线虫模型中气单胞菌感染的毒力及发病机制评价

摘要

在这里, 我们介绍了三个不同的实验来研究空气单胞菌感染的线虫。利用这些方便的方法, 很容易评估aeromonas物种之间和内部的毒性。

摘要

人体病原体气单胞菌已被临床证明可引起肠胃炎、伤口感染、败血症和尿路感染。据报道, 大多数人类疾病与四种细菌有关:沙科氏气菌、嗜水气单胞菌、马尖气单胞菌和鱼子酱。菌型菌是一种具有良好感染模型的细菌, 为研究气单胞菌的细菌发病机制提供了良好的感染模型。在这里, 我们介绍了三个不同的实验, 以研究气单胞菌感染使用线虫模型, 包括生存, 液体毒性, 和肌肉坏死检测。三种测定气单胞菌毒力的方法的结果是一致的。在引起临床感染的4种主要aeromonas物种中,达克斯被认为是毒性最大的物种。这些方法被证明是一个方便的方法来评估气单胞菌物种之间和内部的毒性, 并有助于我们了解气单胞菌感染的发病机制。

引言

人体病原体气单胞菌已被临床证明会引起肠胃炎、伤口感染、败血症和尿路感染^{1, 2.}据报告, 大多数相关的人类疾病与四种细菌有关: dhakensis 气菌、水氢气单胞菌、veronii型和caviae 气体 ^{2,3,4 个,5}.在气单胞菌传染病中, 软组织感染可导致人类严重发病率和死亡率。值得注意的是, 肌肉坏死是软组织感染最严重的形式.观察线虫感染后的生存和肌肉坏死是推测气单胞菌毒性的一种简便方法。

科学家们已经开发出许多模型生物来研究细菌感染。在以往的研究中, 小鼠、斑马鱼和线虫被用作动物模型, 研究aeromonas^6、7、8的发病机制和毒力。每一种动物模型都有其优势和应用。该生物模型, 线虫, 是一种具有天然的细菌摄入的细菌线虫。线虫在进化过程中已经形成了一种复杂的抗细菌感染的先天免疫系统。在细菌感染的压力下,线虫已被证明是研究aeromonas^6、7、9等病原体细菌发病机制的良好感染模型如真菌¹⁰和肠出血性大肠杆菌o157: h7 11.然而, 目前还没有一份出版物关注使用作为研究 aeromonas 毒力的模型的方法.

在这里, 我们介绍了三个不同的实验, 以研究aeromonas感染使用线虫作为动物模型: 检测生存, 液体毒性, 和肌肉坏死. 这些方法是评价气单胞菌物种之间和内部毒性的一种简便方法, 有助于提高对气单胞菌发病机制的认识。

研究方案

1. 培养基的制备

注: 有关溶液的制备, 请参见表1。

1. 制备 mL 介质¹², 在500毫升去离子水中溶解 1.5克 kh 2 po 4,5.66 克na 2 hpo 4, 2.5 克氯化碳.在121°c 下的高压灭菌器 20分钟, 等到冷却到室温, 然后在首次使用前加入 0.5 ml 的 1 mgso₄ 。
2. 制备线虫生长介质 (ngm)¹², 在1升去离子水中溶解3克氯化碳、2.5 克细菌肽和20克琼脂。121°c 高压灭菌器 20分钟, 等到水浴中冷却至 55°c, 然后在水浴中加入1毫升 cacl₂、1 ml 1 ml (1 ml) (1 ml) (乙醇中5% 胆固醇) 和25毫升磷酸盐缓冲液。旋转混合得好。
3. 将约 5 ml ngm 倒进每个6厘米的培养皿中。避免板材表面产生气泡。在室温下留下盘子1晚, 在4°c 时保存包装。使用前恢复室温。
4. 制备富 nm (engm), 在1升去离子水中溶解3克氯化钠、5克细菌肽、1克酵母提取物和30克琼脂。121°c 高压灭菌器 20分钟, 等到水浴冷却至 55°c, 并在水浴中加入1毫升 cacl₂、1 ml 1 ml (1 ml) (1 ml) (乙醇中的5% 胆固醇) 和25毫升磷酸盐缓冲液。旋转混合得好。
5. 将约10毫升 engm 倒进每一个9厘米的培养皿中。避免板材表面产生气泡。在室温下留下盘子1晚, 在4°c 时保存包装。使用前达到室温。
6. 制备 s 介质¹², 使用前将 40 ml s 基拉、0.4 ml 1 m 柠檬酸钾、0.4 ml 微量金属溶液、0.12 ml 的 1 m cacl 2、0.12ml 的 1 m mgso 4、40μl 的5% 胆固醇在乙醇中混合, 1 ml 为 8 mm fudr.

2. 线虫 6 ^{、9、12 的}同步

1. 在一个15毫升的试管中, 用10毫升的无菌去离子水清洗大约 2, 000只虫子。将细菌冲洗 3倍, 将蠕虫保持在管底。
2. 以 500 x 克的速度将样品离心 1分钟, 以拉下蠕虫。去除上清液, 并将蠕虫保存在 3.5 ml 去离子水中。
3. 在试管中加入1毫升 naocl (10–15%) 和 0.5 ml 5 m koh。通过晃动均匀地搅拌 lt;6, 使蠕虫体裂解。
4. 鸡蛋从蠕虫中释放后, 加入 1 0 毫升去离子水阻止裂解。以 1200 x 克的速度离心 1分钟, 以拉下鸡蛋, 并尽可能地去除上清液。用15毫升 mL 介质清洗至少3倍。
   注: 关于 m9 介质的组成, 请参见步骤1.1。
5. 将鸡蛋保存在1毫升 mL 介质中。将鸡蛋输送到3.5 厘米的盘子, 以便在20°c 下孵育一晚 (约 12-18小时)。
   注: 孵育后, 卵将孵化成虫幼虫, 这被称为第一个幼虫 (l1) 阶段。
6. 在 m9 培养基中输出10μl 的 l1 蠕虫。计算蠕虫数, 计算 m9 培养基中 l1 蠕虫的浓度。
7. 种子最多 10, 000 培养 l1 期蠕虫与一个管道在一个9厘米 engm 板上传播与大肠杆菌op50。
   1. 在这一步中, 用 luria-bertani (lb) 肉汤在9厘米的 engm 板上传播0.5 毫升隔夜培养的大肠杆菌 op50. 在37°c 下将板材孵化16–18小时
      注: 为避免污染, 应在层流罩中进行铺展步骤。
   2. 播种 l1 蠕虫前冷却至室温。在 engm 板上的种子最多 10, 000 培养 l1 期蠕虫与大肠杆菌op50。
8. 在20°c 下将蠕虫培育44小时或直到它们生长到第4个幼虫 (l4 ) 阶段。
   请注意:关于 engm 介质的组成, 见步骤1.3。蠕虫在 l4 阶段的身体两侧有一个半月形的白点。
9. 在以下检测中使用同步的 l4 阶段蠕虫。用野生型 n2 蠕虫与大黄的虫进行存活试验, 用菌进行液体毒性试验. 使用 rw1596 蠕虫 (myo-3(st386);stEx30[myo-3: gfp: myo-3 + 6(su1006)]) 与产气体肌肉坏死试验。

3. c. 线虫与气单胞菌^的生存检测 6^,9

1. 在 engm 上的 l1 蠕虫与大肠杆菌op50 传播的当天, 在37°c 的温度下, 分别选取四个aeromonas菌株或大肠杆菌op50 中的一个菌落和2毫升 lb 肉汤培养16小时。
   请注意:为避免污染, 此步骤应在层流罩中执行。在这里, 使用了以下菌株:大肠杆菌op50, 正常的食物来源的线虫。大白菜aak1, 第一个完全测序的病原体临床a. dhakensis分离。a. phinphila a2-066、 a. veronii A2-066 和a. caviae a2-9307121 是国立成功大学医院的具有代表性的临床分离株。
2. 测量细菌肉汤_的od 600 吸收率, 用 lb 液将细菌肉汤调整到 od₆₀₀ = 2.0。
3. 发现并传播30μl 的细菌肉汤, 每个6厘米 ngm 板。在室温下隔夜给盘子培养。
   请注意:有关 ngm 介质的组成, 请参见步骤1.2。
4. 在 l1 蠕虫生长到 l4 阶段的那一天, 随机挑选50个蠕虫并将其转移到 ngm 板, 分别有四个aeromonas菌株或大肠杆菌op50。
5. 在20°c 下培育 ngm 板, 直到检测完成。
6. 将所有的活虫转移到一个新准备的带有细菌的 ngm 板, 每天数一数活的、死的和传感器蠕虫的数量, 直到最后一条蠕虫死亡。
   请注意:每天将蠕虫转移到新鲜准备的 ngm 板, 以维持感染, 即使使用无菌蠕虫 (例如, glp-4, 或与 fudr)。
7. 根据日数据计算绘制生存曲线。

4.用气单胞菌进行 c. 线虫液体毒性测定⁷

请注意:为避免污染, 应在层流罩中执行步骤。

1. 在 engm 板上播种 l1 蠕虫与大肠杆菌op50 一起传播后的第二天, 在四个aeromonas菌株和大肠杆菌op50 中各选择一个菌落, 并在37°c 下分别用5毫升 lb 肉培养16小时。
   注: 在该协议中, 使用了以下细菌菌株:大肠杆菌op50, 线虫的正常食物来源。大白菜aak1, 第一个完全测序的病原体临床a. dhakensis分离。a. phinphila a2-066、 a. veronii A2-066 和a. caviae a2-9307121 是国立成功大学医院的具有代表性的临床分离株。
2. 测量细菌肉汤_{的 od 600}吸收率。
3. 以 3, 500 x 克离心细菌肉汤 15分钟, 取出 lb 肉汤。用 s 培养基将细菌再利用, 将细菌肉汤调整到 od₆₀₀ = 3.0。在96孔板的 s 介质中加入195μl 的细菌肉汤, 以达到至少8口井。
   请注意:有关 s 介质的组成, 请参见步骤1.6。
4. 用 m9 培养基用大肠杆菌op5 清洗 engm 板上的 l4 蠕虫。将蜗杆溶液调整为每μl 5 蠕虫的浓度, 并在96孔板的每一口井中添加5μl 的蜗杆溶液。确保每口井大约有25个蠕虫。
5. 在25°c 的转速为200转时将96孔板筛上。
6. 用以下公式计算每口井的存活率: (活蠕虫/总蠕虫) x100%。
7. 使用每日数据计算绘制散点图。

5.气单胞菌肌肉坏死检测6

请注意:为避免污染, 这些步骤应在层流罩中执行。

1. 在 l1 蠕虫播种的那一天, engm 与大肠杆菌op50 一起传播, 选择四个aeromonas菌株和大肠杆菌op50 中的每一个菌落, 并在37°c 时分别用2毫升 lb 肉汤培养16小时。
   请注意:在这里, 使用了以下菌株:大肠杆菌op50, 正常的食物来源的线虫。大白菜aak1, 第一个完全测序的病原体临床a. dhakensis分离。a. phinphila a2-066、 a. veronii A2-066 和a. caviae a2-9307121 是国立成功大学医院的具有代表性的临床分离株。
2. 测量细菌肉汤_的od 600 吸收率, 并用 lb 肉汤将细菌肉汤调整到 od₆₀₀ = 2.0。在6厘米 ngm 板上发现并传播30μl 的细菌肉汤。在室温下隔夜给盘子培养。
3. 在 l1 蠕虫生长到 l4 阶段的那一天, 将50个蠕虫转移到每个 ngm 板, 每个蠕虫具有四个aeromonas菌株或大肠杆菌op50。在20°c 下培育 ngm 板。每24小时将蠕虫转移到新制备的带有细菌的 ngm 板。
4. 使用荧光显微镜拍摄肌肉图像。
   1. 在幻灯片上随机选择10只蠕虫到 m9 培养基中2% 琼脂糖凝胶上。在拍摄图像前, 在琼脂糖上使用 m9 培养基中的 2μl 1% 氮化钠使蠕虫瘫痪不到5分钟。
   2. 使用绿色荧光蛋白 (gfp) 滤镜, 用电荷耦合设备相机在荧光显微镜上放置一个盖板并捕捉肌肉图像。在 l4 阶段后24小时、48小时和72小时拍摄肌肉图像。
5. 使用图像处理软件进行图像分析和图形准备。
   请注意:分数和肌肉损伤水平的定义如图 3所示, 其标准如下: 3 点缺失的肌肉纤维;2分用于肌肉纤维破裂或断裂;弯曲的肌纤维 1点;健康肌肉纤维的0点。

6. 统计分析

1. 独立执行所有实验至少三次。
2. 用卡普兰-梅耶尔的方法来评估线虫的生存检测, 并使用对数等级测试来分析生存差异。将统计意义定为0.05。
3. 利用学生的 t 检验分析了两组的线虫液体毒性检测的统计结果。使用单向方差分析测试分析一个独立变量的三个或多个值之间的差异。将统计意义定为0.05。

结果

通过遵循上述协议, 很容易区分与四种 aeromonas菌株的毒性。线虫的存活试验如图 1所示。从高到低依次显示的感染 aeromonas物种的线虫的存活率为: a. caviae、a. veronii、a. phphila和a. dhakensis. 虽然aeromonas物种之间和内部的毒性存在多样性, 但线虫的存活率平均显示,感染 a. dhakensis的蠕虫的死亡率最...

讨论

线虫是一种天然摄入细菌作为食物的细菌的细菌线虫, 在其进化过程中对细菌产生了复杂的先天免疫力。维持和支持免疫的两个主要器官是表皮和肠道 9^,13。线虫的表皮和肌肉带类似于哺乳动物和人类的软组织结构.由于这些特点,线虫可作为研究气单胞菌感染发病机制的模型生物。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Shaker incubator	YIH DER	LM-570R	Bacteria incubation
K2HPO4	J.T.Baker	MP021519455	Culture medium preparation
KH2PO4	J.T.Baker	3246-05	Culture medium preparation
Na2HPO4	J.T.Baker	MP021914405	Culture medium preparation
NaCl	SIGMA	31434	Culture medium preparation
MgSO4	SIGMA	M7506	Culture medium preparation
agar	Difco	214530	Culture medium preparation
CaCl2	SIGMA	C1016	Culture medium preparation
cholesterol	SIGMA	C8503	Culture medium preparation
ethanol	SIGMA	32205	Culture medium preparation
KOH	SIGMA	P5958	Culture medium preparation
6 cm Petri plate	ALPHA PLUS	46	agar plate preparation
96-well plate	FALCON	353072	liquid assay
bacterial peptone	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Culture medium preparation
yeast extract	SIGMA	92144	Culture medium preparation
citric acid•H2O	SIGMA	C1909	Culture medium preparation
tri-potassium citrate•H2O	SIGMA	104956	Culture medium preparation
FudR	SIGMA	1271008	Culture medium preparation
disodium EDTA	SIGMA	E1644	Culture medium preparation
FeSO4•7 H2O	SIGMA	215422	Culture medium preparation
MnCl2•4 H2O	SIGMA	221279	Culture medium preparation
ZnSO4•7 H2O	SIGMA	204986	Culture medium preparation
CuSO4•5 H2O	SIGMA	C8027	Culture medium preparation
tryptone	SIGMA	16922	Culture medium preparation
Microscope system	Nikon	Eclipase Ti inverted	microscope imaging
Scientific CCD Camera	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	microscope imaging