微流控法评价人诱导的多能干细胞内皮细胞 (hipsc-ec) 对白细胞粘附的评价

摘要

该分步协议提供了实验设置和数据分析的详细描述, 用于评估 hipsc-ec 中的炎症反应和分析生理流下的白细胞粘附。

摘要

内皮细胞 (ec) 是必不可少的调节炎症反应, 通过限制或促进白细胞招募到受影响的组织, 通过一个良好的特征级联的亲粘合剂受体, 在炎症触发时的白细胞表面。不同的人在人口和遗传背景之间的炎症反应可以促成这些差异。 人类诱导的多能干细胞 (hipsc) 已被证明是 ecs (hipsc-ec) 的可靠来源, 从而代表了一个无限的细胞来源, 可以捕获遗传特性和供体的任何遗传变异或突变。因此, hpsc-ec 可用于模拟捐助者特异性细胞的炎症反应。炎症反应可以通过确定白细胞在生理流动下对 hpsc-ec 的粘附来模拟。该分步协议提供了实验设置和数据分析的详细描述, 用于评估 hipsc-ec 中的炎症反应和分析生理流下的白细胞粘附。

引言

炎症在许多病理条件中起着关键作用, 包括心血管和神经退行性疾病、败血症和不良药物反应 (adr)。内皮细胞 (ecs) 通过诱导酶受体 (如 e-选择素、细胞间粘附分子-1 (icam-1) 和血管细胞粘附分子-1 (vcam-1)), 在调节炎症反应方面发挥着至关重要的作用。^1,2. 已知不同组织中的微血管 ec 在炎症反应^3,4中表现出异质性。此外, 遗传背景或某些遗传条件可能导致个体之间炎症反应的差异;因此, 从不同的个体获得 ecs 是很重要的。最近, 人类诱导的多能干细胞 (hipsc)⁵, 几乎可以从任何个人,^被证明是一个可靠和可再生能源^{的 ecs 6,}7^{, 89}. 因此, 评估 hpsc-ecs 中的炎症反应和白细胞招募是有价值的, 不仅对某些遗传疾病的建模, 而且还有助于提供个体间变异性的迹象, 并可作为在未来的个性化医疗。

流量检测为研究内皮-白细胞相互作用提供了一个有用的工具。微流体装置的进步使生理流体流动条件的再现与血管床特定剪切应力水平的精确控制。活体成像可以监测白细胞捕获、滚动、爬行、粘附和迁移等事件的级联。研究内皮-白细胞相互作用的几种流动检测已经发展, 但它们都利用初级 ecs^10,11,12,13。在这里, 我们将详细描述在生理流动下评估人类白细胞粘附到 hicc-ec 的方法。在这个过程中, 我们描述了 hepsc-ec 刺激与促炎刺激的优化条件, 如肿瘤坏死因子α (tnfα), 离解, 播种到一个微流体芯片与八个平行通道。我们描述了一个逐步的协议, 用于将 hipsc-ec 与荧光标记白细胞悬浮在微流体芯片、活细胞成像和粘附白细胞的自动计数中。

该方案可用于评估药物筛选、疾病建模和个性化再生医学中 hipsc-ec 中的炎症反应。

研究方案

1. 溶液和试剂的制备

1. 通过添加血小板不良的血浆衍生血清 (1%), 制备完整的人内皮性 sfm 培养基 (EC-SFM full), 碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf, 20 ng/ml) 和血管内皮生长因子 (vegf, 50 ng/ml) 到人内皮-sfm (见材料)。通过0.22μm 的孔隙过滤器过滤培养基, 并将其保存在4°c 下, 最长2周。
2. 通过在 rpmi 培养基中添加胎儿牛血清 (10%)、2-硫代乙醇 (0.05 nm)、l-谷氨酰胺 (1%)、青霉素-链霉素 (25 uml) 培养基 (见材料表), 制备完整的 rpmi 培养基。在4°c 下存放长达3周。

2. 微流体芯片的涂层

1. 将无菌生物芯片放入10厘米的无菌培养皿中。
2. 在没有 ca 2⁺/mg 2 + 的情况下, 将库存溶液重新构建到 50μg/ml^的最终浓度, 从而制备纤维连接蛋白工作溶液。估计每个生物芯片的工作溶液为80μl。
3. 将10μl 的纤维连接蛋白工作溶液注入生物芯片的每个通道。使用带有10μl 小的移液器, 确保通道入口和移液器吸头之间形成紧密的接触 (图 1c, 左)。
4. 关闭含有生物芯片的 petri 培养皿的盖子, 并将其放入加湿室 (图 2b)。将室内存放在4°c 过夜。要使室内加湿, 请将干净的纸巾放在加湿腔的底部, 并加入5毫升的无菌 h2o.
5. 第二天, 在检测前, 将生物芯片预热37°c 在孵化器中。

3. hicpc-ec 的制备

请注意:在这里描述的协议中, 如前面所述的 8, 对 hipsc-ec 进行了区分、纯化、冷冻保存和解冻。

1. 解冻和板 hpsc-ec 在完整的 EC-SFM 完整成一个0.1% 的明胶涂层 t75 烧瓶, 三到四天前的检测。
2. 在检测前一晚, 用 tnfα刺激 hispc-ec, 加入 EC-SFM 全, 加 10 ngl tnfα, 并在37°c 孵育 (~ 12小时), 如前^所述.

4. hipsc-ec 分离和播种到微流控芯片中

1. 在检测当天, 从孵化器中取出 hicsc-ec 的烧瓶, 并在显微镜下检查细胞。确保 hipsc-ec 是80–100% 融合, 并具有典型的 ec 状形态。
2. 将烧瓶转移到细胞培养罩中。
3. 从高 psc-ec 的烧瓶中吸收培养基。
4. 在没有 ca^{2 +}mL^{2 +}的情况下, 加入10毫升的 pbs, 将细胞培养物简单地洗干净。吸收 pbs。
5. 每瓶添加1x 离解酶4毫升。在室温下孵化 5分钟 (rt) (图 1 b)。
6. 通过在每瓶中加入8毫升的人内皮 sfm 介质来阻止分离反应。用5毫升移液器在15毫升锥形管中轻轻分离并收集 hipsc-ec 悬浮液。
7. 计算悬浮液中单元格的总数。
8. 在 rt 以 300 x g离心细胞3分钟。
9. 将上清液吸至 EC-SFM 全出的细胞颗粒, 最终浓度为 1.5 x 10⁷ cells/mL。
10. 从孵化器中取出带有生物芯片的培养皿, 并将其转移到细胞培养罩中。
11. 从微流体芯片的所有通道中吸收纤维连接蛋白溶液。
12. 使用带有10μl 小尖端的移液器 (图 1c, 中) 将细胞悬浮液的6μl 注入每个通道。在注射前确保细胞悬浮液混合良好, 避免细胞沉淀。
13. 在显微镜下检查生物芯片, 确保细胞均匀分布, 细胞密度高 (图 2c)。
14. 在37°c 下将生物芯片培养15分钟。
15. 在每个通道两侧的中型储层中加入40μl 的 EC-SFM。
16. 在37°c 下将生物芯片培养 1小时 (图 1c, 右)。
17. 在每个通道两侧的储层中再添加50μl 的 EC-SFM。

5. 人类白细胞的制备

请注意:在这里描述的协议中, 使用了商业上可获得的单核细胞系 (thp-1)。或者, 可以使用外周血单个核细胞或中性粒细胞。外周血单核细胞和中性粒细胞的分离可以使用标准^{程序 11}进行。在细胞培养引擎盖中执行本段中描述的所有步骤。

1. 收集白细胞在一个50毫升锥形管。
2. 用10毫升的 pbs 清洗白细胞, 不含 ca^{2 +}/mL^{2 +}。在 rt 以 300 x g离心细胞 3分钟 (图 1d)。
3. 用 dioc6 染料 (_ex = 485 nm, em = 501 nm) (1: 5000) 在 pbs 的1毫升中吸收上清液并重新悬浮细胞颗粒。在 rt 将细胞在黑暗中培养10分钟。
4. 用10毫升的 pbs 清洗白细胞, 不含 ca^{2 +}/mL^{2 +}。在 rt 以 300 x g离心细胞 3分钟, 再重复一次清洗步骤。
5. 计算悬浮液中单元格的总数。
6. 将上清液吸吸, 并将细胞颗粒重新悬浮在完整的 rpmi 培养基中, 最终浓度为 2.5 x^{10 6}细胞。

6. 微流控泵的制备

1. 将微流体泵与8通道歧管组装。
2. 使用已安装的操作软件将泵连接到电脑。
3. 启动微流体软件, 并通过单击 "打开协议" 加载协议, 然后在 pc 上导航以选择微流体协议。
4. 通过选择"设置" 文件夹并单击 "运行检测步骤", 连接软件和泵。
5. 为正确的流速控制定义通道的几何: 在"几何设置" 文件夹中选择"更新几何" , 然后单击 "运行检测步骤"。
   请注意:确保几何细节与要使用的注射器和通道相匹配 (几何 id = 1, 通道数 = 8, 通道宽度 = 800. 0μm, 通道深度 = 120.0μm, 注射器体积 = 250μl) 和样品的粘度 (液体粘度 = 1.0)。
6. 将入口电缆 (橙色) 放入含有80% 乙醇的50毫升锥形管中, 将泵清洗干净。将出口电缆 (绿色) 放置在50毫升锥形空管 (废容器) 中。
7. 选择"清洗泵" 清洗器文件夹, 然后单击"运行检测步骤" (洗涤量 = 2000μl, 洗涤量步骤 = 250μl, 清洗方向 = 输出)。再次重复清洗步骤。
8. 使用细胞培养等级的水和人体内皮 sfm 培养基重复泵清洗步骤 (步骤 6.6-6.7)。
9. 继续进行歧管的清洗步骤。
10. 通过将3路适配器放置到正确的位置 (指示灯 off 向左旋转), 手动打开注射器和歧管之间的阀门。
11. 在 " washout-歧格内洗涤" 文件夹中选择 "设置当前通道"步骤, 然后单击 "运行检测步骤" 打开歧管的所有阀门。
12. 通过从注射器中推5毫升80% 乙醇, 然后用5毫升的细胞培养级水, 手动清洗歧管。
13. 通过从注射器中推5毫升的人内皮性 sfm 培养基清洗歧管。
14. 卸下困在歧管中的所有大气泡。要做到这一点, 将8井引脚适配器放入与介质的10厘米 petri 培养皿中, 并使用注射器进行推拉, 直到所有的大气泡消失 (小气泡不是问题)。
15. 在"washout-歧格内清洗" 文件夹中选择 "设置当前通道" 关闭步骤, 然后单击 "运行检测步骤" 以关闭歧管的所有阀门。
16. 将绿色出口电缆从泵连接到歧管适配器。
17. 将三通阀切换回 off 位置以关闭注射器。
18. 选择wadout/电缆冲洗文件夹, 然后单击 "运行检测步骤" , 分别使用 rpmi 介质清洗每个端口, 确保从每根电缆中取出所有气泡 (分配量 = 100μl)。
    请注意:歧管的每个阀门都是逐个、1到8打开的, 介质的100μl 通过每个单独的通道分配, 同时保持其他通道的关闭。确保液体从每个引脚上运行。如果没有液体出来, 则表示有气泡或堵塞。

7. 用于实时成像的微流控芯片的制备

1. 确保微流体设置已准备就绪, 活成像室预先平衡至 37°c, 二氧化碳_含量达到 5% (图 3a,b)。
2. 从孵化器中取出生物芯片, 并将其放置在显微镜芯片支架中。将芯片支架安装在显微镜成像阶段 (图 3c)。
3. 为了通过歧管将生物芯片连接到泵, 请将8针适配器靠近芯片的出口库, 并在介质中深化所有引脚 (但不要完全连接)。
4. 选择冲走连接到芯片文件夹, 然后单击 "运行检测步骤", 在连接芯片之前分发 rpmi 介质 (分配量 = 30 毫升)。一旦介质被分配, 将8针适配器插入生物芯片的出口。
   请注意:在此步骤中, 所有通道都设置为"开" (打开), 并通过每个通道分配媒体的 30μl, 并在此过程中将通道设置为"关闭(关闭)"。这确保了微流体芯片的通道不会引入气泡。
5. 用移液器从生物芯片的所有入口储罐中手动吸气介质。
6. 选择冲走芯片冲洗文件夹, 然后单击运行检测步骤, 通过每个通道逐一填充40毫升的 EC-SFM 完整介质, 以消除通道中的死细胞碎片 (冲洗量 = 40μl, 最大冲洗剪切 = 40 dynes/cm²)。

8. 流动粘附检测与图像采集

1. 用移液器从感兴趣的通道的入口储集层中手动吸气介质。
2. 从步骤5.6 添加100μl 白细胞到感兴趣的通道的入口储罐。
   请注意:轻轻混合细胞, 形成单细胞悬浮液。
3. 在细胞检测中"步骤说明" 文件夹中, 选择 "设置当前通道" 步骤说明, 然后在通道列表中, 仅选择感兴趣的当前通道, 并将其设置为"打开" (打开), 并将所有其他七个通道设置为"关闭" (关闭)。
4. 选择单元格检测"步骤说明" 文件夹,然后单击 "运行检测步骤"。
   请注意:确保可变流量分配施加恒定的负压, 将白细胞悬浮液从入口储层中拉出 5分钟 (剪切集 = 常数, 剪切应力 =-0.5 dyne/cm 2, 持续时间 = 00:05:00,扫描延迟 = 00:00)。剪切应力的负值确保了流动的正确方向。
5. 从入口储罐中吸收剩余的白细胞。
6. 在进气库中加入100μl 的完整 rpmi 介质。选择单元 assay\ 步骤描述文件夹, 然后单击"运行检测步骤" , 用 rpmi 介质将通道灌满 5分钟, 以便洗掉所有不粘附的白细胞 (剪切集 = 常量, 剪切应力 =-0.5 dyne/cm 2,持续时间 =00:05:00, 扫描延迟 = 00:00)。
7. 从通道的至少三个到四个不同位置获取图像, 以成像粘附的白细胞 (以确保捕获代表性区域)。
8. 重复步骤 8.1-8.7, 对所有其他渠道进行功能评估。
   注: 可以同时运行多个通道。为此, 请在步骤8.3 中打开所有感兴趣的渠道。并执行上述所有步骤8.4-8.7 的多个感兴趣的渠道。

9. 完成微流体泵的检测和清洗

1. 完成实验后, 以 raw 格式导出和保存所有图像。
2. 在保存结果的同时, 运行微流体泵和流形清洗方案。
3. 对于微流体泵, 首先通过在细胞培养级水中注入4毫升, 然后使用4毫升的80% 乙醇来运行 Washout/Pump) 冲洗夹, 如步骤 6.6-6.7 所述, 通过运行空气将泵干燥几分钟。
4. 为了清洁歧管, 用注射器运行冲洗器清洗步骤。按照步骤6.10–6.11 中所述的步骤打开注射器和歧管阀门, 先用80% 乙醇清洗, 然后用细胞培养级水清洗。通过注射器推动空气, 擦干歧管。按照步骤6.10 和6.10 中所述关闭注射器阀和歧管阀。

10. 粘附性白细胞的计数

1. 从 http://cellprofiler.org 下载并安装图像处理软件¹⁴ 。
   请注意:本研究中的图像处理是使用软件版本2.1.1 进行的。如果使用较新的版本, 则管道可能需要进行小的调整。
2. 下载管道计数 _ 白细胞.点击文件进口服务管道从文件和导航 pc 上选择管道计数 _ 白细胞. cpipe.
3. 将带有粘附白细胞 raw 图像的文件夹拖放到输入模块中的 "文件" 列表窗口中用于分析的图像部分。
4. 通过分析模块指定白细胞的典型大小对象。指定粘附白细胞的最小直径和最大直径 (以像素为单位)。
5. 通过分析模块选择筛选条件筛选对象。指定以像素为单位的对象的最低可接受区域。
6. 按下"分析图像" 按钮开始分析。
   请注意:将处理所有 raw 图像, 并将结果保存在默认输出文件夹中。image. txt输出文件包含每个处理图像中粘附白细胞的数量 (每个数字对应于一个图像, 即每个获得的视场)。

结果

首先, 应检查 hicpc-ec 对促炎药 tnfα刺激的反应, 如前面所述.tnfα治疗12小时触发 e 选择素的升高与峰值在6小时后开始治疗。此外, icam-1 在治疗后6-12小时被放大。虽然我们没有观察到 vcam-1 的预期扩张, 但它通常发生在原发人脐静脉内皮细胞 (huvec) 中。我们发现一夜 (12小时) tnfα治疗是白细胞粘附试验中最方便的一种。

最佳的 hpsc-ec 离解应导致单细胞悬浮液不含细胞团块。图 2c说明了注射后的最佳 hepsc-ec 密度。通常情况下, 注射15分钟后, hpsc-ec 连接到通道底部并开始传播 (图 2d)。注射1小时后, hicpc-ec 沿通道形成一个良好的分布单层, 并将准备开始流动分析 (图 2e)。

用荧光示踪剂标记白细胞有利于自动图像定量中的相位对比图像, 因为它使细胞识别步骤更容易, 特别是因为白细胞粘附在 ecs 的单层, 而且往往很难用于软件区分不同的细胞类型。

免费的开源图像处理软件对于粘附白细胞的自动定量非常有用。这里的协议中描述的管道是基于主要对象识别使用白细胞荧光图像的自适应阈值 (图 4 a)。根据最小区域对已识别的物体进行筛选, 还可过滤掉错误识别的物体, 如细胞碎片、自动荧光或任何其他非特异性荧光信号 (图 4c, d)。

一个具有8个平行通道的微流体芯片可以比较两个独立的群体, 例如, 与独立的高 psc 不同的 ecs, 如健康的捐献者或遗传疾病患者。其他控制, 如未经治疗的 ecs, 或使用 icam-1 阻断抗体的预处理也可以包括^10,11。可以一次处理两到三个微流体芯片。为了得出结论的稳定性, 建议在独立的日子里至少进行三次独立的生物实验。

图 1: 制备用于流动检测的 hicc-ec 和白细胞.(a) 用促炎刺激 (tnfα) 预处理 hicsc-ec。(b) hipsc-ec 酶解酶解、离心和再悬浮的原理图表示。(c) 通道涂层 (c, 左) 的示意图表示, 在微流体芯片中加入 hepsc-ec 后, 注射 hepsc-ec 悬浮液 (c, 中) 和细胞培养介质。(d) 白细胞洗涤步骤的示意图表示, 用荧光染料 dioc6 标记和再悬浮液。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 带有 hpsc-ec 的微流控芯片.(a) 10 厘米培养皿中的微流体芯片。(b) 用于孵育的加湿室。(c、d、e)注射后在微流体通道中的 hicsc-ec 图像代表图像 0分钟 (c)、15分钟 (d)、1小时 (e)。刻度栏 = 200μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 活细胞成像和白细胞灌注试验的实验设置.(a、b)照片 (a) 和原理图表示 (b) 活细胞成像和流动分析的实验设置: (1)-倒置荧光显微镜与安装活体成像室 (5% co₂, 37°c, 加湿), (2)-微流体泵, (3)-8 通道流形, (4)-pc 用于显微镜控制和图像采集, (5)-pc 用于微流体泵控制。(c) 微流体芯片, 其插入的8通道歧管的导管固定在板座上, 并安装在显微镜的机动阶段。(d) 流动分析的主要步骤的原理图表示。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 图像分析和白细胞粘附的自动检测.(a) 具有指定设置的图像处理软件的对话框窗口, 用于识别白细胞。(b) 图像处理软件的对话框窗口, 该对话框具有基于最低接受表面积 (sa_min = 70 px) 的已识别对象的指定筛选标准。(c) 正确识别白细胞和过滤小表面积 (sa) 的非特定物体的例子 (像素 (最小值、最大值) = (9, 15) 的典型直径;过滤标准 sa_min = 70 px)。接受的对象以绿色表示, 丢弃的对象以紫色表示。(d) 由于典型直径范围不正确而不正确识别白细胞的例子 (像素 (最小值、最大) = (3, 15) 的典型直径;过滤标准 sa_min = 70 px)。接受的对象以绿色表示, 丢弃的对象以紫色表示。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

该协议描述了 hipsc-ec 治疗与促炎症刺激的特性, 如 tnfα, 功能评估白细胞粘附在流动分析中使用现场成像和自动计数的粘附白细胞。

用 tnfα对 hapsc-ec 进行隔夜刺激, 导致外观拉长, 通常表明 ecs 中激活了促炎表型。在优化阶段, 最好将 e-selectin、icam-1、vcam-1 的表达水平由 fac^7、8和初级人脐静脉 ecs (huvec) 作为阳性对照来验证。

应达到最佳的 hispc-ec 离解和播种密度, 以实现在不形成细胞团块和通道块的情况下的融合单层。在灌注前重新悬浮白细胞是至关重要的, 以避免细胞沉淀, 并在检测每个通道时保持恒定的浓度。人类外周血白细胞, 如单核细胞和中性粒细胞, 可以使用, 或已建立的单核细胞系, 如 thp-1 或 hl-60 可以作为替代品。

在微流体装置的组装和流动检测过程中, 必须防止气泡被困在微流控管和通道中, 因为它们可能导致 hispc-ec 和或粘附白细胞的分离。在准备微流体装置的过程中, 流体到流体的界面或加入额外的洗涤步骤, 可以帮助防止气泡。

建议该协议由两个操作人员运行, 一个由一个操作人员准备细胞, 另一个操作人员准备微流体系统和流动检测。这确保了 ec 在加工前在恒定的时间内被镀制成微流体芯片, 并提高了结果的准确性和重现性。此外, 这还允许设置盲目的实验, 以避免结果中的偏差。

对于自动图像处理管道的成功细胞检测, 重要的是要获得具有高信噪比的聚焦图像, 并避免非特定对象 (如细胞团块) 的自动荧光。至关重要的是正确的规范最小和最大的限制的典型大小的粘附白细胞, 需要确定。人们可以使用 imagej 中的线测量工具来估计白细胞的典型大小。例如, 在我们的分析中, 我们使用了9-15 像素的范围, 这相当于10.3–17.1 微米的物理尺寸 (图 4c)。当使用错误的范围 (例如, 3-15 像素 (3.4-17.1 微米) 时, 单个白细胞不是被标识为一个细胞, 而是将其子部分标识为单独的对象 (图 4d)。这将导致要标识的对象的错误数量。

使用所提供的自适应阈值方法可以检测到许多比白细胞强度低、表面积小的物体。这可能是由于自体荧光或任何其他非特定荧光信号造成的。然而, 这些非特异性物体, 如果它们的面积低于单个白细胞的典型面积, 可以通过定义最低可接受的表面积进行过滤 (图 4c)。

这里描述的流动检测可以直接评估白细胞对 ec 单层的粘附, 阐明这两种细胞类型的相互作用, 但没有考虑到其他细胞类型, 如存在于血管壁中的周周, 也可能存在于血管壁上参与白细胞外渗的调节¹⁵。将三维培养微环境与其他细胞类型相结合, 可以提高系统的生理相关性。尽管存在这些限制, 但此处描述的用于评估炎症反应的流分析为 hipsc-ec 的基本表征和疾病建模应用提供了一个有价值的工具。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vena8 Endothelial+ biochip	Cellix Ltd	V8EP-800-120-02P10
Mirus Evo Nanopump	Cellix Ltd	MIRUS-EVO-PUMP	1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables.
8-channel manifold MultiFlow8	Cellix Ltd	MIRUS-MULTIFLOW8
Humidified box	Cellix Ltd	HUMID-BOX
Fluorescence imaging system Leica AF6000	Leica Microsystems
Electron-multiplying charge-coupled device camera	Hamamatsu	C9100
Biological safety cabinet/laminar flow-hood	Cleanair
CO2 cell-culture incubator	Panasonic	MCO-170AICUV
Centrifuge	Hitachi	himac-CT6EL
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL)	Gilson international	4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl)
Sterile plastic pipette	Greiner Bio-One	606180 (5ml), 607180 (10ml)
Petri dish	VWR/ Duran Group	391-0860
Culture flasks (75 cm2)	CELLSTAR	658,170
Centrifuge tube (15 mL)	CELLSTAR	188271
Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G1890
Fibronectin (Bovine plasma)	Sigma-Aldrich	F1141
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-169
Human Endothelial-SFM	Life Technologies	11111-044
Human VEGF 165 IS, premium grade	Miltenyi Biotec	130-109-386
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-842
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine	Biomedical Technologies	BT-214
Recombinant Human TNF-α	Tebu-bio	300-01A-A
TrypLE Select	Life Technologies	12563029
DiOC6(3)	Sigma-Aldrich	318426
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	21875-034
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Life Technologies	31350010
FBS	Life Technologies	10270-106
L-glutamine	Life Technologies	25030-024
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Life Technologies	15070-063
Distilled water	Life Technologies	15230-089
Ethanol absolute	Merck	1.00983.2500
VCAM-1	R&D systems	FAB5649P
E-Selectin	R&D systems	BBA21
ICAM-1	R&D systems	BBA20
Name	Company	Software version	Comments
Cellrofiler	CellProfiler	2.1.1
VenaFluxAssay Software	Cellix Ltd	2.3.a