm	50A	0.5 mil thickness
modified rabies virus	Salk Institute for Biological Studies	G-deleted Rabies-eGFP	Material Transfer Agreement required
	Salk Institute for Biological Studies	G-deleted Rabies-mCherry	Material Transfer Agreement required
Alexa Fluor hydrazide 488	ThermoFisher Scientific	A10436
Fluoromount G	ThermoFisher Scientific	00-4958-02
Glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	CLS7095D5X SIGMA	5.75 in length
hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Pierce 16% formaldehyde	ThermoFisher Scientific	28906
PBS (10x)	ThermoFisher Scientific	QVC0508
normal goat serum	ThermoFisher Scientific	16210064
triton X-100	ThermoFisher Scientific	28314
anti-vGlut1 antibody	NeuroMab	75-066	clone N28/9, 1:100
anti-vGAT antibody	Synaptic Systems	131 003	1:1000
anti_beta-tubulin III	Aves	TUJ	1:1000
Alexa Fluor secondary antibodies	ThermoFisher Scientific		1:1000
Incubator, 5% CO2 37 °C
Epifluorescence imaging system	EVOS Fluorescence imaging system	AMF4300	10x objective
Spinning disk confocal imaging system	Andor Technology	CSU-X1, iXon X3 EMCCD	60x silicone oil & 20x objectives
Laser scanning confocal imaging system	Olympus	FV3000RS	30x silicone oil objective