吸收性微活检取样和 rna 提取用于微创同时进行血液和皮肤分析

摘要

在本文中, 我们演示了吸收性微活检技术是如何执行的, 以及如何使用该样本提取 rna, 以微创的方式对皮肤和血液进行简单和同时的采样。

摘要

传统的皮肤活检限制了临床研究, 涉及化妆品敏感区域或儿科应用, 由于其侵入性。在这里, 我们描述了使用吸收式微针为基础的设备, 吸收性微活检, 以微创采样皮肤和血液混合物的协议。我们的目标是帮助促进临床研究的快速进展, 建立皮肤病的生物标志物, 降低临床研究参与者的风险。与传统的皮肤活检技术不同, 吸收性微活检可以在几秒钟内进行, 不需要密集的培训, 因为它的设计简单。在本报告中, 我们描述了吸收性微活检的使用, 包括加载和应用, 对志愿者。然后, 我们展示了如何从被吸收的样本中分离 rna。最后, 我们演示了使用定量逆转录酶链反应 (rt-qpcr) 来量化血液 (cd3e和cd19) 和皮肤 (krt14和tyr) 的 mrna 表达水平。我们描述的方法利用现成的试剂盒和试剂。该方案提供了一种微创方法, 用于在同一吸收性微活检基质内同时采集皮肤和血液。我们发现人类伦理委员会、临床医生和志愿者都支持这种皮肤病学研究的方法。

引言

皮肤活检是皮肤科最重要的皮肤取样技术之一, 并通过组织病理学评估对皮肤病进行后续诊断。活检技术包括医疗专业人员使用刀片或打孔活检, 以清除病人皮肤上的可疑病变进行检查^.虽然该技术是有效的, 它是高度侵入性和限制临床研究的终点通常涉及分子生物学技术^2,3。皮肤病的分子分析有可能提供组织病理学分析所不能提供的高度特定的生物学信息, 从而促进药物发现和疾病诊断^4,5。此外, 大多数分子技术的样品需求相对较小, 可能导致动物使用减少, 并允许更多的复制。因此, 显然需要一种替代技术, 使分子分析在临床研究中, 并降低参与者的风险。

为了满足该领域的这种需求, 我们的小组开发了一个新的基于微针的诊断平台, 吸收性微活检, 能够收集少量的皮肤混合血液在一个简单和微创的方式 6.本出版物的目的是将吸收性微活检描述为一种取样工具, 以便在临床研究中通过 rna 提取促进分子分析。

此前, 我们已经描述了第一个版本的微活检, 皮肤微活检, 它由一个由三层钢板设计制成的微针组成, 以提取微小的皮肤组织⁷。这种装置的新颖性来自于微针的多个接触点, 允许有效的组织提取³。相比之下, 圆形皮肤打孔活检只提供一个接触点, 在某些情况下只是撕裂皮肤, 而不捕获任何样本。基于皮肤微活检, 我们最近开发了吸收性微活检, 具有血液和皮肤采样能力。在最近的一项流行病学研究中, 该装置已被证明可以在资源贫乏地区使用.

由于其简单的设计, 吸收性微活检可以在几秒钟内进行, 不需要广泛的培训。此外, 不需要局部麻醉, 应用部位不会造成疤痕。本协议使没有相关抽样培训的研究人员或医疗专业人员能够获得有针对性的皮肤数据, 用于分子分析。我们预计微采样设备将成为未来皮肤研究的常规。

虽然微活检已被报道在其他皮肤病的研究 , 涉及分子诊断技术^6,8,9,10, 如人类状瘤病毒 dna 检测 , 这一方案首次详细介绍了吸收性微活检的样品提取和处理技术。此外, 这是第一份描述微活检样本中皮肤和血细胞相对基因表达谱的报告。

研究方案

这项研究得到了地铁南人类研究伦理委员会和昆士兰大学人类研究伦理委员会 (hrec13-qpah-551 和 UQ2013001551) 和南澳大利亚大学人类伦理委员会 (200607) 的批准。

1. 吸附剂微活检制造

1. 激光切割微针部件分别来自50μm 医用级不锈钢薄板和吸收层 (滤纸) (图 1)。
   注: 设备的其他部件, 包括柱塞和机箱, 均采用快速成型技术 (如3d 打印) 制造。
2. 将除吸收剂层外的所有部件浸泡在70% 乙醇 (etoh) 中 5分钟, 然后将其风干30分钟。
3. 组装三层微针, 中间有吸收剂层 (图 1a)。
4. 将组装好的微针插入柱塞的缝隙中。
5. 打开弹簧, 将柱塞插入机箱 (图 1c)。避免在装配过程中触摸任何东西的微针, 以确保针头的质量。
6. 使用前, 请将组装好的吸收性微孔密封在一个包中, 以便进行γ辐射灭菌。

2. 吸收剂微活检取样

1. 戴一次性手套, 用70% 的 etoh 喷手和工具, 如钳子。
2. 用酒精擦拭对应用部位进行消毒。
3. 在不接触微针的情况下, 从γ辐射灭菌包件中取出微活检。
4. 通过拉动柱塞压缩弹簧来加载设备, 直到有 "点击" 的声音, 柱塞锁定到位。
5. 将设备对准要取样的皮肤, 确保采样区域处于固定位置。
6. 确保设备与皮肤大致垂直, 然后对设备施加≥1公斤的力。
   注意: 需要向下施加力, 以确保微针的足够渗透。
7. 按下扳机, 将设备固定在适当的地方至少 10秒, 以便采集血液样本。
   注意: 如果设备在10秒之前释放, 则捕获的示例较少。

3. rna 提取

注: rna 提取程序从制造商的协议中进行了修改, 以便从微生物样品中最佳分离 rna。除非另有说明, rna 提取中使用的所有试剂和色谱柱都包含在试剂盒中。

1. 用手轻轻拉出柱塞和吸水针。确保微针的尖端在去除过程中不会与任何东西接触。
2. 从柱塞上取下吸水微针。用一对无菌钳抓住微针上的两个孔, 并将其拔出。
3. 将完整的微针放入2毫升的微离心管 (不是从 rna 分离试剂盒; 见材料表) 中, 预先填充50μl 的萃取缓冲液, 针头面朝下朝下。为了最大限度地减少样品损失, 在处理样品之前, 将管子放在干冰上5分钟。
4. 旋涡短暂 (3-5 s), 从尖端中取出一些采样的材料。
5. 在42°c 的情况下, 将灯管中的微针在摇杆上培养30分钟。
   注意: 缓冲液将立即被吸收到吸收层。
6. 使用无菌钳将微针的顶部 (针的另一侧) 与2毫升微泡管的顶部边缘置于水平。
7. 合上管的盖子, 使微针的顶部保持在瓶盖和管之间的位置。
8. 以 16, 000 x g 或最高速度旋转管 30秒, 以从设备的吸收层中取出采样材料。
9. 用钳子小心地取出微针, 而不再浸入缓冲液中。保持管, 丢弃微针。
10. 将样品以 3, 000 x 克的速度离心, 用2分钟的移液器将含有提取的 rna 的上清液仔细地离心到一个新的微离心管中。
11. 在净化柱滤膜上加入250μl 的调理缓冲液, 在室温下孵育5分钟。
12. 以 16, 000 x g 或最大速度离心收集管中的柱, 时间为1分钟。
13. 在步骤3.9 采集的样品中加入50μl 的 70% etoh。通过轻轻向上和向下移液混合。
14. 将混合物 (~ 100μl) 转移到预处理的净化柱中。
15. 立即在 100 x 克离心 2分钟, 然后以 16, 000 x g 离心 30秒, 以去除流经。
16. 在净化柱和离心机中加入100μl 洗涤缓冲液 1 (w1), 在 8, 000 x 克的情况下, 在1分钟内。
17. 在每个样品的单独微离心管中加入5μl 的 dnase i 库存溶液, 加入35μl 的缓冲 rdd, 从而制备 dnase 溶液。通过轻轻反转混合。
    注: 由于样品的数量, dnase 处理将在纯化柱上进行, 而不是在之后的 pcr 板上进行。
18. 将40μl 的 dnase 孵育直接加入纯化柱膜。在室温下孵化15分钟。
19. 在纯化柱膜中加入40μl 的 w1。离心机以 8, 000 x 克的速度进行15秒。
20. 在 dnase 处理后, 将100微克的洗涤缓冲液 2 (w2) 放入纯化柱中, 离心机 1分钟, 8, 000 x 克。
21. 在纯化柱中加入100μl 的 w2, 离心机 2分钟, 16, 000 x g. 检查净化柱是否有任何残留的洗涤缓冲液。如果残留有洗涤缓冲液, 请以 16, 000 x g 重新离心1分钟。
22. 将纯化柱转移到试剂盒中提供的新的 0.5 ml 微离心管。
23. 将无 rnex 的水 (不在 rna 分离试剂盒中不提供) 的移液器 11μl, 而不是洗液缓冲液 (eb), 直接放在纯化柱的膜上。轻轻触摸移液器的尖端到膜的表面, 同时分配无 rnase 的水, 以确保最大限度地吸收无 rnase 的水进入膜。在室温下孵化2分钟。
24. 离心分离柱 1分钟, 以 1, 000 x 克的速度将无 rnase 的水分布在色谱柱中, 然后离心 16, 000 x 克, 1分钟后清除 rna。
    注: 由于样品数量较少, 不建议对 rna 进行定量。
25. #1 的停止点: 如果没有立即进行 cdna 合成, 请将总 rna 样本存储在-80°c。
    注意: 考虑到 rna 样品浓度较低, 如果没有必要, 请避免冷冻。

4. cdna 合成

1. 在冰上解冻冷冻样品 (从步骤3.25 开始)。
2. 根据下面的步骤, 用 cdna 合成试剂盒合成总 rna 中的 cdna。
3. 制备反应混合物: 总 rna 11μl, 5x 跨安报缓冲 4μl, 逆转录酶 1μl, dnase/rnase 水4μl。通过移液轻轻混合。
4. 在热循环仪上运行逆转录酶: 25°c 10分钟, 42°c 15分钟, 然后在85°c 下最后的逆转录酶失活步骤5分钟。
5. #2 的停止点: 将逆转录样样品存放在-80°c, 直到使用。

5. qpcr 反应和数据分析

注: qpcr 反应的引物被设计为跨越内含子边界, 以避免使用 ncbi 引物 blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 扩增基因组 dna。本研究中使用的参考基因是rplp0 (有关详细信息, 请参阅讨论部分)。

1. 在冰上解冻冷冻样品 (从步骤4.5 开始)。
2. 按照以下步骤使用 qpcr 主混合试剂盒执行 qpcr。
3. 制备主混合物, 其中包含以下各项反应: 5μl 的 2x qpcr 反应混合物, 0.4μl 的10μm 正向底漆, 0.4μl 的10μm 反向底漆, 2.2μl 的无 dnase 水。通过移液轻轻混合。以三重奏设置示例。
4. 将主链液的8μl 先混合到384孔 pcr 板的每个井中, 然后从每个样品中提取2μl 的 cdna (每个井共 10μl)。
   注意: 没有模板控件 (ntc) 和没有逆转录酶控制 (-rt) 作为负对照包括在内。
5. 用胶膜密封板材, 并简要离心。
6. 在实时热循环器上运行放大反应: 95°c 为 2分钟 (聚合酶活化), 然后是 40°c 95°c 5秒 (变性)、60°c 10秒 (退火) 和 72°c (延伸)。
7. 通过从已知浓度模板制备的标准曲线插值来计算样品的 rna 浓度。
   1. 在软件中创建新实验。
   2. 单击"定义" 和 "设置标准" 以设置板材的串行稀释。
   3. 选择并安排标准和样品的井。单击 "应用"。
   4. 单击 "结果" 选项卡中的"分析"以评估标准曲线。确定斜率、r2值、放大效率和误差均符合实验标准。
   5. 根据未知样品的 ct 值, 在标准曲线上直观地检查它们的数量。
      注: 标准曲线的构造, 包括稀释系数的选择, 是根据已发布的协议^{11、12、13 进行}的。
8. 利用 ct 方法 (ct 归一化为反射基因) 对 mrna 进行基因表达分析。
   1. 从参考基因的 ct 值中减去目标基因的 ct 值, 以获得 ct 值。
   2. 平均技术复制的 ct 值。
   3. 利用统计软件^{11、14 绘制}和分析基因表达 (见材料表)。
      注意: 或者, 基因表达分析是根据已发布的协议¹³进行的。

结果

我们此前曾报道过, 皮肤微活检的微针穿透皮肤约500μm 深 7.皮肤微活检的微针设计与吸收性微活检的微针设计非常相似 (图 2a)。虽然吸收性微活检包括一个吸收层在中间的血液吸收, 皮肤微活检包含一个渠道为皮肤组织机械捕获。吸收层的使用也导致微针尺寸略有差异 (吸收剂: 1.50 x 0.50 x 0.50 毫米对皮肤: 1.50 x 0.50 x 0.50 毫米)。

图 2b显示了男性志愿者左音量臂上应用吸收剂5分钟后的应用部位和皮肤微生物。由于这两种微针设计的相似性, 这两个装置的应用地点是可比的, 与轻微的红斑相当。这两个申请地点在48小时后都不明显, 没有留下疤痕。这支持了这样的假设, 即这种微创设备有可能帮助筛选多个应用站点或定期执行。

图 2c显示了将吸收剂微活检的吸收层应用于一名男性志愿者的摇臂后的代表性图像。如图所示, 在微针尖端附近捕获了几块微小的皮肤, 一些血液被滤纸吸收。这表明该装置穿透皮肤, 并在同一吸收性微活检基质内同时捕获皮肤和血液。图 2d显示了取样后皮肤微活检, 即上一代微活检, 供比较。皮肤微活检通道捕捉到了一小块皮肤, 但与吸收性微活检相比, 微针上的血液量很小。这两个应用程序站点在48小时内都不明显。在实验中, 吸收性微活检在应用后采用了 1 0秒的保持时间, 而由于设计上的差异, 皮肤微活检在应用后立即释放。

如图 3a所示, 两组吸收性微活检参与了基于应用协议的实验: "立即释放" 和 "10 的持有"。对于 "立即释放" 组, 该设备使用相同的原始皮肤微活检协议应用, 应用后立即将设备从应用现场删除。对于 "1 0 的持有" 组, 该装置是在申请 1 0秒后固定的, 以改进样本收集。建立了两组吸收性微活检, 以说明应用方法如何影响样本量。选择10-s 保持时间作为临床合理的时间, 以证明应用时间影响可回收样品的数量。

从两个吸收性微活检组中恢复的 rna 量为 0.33±0.39 ng 用于 "立即释放", 1.43±0.88 ng 用于 "10秒保持" (图 3a, n = 20), 这表明随着额外的保持时间而增加4倍。这表明, 应用吸收剂装置与10-s 保持时间导致更多的 rna 提取。差异可能是由于吸收剂层中存在更多的血液样本 (图 3c)。事实上, 与 "10 的持有" 组 (图 3b) 相比, "立即释放" 组 (图 3b) 未能收集到与吸收层类似的血液量 (图 3b)。还应该注意的是, 最直接释放的微生物检查接近 x 轴, 这表明它们是负面事件或显示的 rna 含量很低。因此, 该结果验证了这样的假设, 即保持时间会对设备的性能产生影响, 因为血液可能需要时间才能被吸收剂层吸收。

由于该装置是为血液和皮肤取样而设计的, 因此使用 qpcr 检测这两个装置的皮肤和血液生物标志物的表达进行比较。我们使用酪氨酸酶, tyr, 作为黑素细胞的生物标志物, krt14作为生物标志物的角质形成细胞在可行的表皮。将皮肤微活检样本纳入实验进行比较。如图 4所示, 尽管由于设计上的差异, 皮肤和吸收性微生物的应用不同, 但皮肤生物标志物tyr和krt14的表达水平在这两种设备上都是可比的, 如数据。白细胞生物标志物 (cd3e、t 细胞和cd19, b 细胞) 在吸收性微活检样本中更为普遍, 而在皮肤微活检样本中更为普遍。这一结果表明, 与皮肤微活检 (n = 5) 相比, 吸收性微活检在血液采集方面表现更好, 但仍保持着捕捉皮肤的能力。

图1。吸收性微活检的制备.(a) 三层微针。(b) 设备的所有部分。(c) 组装好的吸收剂微活检。请点击这里查看此图的较大版本.

图2。吸收性微活检能够同时捕捉皮肤和血液样本, 而不会在男性志愿者的左掌臂上留下疤痕.(a) 吸收剂微针与皮肤微活检的比较。(b) 应用5分钟后由吸收剂和皮肤微生物留在的应用地点。(c, d)应用后的吸收剂和皮肤微孔。请点击这里查看此图的较大版本.

图3。吸收性微活检在应用10-s 时采集了更多的血液和 rna 样本.(a) 10-s 的应用后保持时间比立即释放设备 (n = 20) 的 rna 含量更高。错误条表示平均值 (* * ** p& lt;0.0001) 中的 s. d.。(b, c)具有代表性的图片吸收微活检后应用与 "立即释放" 和 "10 的持有" 的方法。请点击这里查看此图的较大版本.

图4。皮肤和吸收性微生物之间 mrna 表达水平的比较 (n = 5)。利用参考基因rplp0 对基因表达进行了归一化。错误条表示平均值 (*p& lt;0.05) 中的 s. d.。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

这些结果表明, 吸收性微活检可作为一种工具, 用于简单和微创取样的皮肤和血液混合物的分子表征。根据我们的协议进行设备应用对于获得可靠的结果至关重要, 不同应用协议回收的 rna 量的差异就表明了这一点 (图 3)。一旦提取了样品, rna 提取的后续样品处理步骤与已建立的协议^15,16非常相似。除了为吸收性微活检而修改的 rna 提取的初始步骤外, 另一个关键的变化是使用无 rnase 的水, 以改善下游应用的结果。此外, 值得一提的是, 本研究中使用的参考基因是rplp0。rplp0 的功能因不同的细胞和17类型^而闻名, 据报道, rplp0 是用于非黑色素瘤皮肤癌和癌前病变¹⁸的合适参考基因。

该设备的主要限制之一是从设备中取出微活检, 这很耗时, 有可能增加样本丢失的机会, 特别是对 rna 等敏感样本而言。然而, 这个问题可以通过预冷却所有无菌加工工具, 如2毫升微型离心管, 在干冰上克服。

吸收性微活检的使用很简单, 不需要密集的训练。传统的活检是没有必要的, 因为微活检允许分子表征与既定的分子诊断技术, 如 rt-qpcr。为了进一步量化和展示吸收性微活检的取样能力, 研究了以往涉及从人体皮肤组织中提取 rna 的文献。从典型的3.0 或4.0 毫米皮肤打孔活检, 三项研究报告提取的 rna 量从50至200纳克每毫克皮肤^{组织 19,20,21}。与平均从吸收性微活检中回收的1.43 纳气 (图 3) 相比, 根据皮肤冲床活检研究中相同的 rna-组织比, 采样皮肤组织的重量预计从0.29-115 微克不等。

这个协议并非没有潜在的陷阱, 尽管有些问题很容易克服。例如, rna 提取数据表明, 即使与10秒的保持时间有相当大的差异 (图 3)。为了解决这个问题, 一个潜在的解决方案涉及优化应用程序协议。应测试和优化应施加于皮肤的力和保持时间等参数, 以减少样品提取的变化。另一个潜在的问题是从设备中取出微活检, 这可能会影响样本的完整性和恢复。虽然去除用于 rna 提取的微活检是一种有效的方法, 但整个过程是繁琐的, 并且样品可能会在过程中受到污染。因此, 为了确保样品的完整性和防止样品丢失, 非常希望对样品处理协议进行修改。

一旦上述两个问题得到解决, 预计该设备将成为临床研究的标准工具。需要注意的是, 该设备同时捕获皮肤和血液样本, 在分析基因表达数据时应考虑到这一点。总之, 该协议描述了执行吸收性微活检的细节, 作为一个简单和微创的工具, 结合皮肤和血液取样和后续的样品处理的相对基因表达谱。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling
Absorbent Microbiopsy	Trajan Scientific and Medical	N/A	https://www.trajanscimed.com/
Whatman filter paper, Grade 1	Sigma Aldrich	WHA1001325	N/A
RNA extraction
PicoPure RNA Isolation Kit	ThermoFisher	KIT0214	Including all buffer soltuions described in protocol
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher	10977015	Improving RNA quality in RNA elution step
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile	Thomas Scientific	1226S74	N/A
Microcentrifuge 5415R	Eppendorf	Z605212	N/A
cDNA synthesis
SensiFAST cDNA Synthesis Kit	Bioline	BIO-65053	N/A
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855196	N/A
qPCR reaction and data analysis
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit	Bioline	BIO-94005	Including reagents described in qPCR reaction steps
MicroAmp Optical Adhesive Film	ThermoFisher Scinentific	4311971	N/A
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate	ThermoFisher Scinentific	4343370	N/A
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	ThermoFisher Scinentific	4485694	N/A
GraphPad Prism (v6.04)	GraphPad	N/A; Windows version	Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps
PCR primers
RPLP0 F	Sigma Aldrich	N/A	ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC
RPLP0 R	Sigma Aldrich	N/A	CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG
TYR F	Sigma Aldrich	N/A	TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA
TYR R	Sigma Aldrich	N/A	AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC
KRT14 F	Sigma Aldrich	N/A	CCT CCT CCC AGT TCT CCT
KRT14 R	Sigma Aldrich	N/A	ACA CCA CCT TGC CAT CG
CD3E F	Sigma Aldrich	N/A	CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG
CD3E R	Sigma Aldrich	N/A	GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG
CD19 F	Sigma Aldrich	N/A	TTC TGC CTG TGT TCC CTT G
CD19 R	Sigma Aldrich	N/A	GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T