与腺相关病毒的向量的生产、纯化和质量控制

摘要

在这里, 我们描述了一种高效和可重现的策略, 用于生产、滴度和质量控制批次的腺病毒相关病毒载体。它允许用户获得高滴度 (≥1 x^{10 13 载体}基因组) 和高纯度的载体制备, 可在体外或体内使用。

摘要

基于腺病毒相关病毒 (aav) 的基因传递工具是将转基因传递到中枢神经系统 (cns) 的热门选择, 包括基因治疗应用。aav 载体是不可复制的, 能够感染分裂和非分裂细胞, 并提供长期的转基因表达。重要的是, 一些血清型, 如新描述的 php。b, 在系统分娩后, 可以在动物模型中跨越血脑屏障 (bbb)。aav 矢量可以在实验室中高效地产生。然而, 需要可靠和可重复的协议来获得纯度水平足够高的 aav 载体, 并获得足够高的滴度值, 以满足体内的应用。该协议描述了一种基于碘沙诺梯度纯化策略的 aav 矢量生产的高效、可重现的策略。与其他纯化方法相比, 碘沙诺纯化方法适用于获得成批的高纯度高滴度 aav 载体。此外, 该协议通常比目前描述的其他方法更快。此外, 还描述了一种基于定量聚合酶链反应 (qpcr) 的策略, 用于快速、准确地测定矢量滴度, 以及银染色方法来确定矢量批次的纯度。最后, 在对 aav-php 进行系统管理后, 向中枢神经系统传递基因的代表性结果。b, 被介绍。在使用本文中描述的协议的所有实验室中, 这样的结果都应该是可能的。

引言

在过去的30年里, 野生类型的 aav 被设计成创建重组的 aav 载体, 这些载体已被证明是将基因转移到 cns^{1、2、3、4}、 ^5,6和基因治疗方法的疾病 (包括 fda 和 ema 批准的疗法)^4,7。它们在中枢神经系统中的适用性在很大程度上来自于它们感染非分裂、有丝分裂后细胞的能力, 这些细胞通常存在于中枢神经系统⁸中。然而, 基于 aav 的载体也有一个优势, 即允许任何特定治疗性转基因 4^{、9 的}长期表达, 同时与其他病毒载体⁷相比, 能引起较温和的免疫反应^{, 8、10、11、12}。

任何 aav 载体的主要元素都是基因组和衣壳。野生 aav 是单链 dna 病毒, 基因组约为5千基 (kb)¹³。对于重组 aav 载体的生产,代表和盖帽基因 (用于基因组复制和病毒 calsid 的组装所必需的) 从野生类型 aav 的基因组中删除, 并以反式方式提供, 为含有转基因^14,15的表达盒。原始病毒基因组的倒置末端重复序列 (itr) 是 aav 载体中唯一保留的元素, 因为这些元素对于复制和包装^3、10、14至关重要。aav 载体可以被设计来增强转基因表达;其中一个 itr 中的突变导致一个发夹循环的形成, 有效地允许生成一个互补的 dna 链^3,7,15。这种称为自我互补 (sc) 基因组的结构的主要优点是, 它绕过了 aav 常规生命周期中典型的二线合成的需要, 大大提高了转基因表达^{的速度和水平1}. 然而, 使用 scaav 基因组将载体的货运能力降低到约 2.4 kb。这包括转基因序列, 以及任何调节序列, 如启动子或微 rna 结合位点, 以限制表达到特定的细胞类型¹⁶。

aav 衣壳确定了载体-宿主细胞的相互作用, 并赋予 aav 血清型一定程度的细胞类型或组织取向, 这也可以被用来限制转基因表达到特定的位置。在自然界中发现了几种 aav 血清型, 而另一些是通过重组方法 (即 php) 在实验室生产的。此外, 一些船长还赋予其他有用的特征, 如穿越 bbb 的能力, 导致在系统给药后在整个中枢神经系统中传递转基因。这已经为 aav9 以及最近描述的 php 展示了这一点。b 衣帽¹⁷。因此, 这些血清型被证明与神经退行性疾病^的新基因治疗方法特别相关,^1、17、18.

该协议的目的是描述一种具有成本效益的方法, 用于小规模生产具有较高滴度和纯度的 aav 矢量。虽然这里介绍的结果使用 php。b 衣壳和 scaav 表达盒, 该协议适用于生产几种 aav 载体血清型和基因组配置, 具有最大的实验灵活性。然而, 矢量产率和最终纯度可能因选择的血清型而异。

该协议本身是用于病毒载体生产的经典三转染方法的一个变种, 并结合了在载体清理中使用碘沙诺梯度的方法, 与传统上使用氯化铯 (cscl) 梯度相比, 该梯度已被采用了报告以更省时的方式产生纯度更高的 aav 载体^19、20、21。

转染、纯化和浓缩步骤打算根据良好的实验室实践 (glp) 在一个组织培养实验室进行, 该实验室的活性受到病毒载体工作的评价。每项任务都需要按照有关病毒载体生产和使用的相关地方和国家立法执行。工作必须在层流罩下和无菌条件下进行。在矢量设施内, 除了常规的组织培养实验室外套外, 还建议佩戴实验室围裙。此外, 任何时候都应戴双手套以及塑料套鞋。

在开始矢量生产之前, 请确保提供所有必要的设备和质粒。1) pcapsid 质粒包含编码复制所需的四种非结构蛋白的代表基因, 即 rep78、rep68、rep52 和 rep40, 以及编码三种结构衣壳蛋白 (vp1、vp2 和 vp3) 的盖帽基因。2) 助流素质粒中含有腺病毒的 e4、e2a和va基因, 促进了 hek293t 细胞中 aav 的产生。3) pTransgene 质粒含有两个 itr 的转基因表达盒。这些质粒可以在实验室中使用在线提供的序列重新合成 22.对于新制造的质粒, 特别是那些含有新转基因的质粒, 需要进行测序, 以确保转基因和 itr 是正确的。另外, 预制质粒可以通过在线质粒存储库直接获得。必要时, 可根据制造商的说明²³使用标准试剂盒对质粒进行放大和纯化。

矢量滴度和纯度会对病媒的传导能力产生不利影响。提供了其他协议来评估所产生的矢量的质量。最终载体将有助于中枢神经系统细胞功能的体外和体内应用研究。

研究方案

解决 方案	组成
细胞培养和转染
dmem1	dmem 1x
	1% fbs (v)
	1% 谷胱甘肽 (v/v)
dem10	dmem 1x
	10% fbs (v)
	1% 谷胱甘肽 (v/v)
150 mm 氯化钙	4.380 g 氯化钠
	高达500毫升超纯水
aav 净化和脱盐
5 m 氯化钠	146.1 g 氯化钠
	高达500毫升超纯水
1 m tris hcl (ph 值 8.5)	12.11 g tris base	谨慎
	高达100毫升超纯水
	使用巴斯德移液器添加 1m hcl, 将 ph 值降低到8。5
裂解缓冲器	15毫升 5 m 氯化钠
	25毫升 1 m tris hcl (ph 8.5)	谨慎
	高达500毫升超纯水
10倍磷酸盐缓冲盐水 (pbs)	80克氯化钠
	2克 kcl	谨慎
	14.4 gna 2hpo4
	2.4 g kh 2po4
	高达1升dd的水
1 m mgcl2	20.33 g mgcl2-6h2o
	高达100毫升超纯水
1 m kcl	7.45 克 kcl	谨慎
	高达100毫升超纯水
5倍 pbs 镁钾 (pbs-mk) 库存解决方案	250毫升 10倍 pbs
	2.5 毫升 1 m mgcl2
	6.25 毫升 1 m kcl	谨慎
	高达500毫升超纯水 h2o
15% 碘沙诺	12.5 毫升 optiprep 密度梯度介质	谨慎
	5 m 氯化钠10毫升
	5毫升5毫升 pbs-mk
	17.5 毫升超纯水
25% 碘沙诺	运算浓度密度梯度介质20.8 毫升	谨慎
	5毫升5毫升 pbs-mk
	19.2 毫升超纯水
	100μl 的苯酚红
40% 碘沙诺	33.3 ml 的 optiprep 密度梯度介质	谨慎
	5毫升5毫升 pbs-mk
	6.7 毫升超纯水
60% 碘沙诺	50毫升的 optiprep 密度梯度介质	谨慎
	100μl 的苯酚红	谨慎
aav 纯度控制
10 x 醋酸特利泰酯 (tea) 缓冲器	44.8 g tris base	谨慎
	11.4 毫升冰醋酸 (17.4 m)
	3.7 g edta
	高达1升超纯水
琼脂糖凝胶	0.8 克超纯琼脂糖
	高达100毫升 1x tea 缓冲器
凝胶缓冲器	181.7 g tris 基地	谨慎
	1.5 克 sds	谨慎
	使用 1m hcl 将 ph 值调整为8.45	谨慎
	高达500毫升超纯水
阴极缓冲器10倍	121.14 g tris base	谨慎
	179.2 g tricine	谨慎
	1% sds (w/w)	谨慎
	高达1升超纯水
阳极缓冲液10倍	242.3 g tris base	谨慎
	高达1升超纯水
	使用 1m hcl 将 ph 值调整为8。9	谨慎
样品缓冲器5倍	20毫升:
	605毫克 tris 碱	谨慎
	4克 sds	谨慎
	10毫克伺服蓝 g
	12克甘油
	将 ph 值调整为 6.8, 使用 1 m hcl, 脂肪, 并存储在-20°c	谨慎
堆叠凝胶	对于2凝胶:
	400μl 丙烯酰丙烯酰胺	谨慎
	750μl 凝胶缓冲液
	1.85 毫升超纯水
	4μl temed	谨慎
	20μl 10% aps (v/v)	谨慎
	在浇注凝胶之前, 立即加入 temed 和 10% aps。在化学引擎盖下使用这两种化学品。
解析凝胶	对于2凝胶:
	3.32 毫升丙烯酰胺	谨慎
	3.35 毫升凝胶缓冲液
	1.14 ml 超纯水
	2.12 毫升50% 甘油
	6μl temed	谨慎
	50μl 10% aps (w/v)	谨慎
	在浇注凝胶之前, 立即加入 temed 和 10% aps。在化学引擎盖下使用这两种化学品。
水饱和丁醇	10毫升正丁醇	谨慎
	1毫升超纯水
注意事项:有关危险化学品使用的准则, 请参阅材料表。

表 1: 所需解决办法的构成。

1. hek293t 细胞的三转染

请注意:有关协议中使用的缓冲区和解决方案的组成, 请参阅表 1 。
请注意:此协议部分的性能大约需要4天。

1. 在37°c 的水浴中解冻一小瓶人胚胎肾 (hek) 293t 细胞。
   请注意:仅使用经过20x 以下的细胞, 以确保最佳转染效率。
2. 种子 hek293t 细胞的密度为 2 x 10 3 至 6 3 3 细胞在 dem10 在 15 厘米直径的细胞培养皿中.
3. 在37°c 的标准孵化器中, 将细胞生长到70-80% 的融合, 湿度为 95%, co₂为5%。
   请注意:使用该协议生产一批 aav 载体需要18个细胞培养盘 (直径15厘米)。70%-80% 的细胞融合对应于 6 x 10 3 至 7 x¹⁰ 3 cellscm 2, 保持在 dmem10 培养基的 17-20 ml 中.
4. 以浓度比例为 1/3.5 (w/w) 的方式制备聚乙二醇胺/dna 混合物。
   1. 在一个50毫升的锥形管中, 通过在 150 mL 氯化钠的18毫升中混合360微米的 f6、180微克的 pcapsid 和180微米的 p胎外基因, 为18个细胞培养皿准备 dna 混合物。
   2. 分布在三个50毫升锥形管 (每个锥形管6毫升的 dna 混合物) 上的 dna 混合物。
   3. 通过将840微克的 pei (1μμl) 混合在150毫升氯化钠的6毫升中, 在新的50毫升锥形管中制备6个细胞培养皿。
   4. 在含有 dna 混合物的锥形管 (1.4.2 准备) 中加入6毫升的 pei 混合物 (1.4.3 步骤制备), 并在室温下孵育20分钟。
      请注意:孵育20分钟后, pei只能混合 dna 变得稍微浑浊。
5. 从孵化器中取出6个细胞培养皿, 在层流罩中从每个培养皿中完全吸出培养基。用5毫升预热的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 (dpbs) 冲洗菜肴, 去除培养基的痕迹。
6. 通过轻轻倾斜盘面, 确保 dpbs 在整个表面的分布。
7. 轻轻吸气 dpbs, 并在每道菜中添加12毫升的 dmem1。
   请注意:避免通过慢慢添加培养基来分离细胞, 从放置在盘子边缘的移液器中分离。
8. 通过向上和向下移液 3x-5倍来混合 pei只能脱氧核糖核酸。以逐滴的方式将 pei\ dna 混合物添加2毫升, 并将其精心分布在整个表面。一旦混合添加到每道菜, 把菜放回孵化器。对剩余的文化菜肴重复步骤 1.4.3 1.8。
9. 在37°c 下将转染细胞培养 5小时, 湿度为 95%_{, co 2 为 5%.}
10. 在每个培养皿中添加额外的12毫升 dem10, 而不去除预先存在的培养基 (总介质体积 = 25 毫升)。
11. 在37°c 下, 以95% 的湿度和5% 的 co2 对转染细胞进行移植, 转染后可达 72小时.

补充图 1:hek 293t 细胞形态学可视化的相位对比显微镜 (左) 与确认 gfp 表达可视化的荧光成像 (右).(a) 荧光成像证实了使用 transfection 编码 pTransgene 成功转染 hek293t 细胞。(b) 仅用转染试剂治疗的 hek293t 细胞没有 transfection 表达。请点击这里查看此图的较大版本.

12. 转染后72小时收获培养基和细胞。使用细胞刮刀小心地将细胞从培养皿中分离。收集介质和细胞在一个50毫升锥形管保存在冰上。
    请注意:两个细胞培养皿的内容可以收集成一个50毫升的锥形管。在这一步结束时, 九管中的每一个都将含有大约50毫升的介质。
13. 在4°c 条件下, 以 420 x g的速度离心锥形管 10分钟, 离心机的加速和减速设置为最大值。
14. 小心地丢弃每个管中的上清液。不要使用移液器来防止材料的丢失。相反, 轻轻地将上清液倒进废物处理容器中, 并将含有细胞颗粒的管道放回冰面上。
15. 通过上下移液 5–10x, 将裂解缓冲液2毫升中的每个细胞颗粒直接重新用于 50 ml 锥形管中。不要漩涡。将三管中的裂解物集中在一起。
    请注意:此时, 将有三个50毫升锥形管, 每个锥形管含有6毫升的再悬浮细胞在裂解缓冲液中。

2. aav 矢量纯化

请注意:此协议部分的性能大约需要1天。在包含重新悬浮在裂解缓冲液中的细胞的三个 50 ml 锥形管中的每一个上同时执行以下步骤 (见上一注)。

1. 冻结和解冻重新悬浮的细胞 3倍, 使其裂解并释放 aav 粒子。将管子放入装有与乙醇混合的干冰的桶中, 以完成冻结步骤。立即将细胞放置在37°c 的水浴中, 进行解冻。
2. 第三解冻步骤后, 离心机在 1, 167 x g 下 , 在4°c 下15分钟。
   请注意:将形成一个由细胞碎片组成的明显的颗粒。在处理管道时, 避免突然移动, 因为这些可能会导致颗粒脱离上清液, 这将损害最终矢量的纯度。
3. 小心地转移上清剂清洁50毫升锥形管, 然后在每个管中添加核酸酶, 最终浓度为 50 u/ml 上清液。
4. 在37°c 下孵化30分钟。每10分钟用手旋转50毫升锥形管, 以确保核酸酶与上清液完全混合。
5. 在4°c 下, 以 13 490 x g离心 20分钟, 澄清上清液。
6. 将0.45μm 过滤器连接到 10 ml 注射器上, 并将其放置在干净的 50 ml 锥形管的顶部。小心地取出柱塞, 用2.5 步中的上清液填充注射器。
7. 使用柱塞迫使裂解液通过过滤器。对于在步骤2.5 中获得的每个管的上清液, 使用新的过滤器和注射器。
   请注意:得到的分数被称为 "粗裂解物"。
8. 根据表 1中的说明, 在四个独立的 50 ml 锥形管中分别制备15%、25%、40% 和60% 的碘氧醇馏分。
9. 使用以下顺序在三个超离心管中制备碘沙诺梯度: 8% 的碘沙诺 15%, 5.5% 碘沙诺的 5.5 ml, 40% 碘沙诺的5毫升, 60% 碘沙诺的 4.5 ml。
   注意事项:碘沙诺会对眼睛、皮肤、胃肠道和呼吸道造成刺激。在处理碘化醇梯度时, 请戴上手套, 在层流罩下工作。
   1. 将15% 碘沙诺的移液器8毫升放入每个超离心管中。
   2. 将25% 碘沙诺溶液的移液器 5.5 ml 放入干净的 50 ml 锥形管中 (图 1a)。
   3. 使用非分级巴斯德移液器 (因为超离心管的颈部对于传统的分级移液器来说太窄), 小心地将25% 碘沙诺溶液的 5.5 ml 分层在15% 碘沙诺溶液之下 (图 1 b)。
      请注意:这可以通过在三个步骤中添加碘沙诺来成功实现, 因为巴斯德移液器只能容纳约2毫升。
   4. 按照步骤2.9.3 中的说明, 添加40% 和60% 的碘醇溶液。在分层过程中, 不要干扰不同的碘沙诺接口。
      请注意:由于碘沙诺馏分中添加了苯酚红色, 通过视觉确认可以确保不同碘氧醇组分的正确制备 (见表 1中的说明)。由于每个分数都有特定的密度, 因此, 如果执行得当, 它们在分层步骤中不会混合 (请检查图 1c)。
10. 用巴斯德移液器将粗裂解液分层在15% 碘沙诺梯度的顶部。继续滴落, 以避免干扰粗裂解液和碘沙诺溶液之间的界面。
11. 用裂解缓冲液将超离心管填充, 直到半月板到达管颈底部, 以确保管不会在超离心过程中产生的非常高的力下塌陷 (图 1c)。
12. 使用适当的盖子关闭超离心管。使用数字刻度, 以确保所有三个超离心管具有相同的重量。如有必要, 通过在 "粗裂解液" 上添加更多的裂解缓冲液来调整重量。
    请注意:超离心管之间的重量差必须低于 0.1 g, 以确保超离心管的安全运行。超离心机是潜在的危险设备, 只能由受过适当训练的人员使用。
13. 在 301,580 x 克的温度下离心管, 使用固定角度的钛转子, 在12°c 下使用最大加速和减速速度1小时和40分钟。
14. 在40% 和60% 的碘醇界面上小心地插入不锈钢钝针。
    1. 将针头连接到5毫升注射器上 (图 1e)。
    2. 只吸收透明的分数, 包含矢量粒子。
       请注意:收集的总量约为2.5-3 毫升。避免从25–40% 的界面收集材料, 因为这将增加最终矢量批次中的污染水平, 因为存在不受欢迎的蛋白质。
    3. 处理收集的分数 (脱盐和浓缩) 或在4°c 下过夜。

图 1: 碘沙诺梯度纯化和后续载体采集的设置.(a) 在将不同的碘沙诺梯度移入超离心管之前, 将每个碘沙诺溶液的适当体积移入一个单独的锥形管。(b) 然后使用巴斯德移液器依次将每个碘沙诺溶液转移到超离心管: 应在上一层下面的管底部添加越来越高的碘沙诺浓度层。(c) 在准备梯度后, 将粗矢量裂解液分层在顶部。这种矢量收集系统不使用锋利的针头, 这就有可能造成 "针头" 的伤害。(d) 通过碘醇梯度插入不锈钢316注射器针, 直至 40%/60% 的碘醇接口。(e) 在40% 碘醇相中发现了载体颗粒, 并收集了。请点击这里查看此图的较大版本.

3. aav 矢量的脱盐和浓缩

请注意:该协议的这一部分的性能大约需要2小时。

1. 通过在 4, 000 x g 处加入 1x pbs-mk 的5毫升和离心机, 使离心过滤器的滤膜优先, 时间为5分钟。
2. 在采集到的 aav 矢量分数中加入5毫升的 1x pbs-mk, 混合后将总体积加入到滤波器中。在添加 1x pbs-mk 后, 观察到浊度。离心机为 4, 000 x 克, 直到锥形过滤器上的体积已减少到1毫升。丢弃在外收集管中积累的流经。
3. 在锥形过滤器中加入13毫升的 1x pbs-mk, 并根据需要重复离心步骤 (最少 3倍), 直到添加新鲜的 1x pbs-mk 时不再观察到浊度。
4. 在最后清洗步骤中, 以 4, 000 x g 的速度添加13毫升的 pbs + 0.01% (v/v) 非离子表面活性剂和离心机, 直到体积减少到300–350μl。
5. 通过将整个体积移入无菌的微离心管, 收集过滤器上的剩余部分。
   请注意:该分数包含脱盐浓缩的 aav 矢量。在此协议的以下步骤中, 此分数称为 "主要" 分数。确保将管在引擎盖下, 并将其存放在4°c。
6. 用 1x pbs-mk 的200μl 冲洗过滤器, 以收集留在过滤器上的残余矢量粒子。收集在无菌的微离心管中。
   请注意:这是一个稀释的矢量股票, 这可能适用于一些需要较低的矢量滴度的应用。在将来的步骤中, 此分数称为 "次要" 分数。
7. 对于短期存储, 将矢量分数存储在 4°c (少于 2周)。当需要长期存储时, 请将矢量储存在-20°c。
8. 按照第4节的说明执行质量控制。

4. 定量聚合酶链反应对载体的滴定

请注意:该协议的这一部分的性能大约需要3小时。

1. 标准曲线
   1. 第1节用于 hek-293t 细胞转染的转基因表达质粒 (psrgene) 进行线性化处理。
   2. 在 0.5 ml 微离心管中制备限制性消化混合物 (有关限制摘要的组成, 请参阅表 2 )。
      请注意:根据所使用的酶和制造商的相关指导原则, 调整限制性消化组合的成分。
   3. 在37°c 下培养限制消化组合1小时。
   4. 在 100v 100 v 的琼脂糖凝胶上运行, 以1小时的速度运行限制性质粒, 以检查限制性质粒的消化效率, 质粒的完全消化应产生一个定义大小的片段。
   5. 按照制造商的说明 24, 使用 pcr 纯化试剂盒纯化线性质粒 dna, 并通过测量260纳米的吸收量, 使用分光光度计测量 dna 浓度.滴定后, 将线性质粒的剩余精华储存在-20°c, 以供进一步使用。
   6. 计算每微升质粒库存的分子 (即 dna 拷贝), 如下所示。
      1. 首先, 计算质粒的分子量。假设 dna 碱基对 (bp) 的平均重量为 650 dalton (da), 而 bp 的一个摩尔重达650克, 则可以通过提取其长度 (bp) 和每个碱基对重量的乘积来估计任何双链 dna 模板的分子量。
         质粒分子量 [g/mol] = 质粒大小 [bp] x 650 [da/bp]
      2. 接下来, 计算每微升质粒的摩尔数。
         每微升质粒的摩尔 = 质粒浓度 [gμ-l]/质粒分子量 [g/mol]
         请注意:分子量的反比是在1克的物质中存在质粒的摩尔数。
      3. 然后, 使用 avogadro 的数量 (6.022 x¹⁰分子摩尔) 计算每微升的质粒分子数。
         每微升质粒的分子 = 每微公升质粒的摩尔 [摩尔/μl] x avogadro 的数量 [分子/摩尔]
      4. 最后, 稀释质粒库存 (分子), 以获得100μl 溶液, 所需浓度为 1 x 10^{9 分子}(每微的矢量基因组 (vg))。
         质粒库存 (100μl) = (所需浓度 [分子/-l] x 100μl)/质粒分子 [分子
   7. 使质粒库存 (1 x^{10 9} vg/μl) 的连续稀释为三重奏:
      10μl 的 1 x 10 vg/l 质粒库存 + 90μl 的 h2 o= 1 x 10 8 vg/μl 溶液
      10μl 的 1 x 10 8 vg/l 稀释 + 90μl 的 h 2 o= 1 x 10 7 vg/μl 溶液
      10μl 的 1 x 10 7 vg/l 稀释 + 90μl 的 h2 o= 1 x 10 6 vg/μl 溶液
      10μl 的 1 x¹⁰ 6 vg/l 稀释 + 90μl 的 h2 o= 1 x 10 5 vg/μl 溶液
      继续获得 1x10¹ vg/l 溶液。
   8. 将标准质粒库存的连续稀释保持在冰上, 直到将其加载到 qpcr 板上 (第4.3 节)。

组件	量
10倍限制性酶缓冲液	5μl
限制性酶	2, 5μl
质 粒	5微克
h2o	高达50μl

表 2: 限制性摘要混合组合物。

表 3: 库存质粒体积计算器.请点击此处下载此表格.

2. 从 aav 载体中提取 dna
   1. 将 aav 载体 (步骤3.5 的主要部分) 与198μl 的 dnase i 缓冲液 (1x) 混合在带材管 (pcr 管) 中, 并添加2μl 的 dnase i。
      请注意:dnase i 将降解任何不包含在载体 c装载 d 中的遗传物质 (这将扭曲 qpcr 结果)。这种溶液被称为稀释 '假 1 x 10 - 2' 。
   2. 在37°c 下孵化 30分钟, 95°c 时再生10分钟。
      请注意:该协议可以在这一点上停止, 材料可以无限期地存储在 4°c, 以避免产品变质。
   3. 在假 1 x 10 - 2 溶液 ( 步骤 4 . 2 . 1 ) 中加入2μl蛋白酶 k , 在50°c孵育 60 分钟 , 在95°c孵育 20 分钟。
      请注意:此步骤将分解 aav 载体封盖, 并将 aav 矢量基因组释放到溶液中。添加过量的蛋白酶 k, 因为样品中的蛋白质 (衣壳) 含量尚不清楚。请注意, 必须确保在 qpcr 之前通过变性去除所有蛋白酶 k 活性, 以避免 (部分) 聚合物酶降解影响最终结果的问题。
   4. 在 1.5 ml 微离心管中制备蛋白酶 k 处理的假体1 x 10-2 溶液 (步骤 4.2.3), 如下所示:
      10μl的 dil1 x^10-2 + 90μl 的 h2o = dil1 x10-3 稀释
      10μl的 dil1 x^10-3 + 90μl 的 h2o = dil1 x10-4稀释
      10μoo f dil1 x 10-4 + 90μl 的 h2o = dil1 x10-5 稀释
   5. 将从载体中提取的 dna 的序列稀释保存在冰上, 直到将其加载到 qpcr 板上 (第4.3 节)。
3. 基于 sybr 绿色检测的 qpcr 滴定
   1. 在 1.5 ml 微离心管中制备 qpcr 主混合物, 用于样品和标准。使用10μl 的 sybr 绿色主混合、1μl 的正向底漆 (10μm 库存)、1μl 的反向底漆 (10μm 库存) 和每反应3μl 的 h2o.有关引物序列, 请参阅表 4中的协议。
   2. 移液器的 qpcr 主混合向上和向下, 但不涡流。
   3. 加入15μl 的 qpcr 主混合物, 然后加入第4.1 节中制备的标准曲线的5μl 或第4.2 节中从 aav 载体中提取的 dna, 加入每口井。包括三个井, 只包含 qpcr 主混合, 作为一个负对照。有关板材布局, 请参阅图 2 。
   4. 用密封膜密封板, 并在4°c 下以 1, 500 x g的速度对 qpcr 板进行简短离心, 时间为30秒。
   5. 使用表 5中建议的条件, 在基于平板的实时 pcr 扩增和检测仪器上运行 qpcr 反应。

底漆名称	序列
正向底漆	5 '-cccctggcatatcaa-3 '
反向底漆	5 '-gcacagtagagtccat-3 '

表 4: 针对 cba 启动子设计的引物序列。

图 2: 基于 qPCR-based 的矢量滴定的板材布局.样品采用彩色编码: 绿色 = 标准曲线;蓝色 = h2o 控制;灰色 = 主要分数;橙色 = 次要部分。请点击这里查看此图的较大版本.

步	时间	温度	周期	目的
预孵化	5分钟	95°c	x1	dna 变性和聚合酶活化 (热启动反应)。
放大	10分钟	95°c	x1	扩增的 dna。如果使用不同退火温度的替代引物, 则可以优化设置。
	10秒	95°c	x40
	40秒	60°c
	1秒	72°c
冷却	10秒	40°c	x1	板材冷却。pcr 的结尾。

表 5: 基于 sybr 绿色 qpcr 滴定法的热循环协议。

4. 确定 aav 矢量滴度的数据分析
   1. 用第4.1 节中制备的标准样品的不同稀释获得的 ct 值填充电子表格数据单元 (表 6a), 以生成标准曲线。
      注: 标准曲线的公式将显示 (y = a ln (x) + b) 以及r²效率 (表 6b)。qpcr 的效率必须接近 100%, r²的效率必须接近 1.0 (≥0.96)。
   2. 使用a和b的计算值填充电子表格中的相应数据单元格 (表 6c)。
   3. 完成电子表格, 其中包含为第4.2 节中制备的 aav 样品的不同稀释获得的 ct 值。
   4. 使用以下公式计算 "主要分数" 每微升矢量基因组中的平均 aav 矢量滴度:
      
      注: 因子400用于单个搁浅基因组, 而 sc 基因组使用的乘法因子为 200^25.事实上, 随着每个 qpcr 周期中 dna 数量的增加, 与 ss 基因组相比, sc dna 检测结果为2倍。滴定法的目的是根据每微升的矢量基因组来计算浓度。在使用2μl 起始材料 (步骤 4.2.1) 时, 运行 qpcr 是必要的。dil表示从4.2.4 步骤开始的稀释因子。"二次" aav 矢量分数 (步骤 3.6) 的滴度可以同时计算。

表 6: 用于 qpcr 数据分析的模板.请点击此处下载此文件.

5. sds-page 和银染色的纯度控制

请注意:该协议的这一部分的性能大约需要5小时。

1. 使用70% 乙醇彻底清洁用于浇铸凝胶的玻璃板。
2. 组装凝胶铸造系统。确保玻璃板的底部没有碎裂, 以防止在铸造凝胶时丙烯酰胺混合物泄漏。
3. 在两个独立的50毫升锥形管中准备堆叠和解析凝胶溶液。省略四甲基乙二胺 (temed) 和 10% (wv) 过硫酸铵 (aps), 因为它们负责凝胶的聚合。在铸造凝胶之前立即添加它们。
   请注意:凝胶中丙烯酰胺的最终百分比会影响蛋白质的分离分布: 通常情况下, 丙烯酰胺的最终浓度为 10% (vv), 足以测试 aav 载体制备的纯度。
4. 轻轻混合, 旋转含有凝胶成分的管。不要涡流, 因为过量的氧合会损害聚合。
5. 在溶凝胶溶液中加入 temed 和 10% (w/v) aps。混合, 然后倒入凝胶支架, 直到它达到1-2 厘米以下的小玻璃板的顶部。
6. 在丙烯酰胺混合物的顶部放置一层饱和丁醇。这将确保在聚合过程中形成平坦的表面。不要将凝胶放在酒精下超过 30分钟, 因为这会使凝胶脱水并损害其功能。
   注意: 丁醇在皮肤接触的情况下是危险的。它还带来火灾风险。小心处理。
7. 等待凝胶聚合, 然后倒出丁醇。小贴士: 检查管中多余的凝胶混合物是否已经凝固。聚合发生在不到20分钟内, 用 h2o 清洗凝胶表面, 然后用纸巾将其干燥, 注意不要干扰凝胶表面。
8. 将 temed 和 10% (w/v) aps 添加到堆叠凝胶中, 并将凝胶倒入分离凝胶顶部的凝胶支架中。
9. 将提供的梳子放入凝胶中。用一个稳定的动作来执行这个动作, 以避免井内形成气泡。
10. 等待至少20分钟的凝胶聚合。小贴士: 检查锥形管中多余的凝胶混合物是否已经凝固。
11. 为主要和次要 aav 矢量分数 (分别为步骤3.5 和 3.6) 准备两个混合 (表 7)。

	高金额	低金额
aav 矢量库存	5μl	1μl
5倍样品缓冲	3μl	3μl
h2o	7μl	11μl

表 7: 银染色所需样品混合物的成分。

12. 在95°c 下加热 5分钟, 使样品混合物完全变性。组装电泳槽, 注意电极方向。
13. 在电极组件内部用1x 阴极缓冲器填充罐, 在外部填充1x 阳极缓冲液。
    注: 阳极缓冲液可从运行到运行回收。必须始终使用新鲜的阴极缓冲液。
14. 从凝胶中取出梳子, 用1x 阴极缓冲液清洁凝胶的井。
15. 在井里装上1μl 的蛋白质阶梯。在同一凝胶上加载不同井中的样品混合物 (图 3)。在 50 v 处运行凝胶, 直到样品进入解析凝胶。然后将电压增加到 100 v, 直到染料前部达到凝胶的下限。
16. 从玻璃板中仔细提取凝胶, 并使用银染色套件 (根据制造商的说明²⁶) 来可视化构成 aav 衣壳的病毒蛋白 (vp1、vp2 和 vp3 亚基), 并检查是否可能(图 3)。

图 3: 使用 sds-page 和银染色评估矢量纯度.利用三氯素-sds 凝胶, 分离了各种载体制剂的5μl。随后用银染色检测到蛋白质。当 vp1 (82 kda)、vp2 (67 kda) 和 vp3 (60 kda) 以 1:1:10 的比例 (车道 1) 可见时, 矢量被认为是纯的, 没有过多的背景 (车道 2) 或非特异性条带 (车道 3)。请点击这里查看此图的较大版本.

结果

直到最近, aav9 还被认为是继外围给药后, 在穿越 bbb 和转移中枢神经系统细胞方面最有效的 aav 载体血清型。当 deverman 等人报告使用了一种名为 cre 重组的基于 aav 靶向进化 (create) 17 的衣帽材选择方法时, 在衣帽口设计方面取得了重大进展。使用这种方法, 他们确定了一个新的 capsid, 名为 php。b, 他们报告说, 它能够在多个中枢神经系统区域中的星形胶质细胞和神经元中通过, 在全身注射¹⁷。在这一点上, 应该注意的是, 即使 php。b 在 c57/bl6 小鼠 (这是最初隔离实验中使用的菌株) 中提供了积极的结果, 初步报告表明, 它的效率可能因应变依赖而有所不同。毫无疑问, 进一步的实验将使人们对这一问题有更多的了解。

然而, 尽管存在这些问题, php。b 为小鼠中枢神经系统的无创基因操作提供了令人兴奋的可能性, 包括疾病模型中的概念验证基因治疗实验。因此, 我们选择使用 php 来评估转基因表达的效率。b对aav9, 自2009年以来, aav9 一直是继外围管理之后的中枢神经系统传导的 "金本位" 载体。为了对这两种血清型进行直接比较, 在转基因表达的最佳条件下, 我们使用了 sc 基因组配置³²。这两个载体都在无处不在的鸡β-肌动蛋白 (cba) 启动子的控制下携带绿色荧光蛋白 (gfp) 的转基因。女性 c57/bl6 小鼠在产后第42天 (体重约20克) 接受了 1 x 10 12 vg的剂量。b-cba-gfp 或 scaav间或9-cb-gfp。尾静脉注射进行病媒给药。这些实验得到了 ku leuven 道德委员会的批准。

注射三周后, 小鼠接受冰凉 pbs 的心肺灌注, 其次是4% 的冰凉二聚甲醛 (pfa)。他们的大脑被收获, 并通过在同一固定剂的隔夜孵育进行进一步的后固定, 然后转移到 0.01% (w/v) Na-azide/PBS 储存, 直到进一步分析。然后, 用振动微体对大脑进行切片, 并在50μm 厚的切片上进行免疫组织化学。

为了评估转基因表达的水平, 用初级抗体对 gfp (兔抗 gfp) 染色, 并使用与荧光染料 (抗家兔亚历克莎氟化物 488) 结合的二级抗体进行检测 (图4 a, b).荧光强度测量 (任意单位 [au]) 证实, 当 sc 基因组和 php 时, gfp 表达显著增加。b 衣壳相对于 aav9 使用。在大脑中观察到 gfp 的增加 (2205±161 对 1441±99 au;p = 0.0032), 小脑 (2601 ±196 vs . 1734±135 au;p = 0.0032) 和脑干 (3082±319 vs. 2485±88 au;p = 0.0038) (图 4c)。

图 4: 系统交付的 scAAV2/PHP。b-cba-gfp 导致 cns 中的 gfp 表达率很高。php。对6周大的 c57/bl6 小鼠进行了 b-cba-gfp 或 scAAV2/9-CBA-GFP (1 x¹⁰ 12 vg/micp") 的应用。在注射后3周的冠状脑切片上, 使用免疫组织化学检测 gfp。(a) 显示大脑和 (b) 小脑和脑干。标度条 = 1 毫米 (c) 对相对荧光强度进行量化, 以确定每个矢量达到的 gfp 信号水平 (每只小鼠10个部分; 每个向量组3个小鼠)。进行了单向方差分析测试, 随后进行了双尾学生 t 测试; 数据表示为均值±标准偏差;* *p < 0.01;金。任意单位。用于 aav 载体生产的 pcapsid 包含了来自血清型2的基因代表和来自血清型 php 的基因帽。b 或 aav9, 相应。这一数字已从 rincon 等人32人处修改。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

这里描述的重组 aav 载体的生产使用了大多数分子生物学实验室和细胞培养设施共有的材料和设备。它允许用户获得纯的、临床前级的 aav 载体, 可用于针对一系列体外和体内应用中的多个细胞和组织类型. 与其他协议相比, 该协议的最大优点之一 (即基于 CsCl-based 的纯化) 是所需的工作时间较短。在 hek293t 细胞的初始转染后, 可在最多6个工作日内获得即用 aav 矢量。

有几个因素会对 aav 矢量的最终产量或质量产生负面影响。转染效率低是病毒产率低的主要原因之一.一个主要的建议是使用 hek293t 细胞, 这些细胞在转染21时没有经过20多次以上的传代, 细胞融合^也没有超过90%。此外, 所选择的转染方法对结果有重大影响。此协议基于 pei 的使用。pei 是一种阳离子聚合物, 能够通过生成聚合物和核酸 (称为多团) 的复合物将外源 dna 传递到细胞核中, 这些复合物被细胞吸收并通过内皮体34进行贩运.与其他广泛使用的方法相比, 基于 pei 的转染操作简单、快速, 例如 dna 与^{磷酸钙 35}的共沉淀。此外, 与其他新引入的方法 (如阳离子脂和磁介导^转染 36) 相比, 基于 pei 的转染要便宜得多。

净化策略在协议中发挥着关键作用。与其他方法相比, 碘合醇基纯化往往含有较高比例的空病毒颗粒 (20%)²⁰。这在一定程度上被基于碘素的纯化通常导致 aav 载体制剂的颗粒与传染性比小于100而抵消。与传统的基于 csl 的程序相比, 这是一个重大的改进, 据报告, 传统的粒子传染性损失很大,³⁷。纯化 aav 载体的另一种常见替代方法是基于色谱的纯化。但是, 此方法的主要缺点是, 使用的每个向量 catid 都需要一个特定的列: 例如, 虽然 aav2 使用肝素列进行了经典隔离, 但此方法不适用于不具有肝素结合的 aav4 和 aav5在他们的反复无常38网站。考虑到色谱纯化也很昂贵, 碘化醇基纯化通常更适合希望生产小规模 aav 载体的实验室^33、39、40. 然而, 为了最大限度地提高载体的最终产率和纯度, 在制作碘化醇梯度时需要格外小心。各种碘化醇馏分应转移到超离心管使用无菌巴斯德移液器, 其尖端接触管壁: 碘沙诺应缓慢而连续地从移液器中排出。当矢量颗粒积累在40% 碘沙诺层, 需要注意确保梯度接口不混合²⁰。最后, 应通过插入一个不超过 20 g 的不锈钢钝针来回收含有矢量的分数。为了最大限度地恢复矢量, 应完整地检索清除分数。在此步骤中, 计时至关重要。为了避免影响制剂的纯度, 必须在收集梯度的其他 (污染) 阶段之前停止收集。

所得到的矢量滴度的差异也可归因于矢量产生包状粒子的内在能力。不同 aav 血清型的比较表明, 一些 aav 载体在更高的滴度下更难产生 (例如 aav2)⁴¹。在脱盐步骤中, 矢量的沉淀可能是滴度较低的一个可能原因, 通过避免过度集中33很容易防止.此外, 还可以观察到, 在血清型之间, 碘二醇梯度基纯化的效率略有不同, 因此, 可以观察到^不同血清型获得的滴度的差异41。

最后, 需要指出的是, 尽管 qpcr 是 dna 定量的一种非常准确的方法, 但可以观察到该技术中的一些固有的可变性。滴定的准确性主要取决于所有溶液的精确移液和适当的涡流。为了保证最精确的滴度读数, qpcr 可以独立重复, 得到的值是平均的。该方案中介绍的引物的选择是基于位于我们实验室使用的 pTransgene 质粒中的 cba 启动子的序列。cba 启动子是一个强大的合成启动子, 广泛用于向量场, 以推动表达跨多个细胞类型。它包含多种元素, 包括巨细胞病毒 (cmv) 早期增强因子;cba 基因的启动子、第一外显子和第一内含子;以及兔β-球蛋白基因的接合受体。然而, 引物可以设计用于几乎任何元素的表达盒内 (包括启动子, 转基因, 和调节元素)。还可以对批次的滴度进行比较, 前提是对有关载体共有的区域使用引物。

总之, 该协议可用于产生具有多种脂质、基因组配置、启动子类型和转基因货物的 aav 载体。这将使用户能够轻松地调整其矢量的最终特征, 以最适合实验需求。在代表性结果中介绍的示例中, php 的使用。b 衣壳有效地穿过 bbb, 在尾静脉注射^32只后, 在中枢神经系统中得到了高效的基因表达。中枢神经系统渗透载体的系统管理在可能的副作用^2、17、32方面具有相当大的优势。外周注射的一个可能的替代方法是鞘内注射, 它包括将 aav 载体输送到脑脊液中。这种传递途径被证明是有效的, 显示了转基因在中枢神经系统的广泛表达, 外周器官的非目标效应较小, 免疫反应水平较低.然而, 鞘内注射更具挑战性, 因为他们需要比尾巴静脉注射更高的技术技能。

进一步的准备工作, 以完善这一技术, 将推动 aav 载体在基因治疗应用中的应用机会。这种方法为治疗目前无法治愈的中枢神经系统疾病提供了有吸引力的可能性, 如肌萎缩侧索硬化症、夏科-玛丽-牙齿病、帕金森症和阿尔茨海默氏症¹⁸。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pCapsid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pHelper	Agilent	240071
Plasmid Plus maxi kit	Qiagen	12963
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104
AAV Helper-Free System	Agilent	240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Life technologies	11960-044	Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10500-064
GlutaMAX supplement	GIBCO	35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium	GIBCO	14190094
HEK293T cells	American Tissue Culture Collection	CRL3216	Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes	Greiner Cellstar	639160	15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers	VWR	10062-904
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966-2	PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution	Fisher Scientific	NC9821357	Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons	Fisher Scientific	11735423	Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes	Fisher Scientific	15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette	Sigma-Aldrich	Z627992	Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes	Beckman	361625
Benzonase (250 U/µL)	Sigma-Aldrich	E1014	Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter	Pall corporation	4614
Omnifix syringe (5 mL)	Braun	4617053V
Blunt syringe needle	Sigma Aldrich	Z261378	Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer	B. Braun	0082479E	Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Millipore	UFC910024	These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x)	Thermo Fisher	24040032	Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-374	Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL)	Promega	R6421
DNAse I (1 U/µL)	Fisher Scientific	EN0521
Proteinase K	Sigma-Aldrich	3115852001	Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)	Fisher Scientific	AB2000
Eppendorf microtube 3810x	Sigma-Aldrich	Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells	Roche	4729692001	White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film	Bio-Rad	msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678	Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade	Merck	648311	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose	Thermo Fisher	16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth	3029.3	Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G	Sigma-Aldrich	6104-58-1
Precision Plus prestained marker	Bio-Rad	1610374edu
1-Butanol	Sigma-Aldrich	B7906	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP	Synaptic Systems	132002	1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:1,000 dilution
Equipment	Company	Catalog number	Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge *	Hettich	1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge *	Beckmann Coulter	A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *	Beckmann Coulter	337901
Entris digital scale *	Sartorius	2202-1S
Warm water bath *			Set at 37 °C
Ice bucket *	VWR	10146-290	Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro *	Integra	156,400
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	606180	Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	607180	Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	760180	Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 *	Binder	9040-0038	Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E *	Labexchange	31324	Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler *	Bio-Rad	1861096
LightCycler 480 Instrument II *	Roche	5015278001
ThermoMixer *	Eppendorf	C 5382000015
Nanodrop *	ThermoFisher Scientific	ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell*	Bio-Rad	1658001FC	For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit	Sigma-Aldrich	PROTSIL1	High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R *	Eppendorf	B1_022628045	High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	606180	5 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	607180	25 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	760180	25 mL
Filter tips *	Greiner bio-one	750257	1250 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	738257	300 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	771257	10 µL
Ice bucket with lid *	VWR	10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *	VWR	181-0065
Pipetman P2	Gilson	F144801
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipetman P1000	Gilson	F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.