一种高通量志贺氏菌特异性杀菌试验

摘要

在这里, 我们提出了一个方案来测量血清中抗体的志贺酸酯活性。血清与细菌和外源补体混合, 孵育, 反应混合物被镀在琼脂板上。活细菌形成菌落, 这些菌落被计数, 使用自动菌落计数器, 并用于确定杀菌滴度。

摘要

血清杀菌剂 (sba) 测量抗体的功能活性, 并已使用了几十年。sba 通过评估血清中抗体与细菌结合和激活补体的能力, 直接测量抗体的杀灭活性。这种补充激活导致目标细菌的裂解和杀死。这些检测很有价值, 因为它们不仅仅是量化抗体的产生, 而是阐明这些抗体所具有的生物功能, 使研究人员能够研究抗体在预防感染方面可能发挥的作用。sba 已被用来研究许多人类病原体的免疫反应, 但目前还没有广泛接受的方法来研究志贺氏菌。从历史上看, sba 一直是非常劳动密集型的, 需要许多耗时的步骤来准确地量化幸存的细菌。该协议描述了一种简单、可靠和高通量的检测方法, 该方法可测量血清中特定于志贺菌的功能抗体。与传统 sba 相比, 这里描述的方法具有许多优点, 包括使用冷冻细菌库存、96孔检测板、微培养系统和自动菌落计数。所有这些修改使这种检测减少了劳动密集型, 提高了吞吐量。与传统 sba 相比, 此协议的执行更简单、更快速, 同时仍使用简单的技术和现成的试剂。该方案已成功应用于多个独立实验室, 检测方法可靠、重现性好。该检测方法可用于评估临床前和临床研究中的免疫反应。在抗原暴露之前和之后 (通过免疫或感染) 对杀虫抗体滴度进行量化, 可以更广泛地了解功能抗体反应是如何产生的, 以及它们对保护性免疫的贡献。这种标准化、有良好特征的检测方法的发展, 可以极大地促进志贺菌疫苗的设计。

引言

志贺氏菌血清型、志贺氏菌血清型 2 a、 s. flexneri 3a 和s. sonnei在全球范围内显示了流行病学流行率。这些志贺菌引起的腹泻病影响军事, 旅客¹, 是发展中国家5岁以下儿童腹泻死亡的主要原因 2.目前还没有有许可证的疫苗来预防志贺菌, 然而, 在开发的不同阶段, 有多种候选疫苗。其中许多疫苗和其他预防措施目前正在开发中, 重点是针对志贺多糖 (lps) 产生的抗体。lps 是一种有吸引力的候选疫苗, 因为它是一种主要的表面抗原和天然感染志贺菌诱导 lps 特异性抗体, 可以以血清素特异性的方式防止再次感染。因此, 成功的志贺氏菌疫苗可能需要多价和目标3-4 志贺氏菌血清型, 以诱导免疫对70-80% 的全球循环菌株^3,4,5,6. 这就要求对志贺氏菌疫苗候选设备进行评估, 以特定于多种不同的血清型。

目前用于评估候选疫苗的免疫检测侧重于定量抗体滴度的水平, 但很少有有良好特征的检测方法来评估功能抗体。抗体功能能力的检查是很重要的, 因为病原体特异性抗体负责通过多种功能机制来对抗感染, 包括结合细菌表面抗原, 并防止粘附在和上皮细胞感染, 靶向细菌细胞或光圣化和吞噬, 并通过结合和启动补体级联直接杀死病原体。当抗体与目标细菌的表面成分结合并启动补体级联, 导致许多酶原激活, 最终导致细菌细胞中的毛孔形成时, 就会直接杀死细菌。导致裂解和细菌死亡。这种通过循环抗体和补体直接杀死细菌的行为可能是感染过程中的一个关键的早期防线。

自然感染的个体在其血清中具有具有志贺氏体活性的抗体。这些shigella 特异性抗体是用传统的互补介导^的杀灭试验 7^,8检测出来的。这表明, 杀菌抗体在预防志贺氏菌方面可能有一定的作用。传统的杀菌检测是简单的执行: 血清热灭活 (破坏内源性补充活性), 并与感兴趣的细菌混合。在特定浓度下, 在这种混合物中添加外源补体。反应混合物孵育以允许细菌死亡, 然后电镀以确认菌落形成单位 (cfu)。一旦计算 cfu, 就可以计算出50% 的杀伤指数 (ki), 并确定 sba 滴度。虽然这个过程相对简单, 但这些检测可能需要大量的劳动和时间来执行, 结果可能会有很大的差异。除了这些限制外, 目前还没有对志贺氏菌进行有良好特征的功能检测。因此, 我们已经成功地开发和鉴定了一种简单、高通量的检测方法, 以测量三个最临床相关的菌株⁹的志贺氏菌杀菌活性。该协议描述了一种 sba, 并对其进行了修改, 以提高检测效率和重现性。这些修改中的第一个是使用冷冻细菌库存。单一使用库存的生产消除了为每个检测培养新鲜细菌的需要, 同时也减少了检测-分析的可变性。该协议的另一个节省时间和省力的优势是使用96孔板检测格式。这样就可以对样品进行连续稀释, 从而可以测试一系列浓度。 它还允许使用多通道移液器在方形 petri 培养皿上电镀样品。当这些方形的 petri 培养皿与产生微菌落的培养系统结合使用时, 检测所需的琼脂板的数量就会减少。这与免费提供的菌落计数软件相结合, 最初是为肺炎球菌多路复用光声细胞杀伤试验 (示波)¹⁰开发的, 允许快速、自动和可靠的群体计数。所有这些改进显著缩短了手工检测时间, 并创建了一个高通量系统, 允许同时运行多个板材。

虽然该协议已针对志贺菌的三种最临床相关的血清型进行了优化, 但此处描述的 sba 可以很容易地应用于许多其他细菌病原体。除了该协议与其他细菌的潜在用途外, 该协议还有可能扩大到仅使用血清作为起始材料, 其中可能包括分析其他相关样本类型的抗体, 如黏膜样本,包括唾液和粪便样本使用这种检测方法来调查接种疫苗后的免疫反应, 可以使人们更广泛地了解疫苗接种所产生的免疫反应, 从而合理设计疫苗, 并有助于了解自然免疫是如何发展的。

研究方案

该协议遵循 wrair 人类主体保护委员会的准则。本研究中使用的样本是作为 wrair 议定书第1328号的一部分收集的人类血清样本, 符合所有关于保护人体的机构和联邦条例。对样本进行了注销鉴定, uab irb 将这些匿名样本的使用归类为非人类主题研究 (协议号 n150115001)。

1. 制备检测试剂

1. 在100毫升的水中加入1克明胶, 制备1% 的明胶。高压灭菌器, 并在室温下存放。
2. 在40毫升水中加入5克 ttc, 制备 100 mg/ttl (2, 3, 5-三苯基四唑氯化) 库存溶液 (1, 000 x)。当 ttc 完全溶解时, 使用水和无菌过滤器将体积调整到50毫升, 使用0.2μm 过滤器。将溶液存放在 4°c, 并防止光线照射。
   请注意:ttc 使细菌菌落着色, 使其更容易计数。ttc 溶液有轻微的黄色。如果 ttc 溶液发展出红色, 丢弃并准备新鲜。
3. 加入5克 nn3l 至 40毫升的水, 制备10% 的氮化钠 (nn3) 库存溶液 (100x₎ 。完全溶解后, 将水添加到50毫升。在室温下存放。
   注意事项:氮化钠是一种毒药, 如果通过皮肤或眼睛摄入或吸收, 可能会有毒。它可能与铅和铜管道发生反应, 形成高度爆炸性的金属氮化物。在处置含有氮化钠的试剂时, 用大量的水冲洗, 以防止氮化物积聚或丢弃在生物危害袋中。
4. 在1升的水和高压灭菌器中加入35克的 lb 琼脂, 制备 lba 板 (lb 琼脂板)。在每个方形培养皿中加入25毫升 (120 x 120 毫米²)。在 rt 中加层 10-20, 使琼脂凝固。将盘子放回塑料袋中, 并在4°c 下存放长达1个月。
5. 在 1, 000 毫升的水和高压灭菌器中加入7.5 克琼脂, 准备覆盖琼脂。在56°c 的水浴中孵化, 直到需要。使用前, 加入1毫升 100 mgml ttc 和 10% nan₃的10毫升, 搅拌均匀。
   请注意:每个 lba 板需要25毫升的覆盖琼脂。覆盖琼脂可以提前一个月准备, 并根据检测需要在微波炉或热板上融化。在应用 lba 板之前, 请确保琼脂温度约为55°c。
6. 加入5ml 的 10倍 hanks 平衡盐溶液 (hbss), 加上^{ca 2 +}/mL^{2 +}和 5 ml 的1% 明胶至40毫升的水, 制备检测缓冲液。在室温下存放。

2. 准备补体和靶向细菌

1. 准备小兔补体 (brc)
   请注意:补充手选的详细标准可以在这里找到: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
   1. 获得冷冻 brc, 用自来水解冻。每隔10-20 将 brc 物理混合, 直到完全解冻。不要让 brc 反复进行冷冻解冻循环。
   2. 当 brc 解冻时, 标签 1.5 ml、5ml 或 15 ml 离心管。将贴有标签的管子放在冰上预冷却。倾斜适当体积的 brc 到预冷离心管 (灌装后, 立即将每个管返回冰面)。将等价物存放在≤-70°c 的冰柜中。
      请注意:每个检测板大约需要1米的补体。补充等价物是一次性使用的, 应以适合于分析布局的卷的数量进行。
   3. 为了准备热灭活的 brc, 解冻一个活跃的 brc。准备56°c 的水浴。brc 完全解冻后, 将其转移到水浴中, 孵育 3 0分钟。
   4. 孵育后, 从水浴中取出热灭活 brc, 并允许在 rt 冷却 10-15, 用力混合, 并使用约150μl 至 1.5 ml 微离心管。在≤-10°c 下储存等价物。
2. 准备目标细菌库
   请注意:下面的程序用于制备48个目标细菌储备的等价物;如果需要更多的等价物, 协议可以扩大规模。
   1. 从冰柜中取出细菌主储存的小瓶, 刮掉冷冻的细菌表面, 将少量的冰从小瓶中取出到血琼脂板上。立即将主库存小瓶返回到冰柜。
   2. 将这种小的细菌库存撒在血琼脂板上, 盖上锅盖。在 37°c% co-2 孵化器中倒置板.
   3. 将 ~ 10个孤立的光滑菌落转移到含有30毫升 lb 肉汤的50毫升管中。在37°c 孵育 3-5小时, 轻轻摇晃, 直到培养液_{的 od 600} ~ 0.6-0.7。
   4. 收获最上面的12.5 毫升的培养, 并转移到一个新鲜的50毫升管。使用桌面微型离心机以 15, 000 x 克离心培养物2分钟。丢弃上清液, 在25% 无菌甘油 lb 的25毫升中重新悬浮颗粒。
   5. 将0.5 毫升的 aliquots 混合均匀, 放入无菌 1.5 ml 微型离心管 (~ 48 管) 中。将等价物存放在≤-70°c 的冰柜中。
   6. 使用前使用凝集试验确认细菌身份。
3. 目标菌群最佳稀释因子的测定
   请注意:每批靶向细菌库存必须在检测条件下滴定, 以确定在 lb 板上产生 ~ 120 cfu/点所需的稀释。
   1. 得到一个微滴板 (稀释板), 并加入135μl 的检测缓冲液, 以良好的1a。在1b-1h 井中加入120μl 的检测黄油。
   2. 从冰柜中取出一小瓶冷冻靶部细菌, 并在室温下解冻。将 15 ul 解冻的细菌库存添加到 1 a, 使细菌库存稀释10倍。
   3. 将30μl 的细菌溶液从 1 a 井转移到1b 井进行5倍的连续稀释。继续进行5倍的串行稀释, 使1h 井, 共8次稀释 (1:10; 1:50; 1: 250; 1: 1 250; 1: 6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250)。
   4. 获取另一个微滴板 (检测板), 并在检测板第1列和第2列中的所有井中添加20μl 的检测缓冲器。
   5. 将稀释板第1栏中每口井中的10μl 稀释细菌转移到测定板第1栏和第2栏的相应井中。10μl 细菌从稀释板的1a 井转移到检测板中的1a 井和2a 井等。
   6. 继续进行下面控制 a 和控制 b 的血清杀菌鉴定 (sba) 中所述的检测, 步骤 3.6-3.12。
   7. 在冰上孵育板后, 使用带有8个移液器吸头的多通道移液器将第1列中的井中的10μl 点到 lba 板上。此外, 将从第2列到 lba 板上的井点。
   8. 继续进行步骤3.14-4.6 中所述的检测。
   9. 测定在控制 b 中产生 ~ 120个 cfu®的细菌稀释, 该稀释将用于检测。

3. 血清杀菌试验 (sba)

请注意:下面描述的过程是一个检测板, 但可以增加检测板的数量。

1. 在56°c 的水浴中孵育样品 30分钟, 使热失活测试样品。
   请注意:测试样品必须在测试前被热失活, 以废除任何内源补活活性。这可以在检测前完成, 在测试之前, 可以在4°c 下重新冷冻或储存灭活样品。
2. 获取检测板, 并将20μl 的检测缓冲区添加到第1行到第12列 a 到 g. 在 h 行的第1列和第2列添加20μl 的检测缓冲区, 请参见表 1。
3. 加载每个测试样品的 30μl, 一式两份, 到检测板的 h 行。例如, 将样品1的30μl 分配到井3h 和4h 中, 并将样品2的30μl 分配到5h 井和6h 井等中。
4. 使用多通道移液器对测试样品进行3次串行稀释。
   1. 将样品从3h-12h 井中取出 10μ, 转移到 g 排的相应井中, 通过向上和向下移液混合样品8-10 次。
   2. 然后从3g-12g 井中去除 10μ, 转移到 f 排相应的井中, 搅拌良好。
   3. 继续这些连续稀释通过行 a。在 a 排混合井后, 从3a-12a 井中取出并丢弃 10μl, 使所有井都含有20μl。
      请注意:由于血清20μl 用于80μl 的总测定体积, 因此在测定中有4倍的额外稀释。在计算 sba 滴度时, 必须将血清稀释量乘以 4, 从而考虑到这种稀释。例如, 如果使用 1: 2 的开始稀释, 则实际进行稀释的时间为1:8。
5. 取出一小瓶冷冻目标细菌库存, 在室温下解冻。根据预先确定的最佳稀释系数 (第2.3节确定了该稀释系数), 稀释检测缓冲液20毫升中的细菌。使用多通道移液器将10μl 稀释后的细菌添加到检测板的每口井中。
6. 取出一小瓶冷冻 brc 和一小瓶冷冻热灭活 brc, 在室温下用自来水解冻, 或放置在生物安全柜的格栅上, 吹气迅速解冻。
7. 准备20% 的热灭活 brc 溶液。将100μl 的热灭活 brc 与400μl 的检测缓冲器混合。在第1栏 (控制 a 井) 的所有井加入50μl 的这种20% 的热灭活 brc 溶液。
   请注意:热灭活 brc 被用作监测检测中非特异性杀伤 (nsk) 的对照。
8. 准备20% 的本地 brc 解决方案。将原生 brc 的1毫升与4毫升的检测缓冲区混合。将这种混合物的50μl 添加到第2至第12栏的所有井 (控制 b 和测试样品井) 中。
   请注意:反应混合物中 brc 的最终浓度为12.5%。
9. 在板振动台上轻轻晃动 10-15, 或使用多通道移液器上下移液 8次, 将检测板快速混合。
10. 将检测板放入37°c 微生物孵化器中 2小时 (不晃动)。
11. 通过取下盖子和放置板面朝上干燥 2 lba 板, 在生物安全柜中擦干40-60分钟。
12. 2小时孵育完成后, 将检测板移动到湿冰上, 孵育10-20 以停止反应。
13. 使用12通道移液器, 将井在 h 排中混合, 并将反应混合物的点板10μl 固定在 lba 板的底部。立即倾斜板, 让斑点运行 ~ 1.5-2 厘米. 对 g、f 和 e 行重复此过程, 在 lba 板上的前一行上方发现它们。e、f、g 和 h 行被发现在一个 lba 板上, a、b、c 和 d 行以同样的方式被发现在第二个 lba 板上, 见图 1。
14. 在室温下培育 lba 板, 直到溶液吸附到 lba 板中 (10-15)。将盖子放在 lba 板上, 并将 lba 板倒置在微生物孵化器中, 隔夜孵育 (约 16-18小时)。在29°c 孵育 s. flexneri 2a 和 3a, 在26°c 孵育 s. sonnei 。
    请注意:这些温度产生较小的 "微菌落", 其大小适合由菌落计数器^{9 精确计数.}
15. 隔夜孵育后, 在每个 lba 板上加入25毫升的覆盖琼脂 (~ 55°c), 其中含有 100μgml ttc 和0.1% 的 nan₃ 。
16. 在37°c 下将 lba 板培养 2小时, 以使幸存的细菌产生红色, 见下文图 1 。
17. 使用数码相机拍摄的照片板, 并将图像传输到安装了 nist 集成群枚举软件 (nice) 的计算机, 请参见图 2。
    请注意:尼斯殖民计数软件是免费提供的。有关详细信息和安装说明, 请参阅材料列表。

4. 细菌性菌落计数

1. 打开 nice 软件, 并将操作员姓名、实验信息和任何检测说明输入空字段。输入此数据后, 单击"完成"按钮。
2. 通过单击 "打开"按钮并从计算机中选择正确的文件来导入拍摄的印版。
3. 通过将行数设置为4和将列数设置为12来调整分析参数。将 "背景" 设置调整为-3 西格玛, 将"分辨率" 调整为 "低"。请参见图 2。
4. 通过单击和拖动移动感兴趣的区域 (roi), 以便每个 roi 直接位于一个示例点上。确保所有细菌菌落都在投资回报率内, 样品之间没有重叠。完成一个板后, 双击 "存储数据图像" 列表中的下一个板, 然后调整 roi。请参见图 2。
5. 调整完所有板后, 单击绿色计数按钮, 请参见图2和图 3。计数完成后, 单击"导出" 按钮以. xls1. xlsx 格式导出数据。命名并保存. xls1. xlsx 文件以进行数据分析。
6. 将导出的数据排列为表格格式, 以便在表示96孔检测板的表中组织计数, 请参见表 2.

5. 计算 sba 标题 (ki) 和非特异性杀戮 (nsk)

请注意:sba 滴度, 或杀死指数 (ki) 被定义为血清稀释的倒数, 杀死50% 的目标细菌。

1. 通过对活性补体控制井 (控制 b) 的 cfu 进行平均和除以 2, 计算50% 的杀灭指数 (ki) 截止值。计算每一个重复运行的样本的平均 cfu, 见表 3。
2. 由于血清稀释很少能准确地产生这个50% 的 ki 值, 所以它可以通过两种连续的血清稀释中插值, 一种是杀死不到50% 的, 另一种是杀死50% 以上的, 请参见图 4。计算插值 sba ki 的公式如下所示:
   
   请注意:细菌滴度, 或 ki, 也可以使用 uab 开发的 opsotiter 软件自动计算。如需使用 opsotiter, 请与 moon nahm 博士或 rob burton 先生联系。有关联系信息, 请参阅 https://www.vaccine.uab.edu。
3. 通过取1减去控制 b 的平均值除以控制 a 的平均值来计算 nsk 值。

结果

典型检测中使用的96孔板布局见表 1.该布局有活性补重控制井 (控制 b)、热灭活补体控制井 (控制 a) 和五个样品一式两份。样品被连续稀释 3倍, 从 h 行到 a 排, 允许同时对每个样品进行8次稀释测试。图 1显示了两个 lba 板在隔夜孵化和叠加后的添加。颜色的发展已经发生, 所有幸存的殖民地都可以看到红色。在前三次稀释 (f-h 行) 中检测的所有样本都可以清楚地看到细菌杀灭情况, 随着样品在盘子上进一步稀释, 在血清浓度较低的地方可以看到细菌杀灭率的减少。在图 2中可以看到 nice 软件界面。从 nice 软件中的微群体计数可以在图 3中看到, 这些计数已被组织到表 2中。计算每个样品每次稀释的平均 cfu 计数, 并在表 3中计算50% 的 ki 值。此 50% ki 值可应用于每次血清稀释的平均 cfu, 以确定根据图 4中描述的公式计算 sba ki 所需的值。检测的最终结果见表 4。

1

2

3个

4个

5

6

7。

8

9

10

11

12

a 个

控制 a

控制 b

稀释8

稀释8

稀释8

稀释8

稀释8

稀释8

稀释8

稀释8

稀释8

稀释8

B

控制 a

控制 b

稀释7

稀释7

稀释7

稀释7

稀释7

稀释7

稀释7

稀释7

稀释7

稀释7

C

控制 a

控制 b

稀释6

稀释6

稀释6

稀释6

稀释6

稀释6

稀释6

稀释6

稀释6

稀释6

D

控制 a

控制 b

稀释5

稀释5

稀释5

稀释5

稀释5

稀释5

稀释5

稀释5

稀释5

稀释5

e

控制 a

控制 b

稀释4

稀释4

稀释4

稀释4

稀释4

稀释4

稀释4

稀释4

稀释4

稀释4

F

控制 a

控制 b

稀释3

稀释3

稀释3

稀释3

稀释3

稀释3

稀释3

稀释3

稀释3

稀释3

G

控制 a

控制 b

稀释2

稀释2

稀释2

稀释2

稀释2

稀释2

稀释2

稀释2

稀释2

稀释2

H

控制 a

控制 b

稀释1

稀释1

稀释1

稀释1

稀释1

稀释1

稀释1

稀释1

稀释1

稀释1

样品1

样本2

样本3

样品4

样品5

表 1: 检测板布局。第1栏和第2栏包含补重控制井。控制 a 位于第1列, 是热灭活补体对照, 含有 sba 缓冲液、细菌和热灭活补体。控制 b 位于第2栏, 是活性补体对照, 含有 sba 缓冲液、细菌和补体。第3-12 列包含血清样本。每个样本都是重复运行的, 从 h 行到 a 行连续稀释3倍

图 1: 颜色开发后的 lba 板.代表s. flexneri 3a 细菌微菌落已在一夜之间生长到适当的大小。通过减少覆盖琼脂中的 ttc 化合物, 增加了覆盖琼脂, 菌落形成了红色。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: nist 的集成群元号 (nice) 软件接口.nice 软件界面的图形化表示。在计算之前, 感兴趣的地区 (roi) 以每个地点的殖民地为中心。数据可以直接从 nice 窗口导出。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 在 nice 软件中计数的 lba 板.彩色照片图像被加载到 nice 软件和菌落形成单位 (cfu) 自动计数。这张图片显示了两个具有代表性的 lba 板及其菌落计数信息。请点击这里查看此图的较大版本.

185	167	145	151	122	134	119	142	124	115	113	123	1: 17496	稀释8
186	152	145	138	132	135	108	116	100元	119	105	109	1: 5832	稀释7
179	160	145	135	109	1120	54	55	71	75	79	89	1: 1944	稀释6
193	153	146	138	87	105	5	6	6	9	19	30	1: 648	稀释5
184	1130	121	143	6	7。	0	1	1	1	1	1	1:216	稀释4
180元	145	22	24	2	3个	3个	1	1	0	0	0	1:72	稀释3
207	1130	1	0	2	2	1	0	4个	1	0	1	1:24	稀释2
201	140	0	0	0	0	1	1	1	0	4个	4个	1: 8	稀释1
控制 a	控制 b	样品1		样本2		样本3		样品4		样品5

表 2: 细菌菌落计数.cfu 计数从 nice 软件导出, 以出类拔萃的格式。这些计数可以排列到一个表中, 显示所有重复样本和控制井的细菌计数。

控制 a	控制 b	148	128	1130	1120	118	1: 17496	稀释8
189	147	142	134	112	1110	107	1: 5832	稀释7
nsk (1-ctrb/cotra): 22%		140	115	55	73	84	1: 1944	稀释6
50% ki (ctrb/2):73		142	96	6	8	25	1: 648	稀释5
		132	7。	1	1	1	1:216	稀释4
		23	3个	2	1	0	1:72	稀释3
		1	2	1	3个	1	1:24	稀释2
		0	0	1	1	4个	1: 8	稀释1
		样品1	样本2	样本3	样品4	样品5

表 3: 计算 50% ki 截止值和重复样本平均值.50% ki 截止值是通过取所有控制 b 井的平均值并除以2计算的。对于每一个重复的样品, 都计算了重复项的平均值。还计算 nsk 值。

图 4: 线性插值原理图.在每次稀释血清 (x 轴) 时存活的细菌 (y 轴) 的数量被绘制 (黑色钻石), 单个点由薄薄的虚线连接在一起。实心和虚线水平线分别表示0% 和50% 的杀灭率。血清稀释 (稀释 5) 和以下 (稀释 4) 50% 杀灭线由红线连接, 并且杀菌滴度 (ki) 被表明。请点击这里查看此图的较大版本.

	SBA KI
样品1	72
样本2	216
样本3	1994年
样品4	1994年
样品5	648

表 4: sba 结果显示杀菌滴度 (ki).已为每个样本确定了最终 sba ki 值, 并显示了这些值。这些值使用平均 cfu、50% ki 截止值和线性插值公式计算。

讨论

这里描述的协议演示了一种功能免疫检测, 以评估血清中抗体的抗毛活性。在该方案的检测中, 使用了针对s. flexneri 3a 的单克隆抗体, 同时使用了9种与对照人类血清一起进行了^先前的志贺氏菌疫苗^{研究 11}。本试验中测试的血清来源可能因临床前动物样本和人体临床样本的不同而有很大差异, 血清样本的抗毛活性将受到个人所经历的免疫接种和接触的影响。在密切相关的血清型之间可能会出现一些交叉反应, 特别是s. flexneri 2a 和s. flexneri 3a, 但与s. sonnei⁹相比, 这些菌株几乎没有交叉反应。sba 的基础是通过抗体抗原结合激活补体级联。因此, 处理 brc 试剂是执行此协议所涉及的许多关键步骤之一。brc 被选中用于该试验, 因为它在其他杀菌^{试验 12、13、14}中的性能稳定, nsk 水平较低。 brc 的活性对温度敏感, 必须采取适当措施, 确保最大限度地减少冻融循环, 将 brc 加入单用卷, 并在检测使用前迅速解冻 brc aliquot。补体活性的一致性将影响本方法的重现性。影响检测重现性的另一个关键步骤是细菌库存的生产和稀释。重要的是, 在开始检测之前, 应确定细菌库存的适当稀释, 因为检测的成功取决于控制 a 和 b 的一致生产, 其 cfu 计数平均约 120, 每个点。为了得到软件可以计数的点, 成功地执行用于平板细菌的技术也是当务之急。细菌溶液的沉积和板材的倾斜, 使斑点运行约2-3 厘米是至关重要的生产殖民地的适当大小和正确的分布, 以准确计数的 nice 软件。掌握所有这些步骤将确保该协议产生准确、一致的结果

即使所有关键步骤都执行得很好, 也可能仍存在需要修改此协议或对其进行故障排除的情况。修改该协议以评估其他细菌可能需要优化隔夜 lba 板培养温度, 以确保微菌落的形成。除血清外, 其他菌株或抗体来源可能需要优化补体浓度。还应该监测 nsk 值和控制血清的 ki, 以确保检测工作正常。nsk 的涨幅不应超过70%。控制血清的 ki 变化不应超过平均值±2sd。为了在使用此协议时获得成功和一致的结果, 必须执行此处所述的所有步骤, 并特别注意上述关键步骤。

虽然该协议满足了志贺氏菌研究界的一个重要需求, 但它并非没有局限性。该议定书依赖于生物材料, 因此, 总是会有一些难以控制的变异性。来自不同批次和来源的补体活动的变化可能会导致检测的变异性。为了缓解这种情况, 重要的是要适当处理补语, 并在购买前测试新的大量活动补语。创建具有已知活动的补体池也可能是有帮助的, 以实现均一供应。该协议在设计上很简单, 不需要任何专用设备, 自动菌落枚举软件是免费提供的。虽然这种简单性是一个优势, 允许这种协议几乎在任何实验室中使用, 但它仍然需要一夜孵化。最近的检测已经被描述, 有更短的孵化要求, 但确实需要专门的, 准备试剂¹⁵。这种检测的另一个局限性是, 以目前的形式, 它只能同时调查一个细菌物种。在志贺菌领域, 人们希望创造一种多价疫苗, 拥有能够以多重方式评估病原体的免疫检测是非常有价值的。这种检测可以在未来进行修改, 以满足这一需求, 但在其目前的形式, 它是一个单 plex 的检测。

虽然这种检测有一定的局限性, 但与现有或替代方法相比, 它仍有许多优势。这些优点包括许多改进, 这些改进结合在一起, 使这种方法的执行比传统 sba 少很多劳动密集型和更高的吞吐量。使用冷冻细菌库存、96孔板检测格式、在较大的方形培养皿上电镀、着色菌落, 以便进行拍照和自动殖民计数, 所有这些都有助于减少完成这项工作所需的材料和时间测定。与其他高通量方法相比, 这种检测也有优势, 因为它不需要任何专门的试剂或设备。所述协议可使用基本试剂和免费提供的软件执行, 允许在任何实验室环境中应用。

该协议提供的所有优点都支持其在今后的许多调查中的使用。该检测方法非常适合检测接种疫苗或自然感染后的免疫反应。这一应用使 sba 成为志贺菌疫苗研究中的一个宝贵工具, 并已被用于评估志贺菌生物结合疫苗中的疫苗免疫原性, 在这种情况下, sba 已证明了这些疫苗的能力。诱导功能性抗体^的产生16。该协议已被多个实验室广泛测试, 并已被证明能产生可靠、可重复的结果⁹。当使用其他杀菌检测17对相同的样品进行测试时, 该协议也会产生类似的结果。该检测产生的数据的一致性及其与其他较旧方法的兼容性使其成为准确评估血清样本中杀菌活性的可靠工具。该检测也可以很容易地适应评估其他样本类型。虽然血清在成人临床试验中很容易获得, 但在以婴儿和幼儿为重点的试验中, 可能很难获得足够的血清;志贺氏菌疫苗的最终目标人群之一。在这些试验中, 全血定期收集在滤纸上并干燥。使用 sba 的这种类型的示例格式取得了一些初步的成功。除全血外, 黏膜样本 (如唾液、粪便提取物和尿液) 也是志贺氏菌疫苗研究的相关目标。目前, 该协议已被评估为三个最临床相关的血清型志贺氏菌, 但它也可以适应额外的志贺氏菌, 以及其他细菌病原体。今后的工作将集中在生产一种具有许多与该协议所描述的检测相同的特征的多重检测。多路检测将允许同时评估多个志贺氏菌血清型, 进一步节省样品量和手的检测时间。目前还在努力将这种检测方法转移到全球各地的实验室。这些全球评估将产生更多的数据, 以便在更大的研究范围内确定检测标准, 同时越来越多的微生物学和免疫学实验室能够进入这个 sba 评估细菌和血清样本从不同的地方收集。这里描述的方法简单, 吞吐量高, 有能力改进志贺氏菌领域的免疫评估, 以及更广泛的应用于其他细菌病原体的评估。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin	Sigma	G9391	Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture
TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride)	Sigma	T8877	≥98.0% (HPLC)
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S2002	≥99.5%
Baby Rabbit Complement	PelFreez	31061-3	3-4 week old
HBSS with Ca2+/Mg2+	Invitrogen	14065-56	Without Phenol Red
LB Agar (Lennox)	Sigma	L2897	Powder microbial growth medium
Bacto Agar	BD	214010	Powdered, (C12H18O9)n
Glycerol	Sigma	G5516	For molecular biology, ≥99%
LB Broth (Lennox)	Sigma	L3022	Powder microbial growth medium
Square Petri Dish	Sigma	Z617679-240EA	120 mm x 120 mm
Assay Plate	Costar	3799	96 well u-bottom plate with lid
NICE Software	University of Alabama at Birmingham		ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/