采用多段注射-毛细管电泳质谱法进行高通量和综合药物监测

摘要

在这里, 我们描述了一种用于全面药物监测的高通量方法, 该方法可以提高大型药物滥用药物及其代谢物的分辨率和检测能力, 并在多段注射-毛细管的基础上进行质量控制电泳质谱。

摘要

鉴于公共卫生中令人震惊的类鸦片类鸦片和处方药危机, 迫切需要新的分析方法, 以便能够进行高通但全面的药物筛查。传统的尿液药物检测基于两层免疫分析屏幕, 然后是气相色谱-串联质谱 (GC-MSN) 或液相色谱-串联质谱 (LC-MSN) 方法, 价格昂贵, 容易偏置, 而被影响仅限于有针对性的已知滥用药物小组 (DoA)。在此, 我们概述了一种改进的药物监测方法, 该方法允许在使用多段注射-毛细管电泳质谱 (MSI-CE-MS) 时, 对 Da 及其代谢物的膨胀面板进行解析和检测。通过 ce (< 3-min/tem-t型) 对10个尿液样本进行多路分离, 同时在正离子模式检测下使用飞行时间质谱仪 (TOF-MS) 进行全面扫描数据采集, 从而进行识别和超过建议截止水平的 DoA 的量化。当使用 MSI-CE-ms 与样品段之间的电动间隔时, 可以获得药物异构体和等外生物的出色分辨率, 包括背景干扰, 其中精确的质量/分子式与匹配内部标准和检测一个或多个生物转化代谢物有助于 DoA 识别在更广泛的检测窗口。此外, 尿液样本可以直接分析, 无需酶解聚, 快速筛选, 而无需复杂的样品检查。MSI-CE-MS 可监控高风险患者治疗监测所需的各种 DoA, 包括确认处方药物依从性、披露非法药物使用/替代以及评估最佳剂量制度为精密医学的新进步所必需的。

引言

滥用类鸦片和吸毒成瘾管理慢性疼痛的情况惊人地增加, 对公众健康构成日益严重的威胁, 估计2017年美国有 70 000多人死于^{吸毒过量 1}。同样, 还广泛向儿童和青年开了各种其他精神药物, 用于治疗焦虑、抑郁和心理健康问题²。因此, 广泛为工作场所和法医毒理学开发的尿液药物检测方法对于对容易耐受和依赖的处方药物进行治疗监测至关重要^3,4。这是必要的, 以确保坚持, 最佳的治疗效果, 和病人的安全, 同时揭示潜在的替代, 包括非法或非处方药物滥用。目前, DoA 的尿液药物检测依赖于两级方法, 包括通过护理点设备或实验室分析仪进行初步的竞争性免疫检测筛选, 然后进行基于 GC-MSN/ms 的更具体的确认测试和越来越多的 LC-MSMS⁵。然而, 免疫检测容易产生偏差, 因为抗体试剂与各种药物类别没有具体结合, 从而产生推定的屏幕阳性结果, 从而无法可靠地识别和量化特定药物或复杂药物混合物⁶。在这种情况下, 鉴于综合多药屏幕7的成本过高, 包括设计药物和合成尿液产品,^避免常规的靶向检测, 迫切需要更准确的尿液检测。

在多药和 doa8、9扩展面板的时代, 使用 tof 或轨道敲击质量分析仪与高分辨率 ms (hrms) 相结合的高效分离被认为是药物监测的非针对性策略.然而, 传统的 LC 分离速度缓慢 (> 15分钟), 因为使用梯度洗脱程序解决不同化学种类的 DoA 及其代谢物的洗脱时间较长, 这限制了常规药物筛选的样品吞吐量。或者, 基于解吸电离 (DESI) 10 和激光二极管热解吸 (LDTD)^的直接分析方法允许在不分离^的情况下更快地进行药物筛选11。然而, 这些环境电离方法在分析复杂的尿样时容易受到等温/异构干扰, 因此需要独立的验证性检测。

我们的实验室最近开发了一个多路复用分离平台, 以提高样品吞吐量, 同时保持基于 MSI-CE-MS¹²的高效分离的分辨率和数据保真度。可在 MSI-CE-ms 中设计新的数据工作流, 用于对体积限制的生物异种进行非目标代谢物分析 (即代谢组学), 而质量控制 (qc) 则允许大规模人群所需的批量校正研究¹³。在这种情况下, 在使用常规护套液体界面时, 使用在稳态溶剂条件下发生的具有溶质电离的等底缓冲液进行分离, 该界面允许在一个单一的液体界面中连续注入10个或更多样品。运行的快速但选择性的筛选不同类别的 DoA 及其代谢物¹⁴。本研究的重点是进一步验证 MSI-CE-ms, 以便使用避免酶水解15的 "稀释和拍摄" 方法, 直接分析具有代表性的临床抑郁症患者的真实尿液样本.此外, 还在 MSI-CE-MS¹⁶中的串行样品插头之间实现了一个电动间隔, 以进一步提高各种药物等分子的分辨率, 背景尿干扰, 和/或检查 DoA 的大型面板时的交叉干扰。在使用 MSI-CE-MS 时, 证明了尿液标本中的 DoA 在匹配时的绝对定量。这种方法还有助于药物识别, 并推断正确的样本位置的屏幕阳性的情况下, 相比药物面板混合物在建议的筛选截止水平, 也作为内部参考/质量控制相同的运行。

研究方案

圣约瑟夫医院 (加拿大汉密尔顿) 情绪障碍诊所的 Zainab Samaan 医生亲切地提供了尿样, 他的研究得到了汉密尔顿综合研究伦理委员会的批准。

1. 试剂和样品溶液制备

1. 背景电解质制备
   1. 双周制备50毫升背景电解质 (BGE), 1 M 甲酸, pH 值 1.8, 以 15% v/v 乙腈为有机改性剂。
   2. 将浓缩甲酸 (26.5 M) 的浓甲酸片 (26.5 M) 添加到50毫升的体积瓶中, 加入 7.5 mL 的乙腈和40.6 毫升的去离子水, 使总体积达到50毫升。然后, 将溶液相声 15分钟, 并将其转移到密封紧密的灭菌瓶中。
2. 护套液体制备
   1. 每周准备200毫升护套液体溶液, 包括在 60:40 (Meoh:h2o) 中0.1% 的甲酸。
   2. 将200μl 的甲酸 (26.5 M 库存) 注入含有120毫升 MeOH 和80毫升 H2o 的瓶子中, 使护套液体和脱气15分钟。
   3. 接下来, 在鞘液中加入以下各参考离子、嘌呤和 hexakis(2,2,3,3 四氟丙氧基) 的 10Μl, 以在 m/z 121.05087 和 m/z922.0079 时提供恒定的质量信号,分别。
      注: 这些参考离子允许实时质量校正, 还可以监测分离过程中可能的基质诱导的离子抑制或增强效果。
3. 标准准备
   1. 使用从化学品供应商处购买的药物标准, 在3倍临床筛选截止水平 (L6)¹⁴中的甲醇中制备含有84药物面板混合物的标准溶液。分别制备48个匹配的内部药物标准 (D-is) 的混合物, 其浓度比甲醇1毫升中的84种药物混合物高10倍。此外, 在1毫升去离子化 H2o 中制备含有200μm 的 4-氟-苯基丙氨酸 (F-Phe)和 3-氯-l-酪氨酸 (cl-tyr) 的库存溶液.
   2. 对上述84种药物混合物 (20μl) 和 48-is (20μl) 进行5倍稀释, 以及在经认证的合成尿基质 (40μl) 中稀释 4-氟苯基丙氨酸 (F-phe, 10μl) 和 3-氯氨酸 (Cl-Tyr, 10μl) 的十倍稀释, 使总在250μl 离心管中的体积为100μl。
4. 外部校准曲线准备
   1. 使用84种药物标准混合物和48个按步骤1.3.1 制作的相应 D-is, 在20倍的动态范围内准备五点外部校准曲线 (如下所述), 为20倍动态范围。例如, 为了使一个五点外部校准曲线, 确保稀释84药物混合物 (L6, 步骤 1.3.1) 到 2-, 4-, 10-, 20-和 40倍, 而有必要准备5倍稀释匹配的 D-is (20μl) 和十倍稀释 4-F-he (10μl) 和 Cl-Tyr (10μl) 作为合成尿液基质中的一个额外 IS, 使总体积达到100μl。在匹配的 d-IS 不可用于特定药物的情况下, 使用 4-F-phe 作为数据规范化的代理 IS。
      注: 如果没有通过 CE 分离完全解决其他 doa, 请避免在面板中包含与其他 DoA 交叉干扰 (等压) 的其他 D-is。
5. 尿液样品制备
   1. 解冻从10名具有已知处方药史的临床抑郁症患者中提取出的晨尿样本。收集后将尿液样本存放在-80°c, 直到必须解冻进行分析。
      注: 避免多次冷冻解冻尿液循环或在收集后在室温下延迟储存, 因为它们对某些 DoA 代谢物及其结合物的化学稳定性有影响。
   2. 涡旋被去除的早晨尿液样本 30秒, 然后离心 1分钟, 在 14, 000 x 克的沉积。之后, 上述处理后的尿液中的 aliquot 10μl、10-l 的 d-IS、5μl 的 F-phecl-tyr 和25μl 的去电离 h2o, 以及100分钟的漩涡 (重复这些步骤一式一式一式, 以评估技术精度)。将上述混合物中的 20μl aliquot 转移到聚丙烯小瓶中进行分析。

2. CE-TOF-MS 系统的设置

1. 无涂层熔融二氧化硅毛细管调节参数
   1. 确保使用内径为50μm、外径为360μm 和总毛细管长度135厘米。
      注: 金刚石切割机工具用于确保进一步检查的一致毛细管, 以确保齐平和平滑的切割。
   2. 从整个毛细管端去除约7毫米的聚酰亚胺涂层, 使用毛细管窗口制造商来减少样品结转, 并防止潜在的聚酰亚胺在与有机溶剂接触时膨胀。
   3. 确保将毛细管出口从 CE 喷雾器针中伸出约2毫米, 并通过循环两个360°旋转将毛细管入口安装在 CE 墨盒中。然后, 在 CE 中小心地安装 CE 墨盒, 并在调节毛细管时将 CE 喷雾器从离子源中取出。
      注: 一致地切割毛细管出口, 因为它是关键的, 以确保一个稳定的电喷雾电流耦合到 MS。本工作采用了两种不同的喷雾器: 用 CE 喷雾器进行样品分析, 用 LC 喷雾器进行质量标定。
   4. 确保在不放置在离子源中的 CE 喷雾器的情况下进行毛细管调理。将 LC 喷雾器放入离子源中。
      注: 这允许质量校准, 同时避免任何污染的同轴鞘液体接口, 随后耦合到 TOF-MS。
   5. 通过在供应商的软件上选择用于控制仪器的冲洗功能(940 毫巴) 来条件新的毛细血管, 并按以下顺序将四种不同溶剂的冲洗时间设置为每种 30分钟: 甲醇、1M naoh、去离子化水, 和 BGE。在毛细管调节期间, 请确保将等温泵置于待机状态。
   6. 用浸泡在 Meohx-h2o_中的纸巾擦拭 CE-MS 喷雾器, 以去除任何残留的盐沉积。
   7. 在分析样品之前, 对 CE-MS 系统进行日常预防性维护。使用甲醇擦拭 ce 电极 (入口), 但使用异丙醇和水 (50:50) 混合物清洁 CE-MS 界面, 这对于避免盐积聚和限制潜在样品结转非常重要。
   8. 将 LC 喷雾器从离子源中取出, 并将清洁后的喷雾器与新调节的毛细管放置在 CE-MS 的同轴护套液体界面中。
   9. 打开等温泵, 并施加30千伏的电压 15分钟, 以确保在尿液分析之前实现稳定的 CE 电流配置。
2. 使用 CE 的注射和分离条件
   1. 打开用于控制仪器的供应商软件, 以设置 CE 参数并选择预调节步骤。将刷新功能设置为 600秒, 并指定一个 bge 小瓶位置。
      注: 外部冷水机组可能需要连接到缺乏样品盘冷却功能的 CE 系统, 因为在分析大批量限制样品时, 需要这样做, 以防止样品蒸发。
   2. 将注入函数设置为在100毫巴方向注入样品 5 s, 并在30Kv 的情况下电动地注入 bge 间隔度为75秒。
      注: 在每次样品注射 (从不同的小瓶位置) 中重复此过程, 然后是一个 BGE 间隔器 (来自同一小瓶位置), 该间隔在软件上的方法程序中自动执行, 共在使用 MSI 格式时运行相同。在筛选截止水平的84板药物混合物被注射后, 按随机顺序分析10个尿液样本, 作为每次 MSI-CE-MS 运行的第一个样本位置。
   3. 将施加的电压设置为30千伏,墨盒温度设置为 25°c,总运行时间设置为 40分钟. 使用时间表, 在分离过程中施加 2小时bar\ min 的压力梯度, 从0分钟到40分钟。
      注: 在分离过程中施加梯度压力, 以便对缓慢迁移的药物进行洗脱, 其中包括一些弱的、基本的苯并二氮杂卓和中酸性药物 (例如对乙酰氨基酚、巴比土酸盐)。然而, 大多数基本的 DoA 及其代谢物在25分钟内作为阳离子迁移, 包括安非他明、类鸦片和其他种类的生物碱。
   4. 样品采集完成后, 请确保用 BGE 在低压 (50 毫巴) 下冲洗毛细管, 直到第二天。否则, 用清水 (900 毫巴) 冲洗毛细管 600秒, 然后用空气冲洗 600秒, 并将其存放在喷雾器支架中, 直到下次使用。
3. 等温泵和护套液
   1. 使用无限等元泵和无限地德加尔以 10μl/分钟的速度将护套液体 (60:40meoh:h 2o 和 0.1% v/v 甲酸) 输送到 CE-MS 喷雾器。
4. TOF-MS 设置
   1. 确保具有同轴液体电喷雾离子源和加热氮气的 TOF-MS 配备 ce 单元。
   2. 在超过质量为 50-1, 700 的正离子检测下操作 TOF-MS,数据采集速率为 500 ms/频谱. 确保配置文件和质心数据都以 ". d" 文件格式存储。
   3. 将电喷电离条件设置为: vcap 和喷嘴电压为 2, 000 v, 雾化器气体在 10 psi 时, 干燥气体在300°c 时在 8 lmin 时输送, 在195°c 时的鞘气体流量为 3.5 l%。此外, 将碎片器、脱脂器和 Oct1 Rf 的 MS 电压设置分别设置为120、65和 750 V。
      注: 在 MSI-CE-MS 中使用的串行样品注入序列中, Vcap 和喷嘴电压以及雾化器气体被关闭, 但在电泳分离启动后, 电喷雾被编程为在1分钟后重新转动, 以防止电流发生。由于吸力效果造成的错误。
   4. 使用供应商的软件 (材料表) 执行仪器控制和数据采集。
5. 数据分析
   1. 使用供应商的软件分析 MSI-CE-MS 数据, 包括处理、数据平滑以及具有代表性的 doa 及其代谢物的提取离子电泳图 (Eie) 的集成。
   2. 打开软件并设置以下参数。
      1. 在色谱图下, 选择提取数据格式, 色谱和质谱数据格式为剖面模式。
      2. 在平滑函数和功能宽度为15点的情况下选择Quratic/Cubic Savitzky golay 。
      3. 然后, 单击 "集成 (ms)", 将积分器设置为敏捷, 并选择峰值限制的最大数量到峰值筛选器下的最大11个。
      4. 单击 "查看", 单击 "集成峰值" 列表, 然后选择峰值编号、保留时间(rt)、峰值区域、峰值高度和信噪比(snr)。
      5. 将这些参数保存在唯一的方法名称下。将此方法应用于进程并解释每个数据集。
         注: 包含峰值数字、RT、峰值区域和高度以及 SNR 的汇总表显示在右侧。对每个 DoA 的测量 RT 和集成峰值区域执行数据规范化, 以匹配 d-IS, 或 (如果没有) 到 F-Phe, 以提高分析精度。

3. 尿样和外部校准曲线的分析

1. MSI-CE-ms 中使用的不同串行注入配置
   1. 对于用于证明药物异聚酶体分辨率的第一个系列样品注射配置 (图 1 a), 确保对与 D-is 和 4-F-phhe-tyr 的84种药物标准的混合物进行5次重复注射, 然后进行第六次重复注射注射, 这是合成尿液中的空白样品, 和标准药物混合物的五个额外注射。
   2. 对于第二个系列样本注射配置, 用于演示在已知处方的患者的单个尿液样本中检测到的 DoA (图 2a), 确保第一个样本插头是84药物标准混合物的混合物。1次截止筛查水平 (阳性对照), 然后随机注射患者的10个稀释尿液样本: #293、#88、#309、#43、#281、#64、#221、#208、#183 和 #50。
   3. 对于第三个串行样品注入配置, 用于说明在一次运行中获得外部校准曲线的情况, 确保 DoA 的校准解在相当于 0.25 x、0.5倍、1x、2.5倍、和5倍截止浓度水平, 以及匹配 D-is 和 F-Phe/Cl-Tyr 作为合成尿基质 (n = 4) 中的附加 is。

结果

MSI-CE-MS 可在一次运行中串行注入十个或更多的离散样本, 这大大提高了吞吐量 (和 lt;3 最小样本), 无需复杂的仪器修改、列交换程序或昂贵的基础架构(图 1 a)。在未经修饰的熔融二氧化硅毛细管中, 对离子进行区域电泳分离, 在强酸性电解质条件下进行交替系列流体动力注射和 bge 的电动间隔。1.8). 溶质电离也发生在稳态条件下。在这种情况下, 具有质量校准器的同轴护套液体被用作 CE-MS 的接口, 在正离子模式检测下, 由质量校准离子信号监测, 产生最小的离子抑制或增强效果。TOF 代表了一种强大但具有成本效益的 HRMS, 具有快速的数据采集功能, 非常适合非目标筛选药物监测应用, 当使用 MSI-CE-ms 时。例如, 各种异位异构 DoA 及其代谢物, 包括三种阿片类结构异构体的结构异构体, 即去氢可待因、氢吗啡酮和吗啡, 都实现了令人印象深刻的解决方案 (图 1 b)。在这种情况下, 从药物混合物的10个独立样本中检测到30个解析峰, 无需样品结转。在系列注射 (样品位置 #6) 中还包括合成尿液的空白/阴性尿液控制。另外, 另外两种等压阿片类药物, 即 6-乙酰吗啡 (一种不活跃的海洛因代谢物) 和纳洛酮 (用于阿片类药物过量紧急治疗的阿片类受体拮抗剂), 作为20个不同的峰值, 并获得全面扫描数据 (图 1C)。同样, 在 MSI-CE-MS 中完全解决了两种苯丙胺位置异构体, 以区分非法甲基苯丙胺的滥用和可能滥用芬特明的可能性, 芬特明是一种规定的兴奋剂, 用作减肥的抑制食欲药物。

图 1: 通过分析10个样本和一次运行中的空白, 通过 MSI-CE-MS 求解的具有代表性的 doa 异构物的一系列提取离子电泳图 (eie).(A) MSI-CE-MS 示意图, 描述合成尿液中用于84-Doa 面板的串行注射配置。这种多路分离方法使用11个离散样品和空白的交替系列流体动力注入, 并通过电动注射缓冲液来启动离子的带状电泳分离, 然后是全面扫描数据通过 TTOF-MS 进行正离子模式检测进行采集。(B) 三种等压官能团阿片类异构体 (m/z286.1438), 由 ce 分离, 包括10个离散样品注射中的30个解析峰, 包括诺平酮、氢吗啡酮和吗啡.(C) 两种异压类阿片类药物及其代谢物 (m/z328. 1543), 由 ce 分离, 包括10个离散样品注射中的20个解决峰, 包括 6-乙酰吗啡 (海洛因代谢物) 和纳洛酮.(D) 由 ce 分离的两种等压官能团安非他明异构体, 包括10个离散样品注射中的20个解决峰, 包括甲基苯丙胺和芬丁基。在所有情况下, 在 MSI-CE-MS 的第六样本位置引入的负尿液控制空白处的样本结转证据微不足道。请点击这里查看此图的较大版本.

为了筛选 DoA, MSI-CE-MS 中的串行注射配置在建议的筛选截止浓度水平 (作为所有运行的第一个注射位置) 使用了84药物面板混合物, 然后对10种具有代表性的尿液进行了随机分析来自有已知处方病史的临床抑郁症患者的样本。例如, 通过检测一个大 #208 的信号峰值 (来自注入 #9) , 该信号峰值与美沙酮-d3 的混合, 低质量误差 (lt;5 ppm)。在同一运行中, 在任何其他尿液样本中都没有检测到其他信号。将美沙酮浓度在将其在样品 (注射 #9) 中测量的离子响应比与参考药物文/mfqc (注射 #1) 进行比较并按四倍尿稀释系数校正时, 超过了建议的截止时间限制的13x。因此, 这一结果证实了患者坚持美沙酮维持治疗。非处方苯丙胺摄入量的证据 (图 2b) 显示在苯丙胺水平升高 (m/z136.1121) 上, 在 msi-ce-ms 运行中, 只有一个病人 (病人 #50, 注射 #11) 被发现。测量浓度略微超过建议的截止水平 (1.3倍)。这种与安非他明-d5 的组合, 并有一个低质量误差与排名靠前的分子式匹配。抗抑郁药物文拉法辛 (m/z278.2115) 的阳性检测结果, 选择性血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂, 也在患者 #281 (注射 #6) 中得到证实。在这种情况下, 浓度超过了建议的截止水平 (15x), 这是由其精确的质量或分子公式匹配, 以及与组合静脉卡非胺-d6 (图 2C)。对于在 EIE 跟踪中也检测到的未知等深线, 后一种标准不符合, 这突出表明, 在仅仅依靠其精确质量时, 需要谨慎行事。此外, 明确检测规定的前加巴林, 这是为治疗神经病理性疼痛, 以及广义焦虑, 也证明了患者 #309, 基于其严重升高的浓度 (64x) 高于建议截止级别 (图 2d)。然而, 在同一过程中分析的其他9个病人尿液样本中没有发现。与其他结果阳性病例类似, 注射 #4, 与 pregabalin-d6 相结合, 这包括在所有尿液样本中的 msi-ce-ms。

图 2:7. 一系列提取的离子电泳图 (eie), 用于具有代表性的来自10例临床抑郁症患者的屏幕阳性药物检测结果, 这些结果在使用 MSI-CE-MS 时得到确认, 其中包括建议使用的84种药物面板截止水平, 作为第一个样品注射位置作为内部参考/qc.(A) 与美沙酮-d3 相对应的 eie 覆盖, 美沙酮与美沙酮相结合, 突出表明只有一个尿样 (注射位置 #9) 的美沙酮浓度升高, 远远超过截止水平。(B) 与苯丙胺-d3 相对应的 eie 覆盖, 苯丙胺与苯丙胺相结合, 突出表明只有一个尿样 (注射位置 #11) 的浓度高于截止水平。(C) eie 覆盖对应于文拉法辛-d6, 该覆盖与文拉法辛相结合, 突出表明只有一个尿样 (注射位置 #6) 的浓度高于截止水平。(D) 与 pregabalin-d6 相对应的 eie 覆盖, 该覆盖与 pregabalin 相结合, 突出表明只有一个尿样 (注射位置 #4) 的浓度严重升高, 超过截止水平。所有尿样在去离子水中稀释5倍后直接分析, 并添加匹配的 d-IS (如有)。MSI-CE-MS 中的屏幕阳性结果对应于一种与 D-is 相比较的药物, 该药物具有较低的质量误差 (& lt;5 ppm) 和正确的分子式, 其浓度超过了在与内部参考/qc 相同的运行中分析的截止值。请点击这里查看此图的较大版本.

DoA 及其代谢物的绝对定量也是通过基于外部校准曲线的 MSI-CE-MS 实现的, 使用在一次运行中快速获得的 doa 参考校准标准。例如, 在固定浓度下对84种药物的校准混合物与匹配的 d-IS 进行连续稀释, 可对复杂的尿液样本进行可靠的定量分析。这可以补偿潜在的基质诱导的离子抑制或增强, 也可以补偿样品之间毛细管中注射体积的变化。在某些 DoA 在商业上不可用或成本过高的情况下, 使用代理 IS 进行数据规范化, 例如来自同一药物类别中的 d-IS 或尿液中找不到的合成化合物 (F-Phe), 如前面所示¹⁴.图 3a、b显示了氧可待因的代表性 eie 和外部校准曲线。图3c,d。这些分别是广泛处方的止痛药和抗抑郁药, 具有滥用潜力。测量了相对离子响应率与匹配的 d-IS 的关系。在这种情况下, MSI-CE-MS 中的串行注射配置 (包含五个不同的药物校准器) 在一次运行中与合成尿液空白一起进行一式分析。总体而言, 在20倍的浓度范围内实现了良好的线性度 (r² > 0.990), 在84药物面板内检测大多数 doa 及其代谢物 (即阳离子生物碱) 具有足够的敏感性¹⁴. 在所有情况下, 药物代谢物都被检测为其原质子分子离子 [mh⁺] 高于其筛选截止限制 (& gt;50 ng/ngml), 但某些酸性-中性药物除外, 根据正离子模式, 如大麻素 (如thc-cooh)、巴比妥酸盐 (如塞科巴比妥) 和氨基甲酸酯 (如卡异丙醇)。

图 3: 一系列提取的离子电泳图 (eie), 用于对具有代表性的 DoA 进行量化.这是通过生成基于其相对离子响应比的外部校准曲线, 并在20倍线性动态范围内匹配 d-IS。(A) 为氧可待因校准剂与氧可待因-d3 和空白重复注入五点校准曲线。(B) 氧可待因的外部校准曲线, 在线性回归后推导出灵敏度 (斜率) 和线性度 (r²), 误差条表示±1 (n = 4)。(C) 为西他普兰校准剂重复注入五点校准曲线, 并与西他普兰-d6 和空白。(D) citalopram 的外部校准曲线, 遵循线性回归得出灵敏度 (斜率) 和线性度 (r²), 误差条表示±1 sd (n = 4)。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

传统的色谱分离通常依靠一次样品注射每次运行, 然后是梯度洗脱, 以解决复杂的药物混合物和柱修复。即使在使用最佳的列切换程序时, 这些要求也从根本上限制了样品吞吐量和占空比。在此背景下, GC-MCN-mcn-mcn 和越来越多的 lc-msms 对工作场所、毒理学或治疗监测应用进行大量尿液药物分析, 这些分析是平行进行的, 但在以下情况下优先用作第二层或确认测试。必要的 (即法律或医疗背景)。这是由于资本投资和运营成本高得多, 以及在经过认证的实验室内跨多个仪器平台分析的样本时, 数据分析的复杂性。因此, 免疫检测仍然是常规药物筛选的主要方法, 尽管在许多药物类别中容易出现误报和假阴性, 新兴名牌药物获得抗体试剂的机会有限。以往的研究表明, 基于 MSI-CE-MS 的多路复用分离提供了一个简单的解决方案, 可将样品吞吐量提高到一个数量级。此外, 这种方法允许在实现有效的批处理校正和质量控制 12^、13、14的基础上, 设计具有高数据保真度的生物标志物发现新的数据工作流。然而, 在 MSI-CE-MS 中引入10次或10次以上的串行流体动力注射, 缩短了维持高效分离所需的有效毛细管长度, 这可能会降低分析 DoA 及其代谢物时的选择性。人类的尿液。

在此, 我们在每次流体动力样品注射后引入了 BGE 的电动注射, 使分离利用了全毛细管长度 (120 厘米), 从而提高了重要药物异位异构体在使用时的分辨率。通过 TOF-MS 进行全面扫描数据采集 (图 1 a)。与最近的一份报告¹⁴相比, 几个重要的异糖体 doa 及其代谢产物得到了更好的解决, 这在筛选大型药物面板时至关重要。例如, 实现了几种重要结构/功能基团异构体的解决, 其中包括三种类似的类鸦片药物代谢物 (图 1 b)、两种不相关的类鸦片异位物 (图 1B) 和两种甲基苯丙胺(图 1d)。在所有情况下, 在同一运行中连续注射不同校准溶液的样品结转并不显著, 这一点通过负尿控制/空白得到证实。此外, 还提高了面板内涉及某些具有等压药物的 D-is 的交叉干扰, 如可调-d3 和3、4-亚甲二氧基安非他明 (MDA)、EDDP-D3 和 imipramine、norfentyl-d5 和氯胺酮、可待因-d6 和舍曲林, 以及可卡因-d6 和唑吡啶。这一结果被扩展到药物面板内的其他等压干扰, 在本研究中得到了更好的解决 (例如, 诺西多内/氧电话, noroxycodone/oxymorphone 甲基苯甲酸), 以及主要的背景泌尿系统干扰 (例如,, 肌酐与安非他明的来源片段离子)¹⁴。事实上, 获得两个正交参数以满足特定 DoA 的假定识别对于减少由于等压干扰而产生的误报至关重要, 即精确的质量与 D-is 的竞争相结合。此外, 在同一样本中检测亲本药物的一种或多种生物转化代谢物, 如羟基化、脱甲基化或完整的葡萄糖苷药物共轭, 在扩大窗口的同时, 进一步增强了对药物鉴定的信心以进行检测。

根据不同类别的尿液药物筛选的药代动力学、毒性和背景干扰, 不同类别的尿液药物筛选的建议截止水平差别很大, 以减少基于指南的方法偏差。药物滥用和精神卫生服务管理局 (SAMHSA)¹⁴。MSI-CE-ms 以最小的样品预处理直接检测和识别尿液中不同类别的 DoA 的潜力被应用于一组有已知处方记录的临床抑郁症患者。在使用 MSI-CE-MS 时, 在稀释但不水解的尿液样品中明确鉴定了美沙酮 (规定)、安非安非苯二 (处方)、文拉法辛 (处方) 和 pregabalin (处方)。这是基于对在特定注射位置检测到的药物相对于在建议的筛选截止水平上在第一个样本位置引入的84种药物混合物的直接比较, 该方法可作为内部参考/质量控制和积极控制(图 2)。此外, 在使用基于药物相对于其 d-IS 的离子响应比的外部校准曲线 (图 3) 时, 绝对药物量化是可行的。与大多数色谱分离不同的是, 没有任何硒效应会影响 d-IS 与其非子宫药物之间的迁移时间差异, 因为它们在 CE 中的游离溶液中具有类似的电泳运动。事实上, doa 的迁移行为是在 ce 中准确地模拟的, 其基础是其基本的物理化学性质/化学结构, 即分子体积和有效电荷 (pka)¹⁴。由于许多药物在尿液排泄前也会发生显著的二次代谢 (例如吗啡葡萄糖内酯), 因此筛查截止水平需要调整, 因为与利用酶解进行药物检测的方法。"稀释和拍摄" 尿液药物检测的一个主要好处是, 除了减少成本/时间、样品处理, 以及不完全酶水解造成的潜在偏差或批次变化外, 推定的阳性病例还被进一步确认为检测同一样本中的一种或多种相关药物代谢物。这也提供了更深入的洞察药物药代动力学和最佳剂量要求的个别患者, 同时改善检测 "快速" 代谢物或处方非法药物的短半衰期。此外, 在使用 MSI-CE-MS 时, 与匹配的 d-IS 的竞争对于可靠的药物筛选具有两个重要功能, 即它可以识别确切的样品注射位置 (即患者 #), 同时还可以纠正离子的差异注塑量, 以提高精度和准确度。

今后的工作旨在开发定制的软件工具, 以便按照 QC/qa 进行大容量尿液药物检测所需的要求, 对多路复用分离进行自动化数据处理。还将在更多的高危患者中, 对 MSI-CE-ms 进行广谱筛查进行严格验证, 以便客观地评估处方药物依从性和可能损害的潜在错误/替代治疗效果、患者安全和精神评估/诊断。在碱性条件下, MSI-CE-MS 还将对 doa 的酸/阴离子类及其代谢物进行补充分析, 并根据对天然药物合成大麻素进行全面筛选的要求进行负离子模式检测。考虑到加拿大和美国几个州娱乐用大麻合法化对公众健康的影响迫在眉睫, 这一点很重要。TOF-MS 采集全扫描数据的一个主要优点是, 即使尿液标本不再用于后续检测, 也可以对样本进行回顾性分析, 而其他生活方式或饮食接触可以评估得更好了解药物治疗的不同反应。总之, MSI-CE-MS 快速而准确的药物监测方法为传统的靶向免疫检测以及在解决时容易受到干扰的环境电离方法提供了显著的优势。扩大的 DoA 板及其代谢物在复杂的生物样品中的增量成本。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7100 Capillary Electrophoresis System	Agilent Technologies Inc.	G7100A	CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer	Agilent Technologies Inc.	G6230B	HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit	Agilent Technologies Inc.	G1603A	CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser	Agilent Technologies Inc.	G1310B	Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter	Agilent Technologies Inc.	5813-4620	Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker	Microsolv Inc.	07200-S	Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies Inc.	TSP05375	Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)	Cerilliant Inc.	Miscellaneous	Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)