使用飞行磨坊测量西部玉米根虫的飞行倾向和性能，二溴二恶十二药病毒病毒（LeConte）

摘要

飞行磨机是比较年龄、性别、交配状态、温度或各种其他因素如何影响昆虫飞行行为的重要工具。在这里，我们描述了系绳和测量西方玉米根虫在不同处理下的飞行倾向和性能的协议。

摘要

西部玉米根虫，二溴代二线虫（乐康特）（科尔普特拉:Chrysomelidae），是美国北部一种经济上重要的玉米害虫。一些种群已经发展出对管理策略的抗药性，包括产生从图林根氏杆菌（Bt）中提取杀虫毒素的转基因玉米。西方玉米根虫传播知识对于抗性进化、传播和缓解模型至关重要。昆虫的飞行行为，尤其是远距离的飞行行为，本质上是难以观察和表征的。飞行工厂提供了一种在实验室中直接测试在实地研究中无法获得的飞行发育和生理影响和后果的方法。在这项研究中，飞行机用测量飞行活动的时间、飞行总数以及雌性根虫在22小时测试期间飞行的距离、持续时间和速度。16个飞行机房被安置在一个环境室，具有可编程的照明、温度和湿度控制。描述的飞行磨机是典型的设计，其中飞行臂可以自由旋转围绕中心枢轴。旋转是由拴在飞行臂一端的昆虫飞行引起的，每次旋转都由带有时间戳的传感器记录。原始数据由软件编译，随后经过处理，提供感兴趣的飞行参数的汇总统计信息。对于任何飞行机的研究，最困难的任务就是用胶粘剂将系绳附着在昆虫上，所使用的方法必须针对每个物种量身定做。附件必须足够坚固，以固定昆虫在刚性方向，并防止在运动过程中脱离，同时不干扰飞行过程中的自然翅膀运动。依恋过程需要灵巧、细腻和速度，为有价值的根虫制作过程的视频素材。

引言

1909年，西部玉米根虫，二溴代二零零五病毒，即"玉米"，被确定为栽培玉米的害虫。今天，它是美国玉米带中最重要的玉米害虫，幼虫以玉米根为食，导致与这种害虫相关的产量损失。玉米根虫造成的年管理费用和玉米生产损失估计超过10亿^美元。西方玉米根虫适应性强，种群对多种管理策略的抗药性已经形成，包括杀虫剂、作物轮作和转基因Bt^玉米3。确定空间维度，哪些策略必须应用来缓解局部的阻力发展，或电阻热点，取决于对^分散4的更好理解。如果缓解措施被限制在阻力热点周围的空间尺度太小，将不会成功，因为耐药成年人会分散在缓解^区域5之外。了解西方玉米根虫的飞行行为对于制定有效的抗虫病防治方案具有重要意义。

飞行分散在成人西部玉米根虫生命史^{和生态学中起着}重要作用，这种害虫的飞行行为可以在实验室中研究。有几种方法可用于测量实验室中的飞行行为。限制垂直平面飞行的显影仪可以测量昆虫飞行的时间。actograph 已用于比较不同年龄的西方玉米根虫男性和女性的飞行持续时间和周期模式、体型、温度、杀虫剂易感性以及杀虫剂暴露^{7、8、 9}.飞行隧道，包括一个跟踪室和定向气流，特别有助于检查昆虫飞行行为时，遵循气味羽流，如候选信息素^组件10或植物挥发^物11。飞行磨机也许是昆虫飞行行为实验室研究的最常见方法，可以描述飞行倾向和性能的几个方面。实验室飞行工厂已用于研究西方玉米根虫，以特征化倾向进行短和持续飞行，以及激素控制持续^{飞行12，13。}

飞行工厂通过允许研究人员测量各种飞行参数（包括周期、速度、距离和持续时间），为研究实验室条件下昆虫的飞行行为提供了一种相对简单的方法。今天使用的许多飞行磨坊都来自肯尼迪^等人14号、克罗格和威斯-福^格15号环线。飞行机在形状和尺寸上可能有所不同，但基本原理保持不变。昆虫被系在一起，安装在一个径向水平臂上，可以自由旋转，摩擦力最小，围绕垂直轴旋转。当昆虫向前飞去时，它的路径被限制在水平平面上盘旋，每次旋转的距离由手臂的长度决定。传感器通常用于检测昆虫的飞行活动引起的手臂每次旋转。原始数据包括单位时间的旋转和一天飞行时间发生。数据被输入计算机进行记录。来自多个飞行机场的数据通常并行记录，基本上同时记录，16 个和 32 个飞行机库的库是常见的。原始数据由自定义软件进一步处理，以提供飞行速度、单独飞行总数、飞行距离和飞行持续时间等变量的值。

每个昆虫物种是不同的，当涉及到最好的方法系绳，因为形态变量，如整体大小，大小和形状的目标区域，以附加系绳，柔软，和灵活性的昆虫，需要和方法麻醉，可能污染机翼和/或头部与错位或溢出胶粘剂，以及许多，更多的细节。在可视化的系绳^虫16和安布罗西亚^甲虫17的情况下，各自用于系绳连接的目标区域相对较大，并且由于头部和翅膀有些不精确的胶粘剂放置而宽容与附件站点分离良好。这不是为了淡化系住这些昆虫的难度，这对任何物种都是苛刻的。但西方玉米根虫是一种特别具有挑战性的昆虫系绳:前体是窄和短，使非常精确的附着与少量的粘合剂（在这种情况下的牙科蜡），以防止干扰对埃利特拉的开口飞行和头部，其中接触眼睛或天线会影响行为。同时，必须牢固地系上系绳，以避免被这种强大的传单移开。根虫成人系绳的示范是本文最重要的课题。它应该有助于其他谁与这种或类似昆虫，在这里可视化的方法可能是一个有用的选择。

本文介绍了用于有效系绳和描述以不同幼虫密度饲养的西方玉米根虫成人的飞行活性的方法。本研究中使用的飞行机和软件（图1）来自Jones等人在互联网上发布的^设计。安装在环境室中，旨在控制照明、湿度和温度（图2）。使用这个或类似设置以及以下技术允许测试因素，可能会影响飞行倾向和性能的西方玉米根虫，包括年龄，性别，温度，光周期，和许多其他。

研究方案

1. 用于飞行测试的后西玉米根虫

注:如果成人的年龄必须控制或知道，成人必须首先在现场收集，然后抚养他们的后代到成年进行测试。如果甲虫的年龄或标准化的饲养环境是无关的，那么直接测试现场收集的成年人是可能的，并且协议可以从步骤2开始。

1. 从感兴趣的玉米地收集至少500个西部玉米根虫，以确保获得足够的卵子来饲养足够数量的成年人。使用手动吸气器从现场收集成人。
   注:建议在美国玉米带7月下旬左右，在丰产高峰期收集成人，以确保男女的收集。大多数成年人将是男性，如果收集较早，而大多数将是女性，如果收集较晚。
2. 将采集的男性和女性成人放入一个网笼中，内含切碎的玉米耳、玉米叶组织、1.5%琼脂固体和排卵基板。18 x 18 x 18 厘米的保持架（网径 44 x 32，650 μm 孔径）一次可容纳 500 名成人。
   1. 使用在田里种植的玉米作为玉米耳朵的来源，这将在R3，或牛奶阶段的内核^开发19。R3内核外部为黄色，而内部流体由于淀粉积累而乳白色。玉米耳朵可以冷冻和储存长达一年，直到需要它们。要喂食根虫，请取出壳，将玉米切成约3厘米厚的水平横截面。切碎的玉米是成年人的主要饮食，应该每周换两次。
   2. 从任何年龄的温室种植的玉米植物中获得叶子。叶组织的数量会随着笼子里的成年人数量而变化。避免使用田间植物，因为它们可能会引起疾病。
   3. 要制作固体琼脂，将 15 克琼脂粉与 1 L DI 水混合。将混合物加热至沸腾。将液体倒入培养皿（100 mm x 15 mm），而它很烫。冷却后，在培养皿上盖上盖子，放入冷库（6°C）。Agar为成人提供水分来源，每周应更换两次。
   4. 要制备浮位基板，请将 40 克筛分的田间土壤 （<180 μm） 放入培养皿中。用去离子水滋润土壤。确保培养皿底部的土壤看起来湿润。使用针工具对湿润土壤的顶部进行评分。每周取出卵波基板，并在25°C和60%RH的培养箱中放置至少一个月。
3. 孵育卵子一个月后，通过250μm筛子清洗卵底板的含量，直到清除所有土壤。将洗净的鸡蛋放入10mL分级圆柱体中，对鸡蛋进行量化。每 1 mL 大约有 10，000 个鸡蛋。
4. 将定量的鸡蛋放入44mL容器中，用筛分的田间土壤覆盖（<180 μm）。西方玉米根虫蛋^在冬季20日都要经历绝育。要打破隔膜，将鸡蛋放入冷库（6°C）至少6个月。
   注:鸡蛋可冷藏5个月以上，但卵子的生存能力会随着时间而降低。12个月后，可能几乎没有孵化。
5. 至少5个月后，从冷库里取出卵子，放在25°C和60%RH的培养箱中。新生儿在从冷库中取出后16天孵化。
6. 一旦卵子孵化，将三个发芽的内核放在一个44-mL塑料容器的底部，其根部暴露（即，不覆盖土壤）。使用软毛刷将 12 个新生儿转移到根部表面。
7. 将 4.5 mL 的 DI 水添加到 40 mL 的筛土（<600 μm）。将湿润的土壤放在被新生儿侵扰的发芽核上，用网状织物覆盖容器，以防止幼虫逃脱。
8. 在44mL塑料容器与新生儿设置的同一天，准备一个473-mL容器与玉米仁，没有发芽。根虫幼虫稍后将被转移到这个较大的容器。内核数决定了每个植物所需的幼虫密度。加入120克土壤混合物，包括50%筛化田土（<600 μm）和50%灌注土壤，用20毫升去离子水润湿。
9. 7 天后，将 44 mL 容器的所有内容物转移到 473-mL 容器。幼虫在转移时将是第二颗星。
   注:这种转移到更大的容器是必要的，以提供足够的根质量通过幼虫喂养幼虫。
10. 观察成人的出现，通常在卵孵化后26天左右。成人在出现时是活跃的传单，在尝试用手收集时可能会逃离 473-mL 容器。相反，使用真空吸气器收集成人。
11. 如果需要进行比较测试，按性别和/或日期对成年人进行隔离。西玉米根虫的性别可以通过观察原生白^虫21的形态来确定。雄性有宽的，方形的胸腔，而女性是窄的和圆锥形的。
    1. 将甲虫放入 45 mL 透明聚苯乙烯塑料瓶中，并盖上 6 个小孔（直径约 1 毫米）的盖子。
    2. 麻醉甲虫。将连接到 CO₂罐调节器的管的末端放在盖子上的孔上，让 CO₂温和流动进入管约 10 到 15 s，直到成人失去对小瓶壁的抓地力。
       注:麻醉昆虫将保持固定约1分钟。
    3. 将麻醉甲虫，腹侧向上，在倒置的塑料培养皿底部。小心地将培养皿的非倒置盖放在甲虫上。确保甲虫的焦油压在盖子上，便于在解剖显微镜下观察胸腔。
12. 如果实验要求甲虫在飞行前交配，则使用至少 5 天大的雄性与新出现的女配。
    注:使用年龄较大的男性，确保他们在引入处女时性成熟。女性在成年后性成熟，而男性需要5至7天的后出现发育达到性^{成熟22，23。}

2. 在飞行测试前启动飞行磨机软件程序

注: 飞行机程序文件（在商业软件平台中运行的.vi 文件扩展名，参见材料表）及其使用详细信息均通过链接提供下载（"数据分析例程"和"循环飞行机厂说明"），分别在"飞行机布线和软件"部分的Jones^等人18网站。如果程序不再在软件平台的较新版本或未来版本中运行，或者用户想要添加新功能，则用户可以根据需要修改 Jones 等人¹⁸提供的例程。

1. 打开飞行铣刀软件程序 （图 3）。
2. 在"初始化"选项卡下输入信息。
   1. 设置飞行测试所需持续时间的开始时间和结束时间。
      注:所有成年人应在开始时间前 30 分钟将系绳并安装在飞行机身上。有经验的人可能需要30分钟到45分钟来系绳，并准备16只甲虫进行飞行测试（见第3节）。
   2. 将最小阈值（最小值）设置为 0。这确保了对飞行臂通过的任何检测都会被记录下来，这是Jones^等人18日建议的默认要求。
   3. 将最大阈值（最小值）设置为 1。在这里，使用了1分钟。此值意味着在传感器检测飞行臂之间必须经过 1 分钟才能"呼叫"飞行结束。
   4. 输入文件的名称。
   5. 将原始数据日志间隔（分钟）设置为 1。此值控制为输出报告编译原始数据的时间间隔。此处设置为 1 分钟。因此，例如，每分钟将记录旋转的输出。
      注: 传感器活动电子扫描之间的实际时间间隔非常短，但 1 分钟间隔允许以足够精细的量度进行记录，以便用于大多数研究目的，同时将电子表格输出中的行数限制为合理数量眼睛检查。
3. 在"主题信息"选项卡下，根据需要填写标有 ID、饮食、性别、物种和注释的列。
4. 单击屏幕显示左侧的"开始"按钮。程序将开始收集原始数据，一旦当前时间匹配开始时间。

3. 将西部玉米根虫系在飞行工厂

1. 将 40 mm 长度 28 规格的钢丝在中心弯曲 90°。
   注:导线可能还有铜或黄铜等金属。
2. 取少量的牙蜡，比针头稍大，在指尖之间滚动，直到形成球。确保手指清洁，以防止碎屑、污垢和油融入蜡中，因为它可以防止蜡附着在昆虫身上。
3. 将弯曲的导线的一端推入蜡球的中心。
4. 如上所述，使用 CO₂对测试成人进行麻醉（参见 1.11.1 和 1.11.2）。
5. 将麻醉成人放在平坦的表面上，并将其背侧向上放置。如果甲虫没有完全平放在表面上，重新定位腿，使其如此。甲虫必须尽可能平放在表面上，以确保导线的正确定位。
6. 用一个淡子打火机短暂地加热电线上的牙蜡（< 1 s）。如果蜡加热时间过长，熔化的蜡会从电线上脱落。如果蜡从电线上脱落，请勿重复使用，因为它不会有效地粘附在昆虫角质上。
7. 小心地将钢丝的末端与融化的牙蜡放在前方的背表面，同时指向导线的另一端（即，没有牙蜡的末端），沿腹部的中线。或者，如果需要，将没有牙蜡的导线末端指向头部。在这种情况下，飞甲虫会推动飞行手臂，而不是拉它。确保熔化的蜡不会进入埃利特拉或其缝合线，因为它可能会阻止或阻碍飞行。
8. 将导线的自由端放入飞行磨机臂的空心金属管的开口中。确保导线足够紧密地贴合，以便通过摩擦保持到位。系绳甲虫可以定位为顺时针或逆时针飞行。
9. 安装甲虫后，立即从较大的组织中撕下一小块（直径约 1 厘米）的纸巾。将纸巾片提供给悬挂在飞行磨坊上的系绳甲虫，以便进行柏油接触;大多数甲虫会抓住组织，并抓住它对抗重力，直到他们释放它在他们的第一次飞行活动开始。这将大大减少初始逃生或着陆飞行行为。
   注:人类在飞行测试室的存在应限于将成人从飞行机房中附加和移走。测试期通常不会开始，直到附件后至少 30 分钟（参见 2.2.1 下的注释），在此期间或测试期间本身不应在飞行室中。
10. 完成飞行磨机测试后，清除所有经过飞行测试的成年人。将导线从前名词中轻轻剥离，取出将系绳连接到前名词的蜡珠。蜡很容易分离，而不会损坏角质层，使昆虫可以进一步实验，如果需要的话。

4. 保存从飞行磨机程序收集的数据。

1. 程序可以设置为手动或自动。如果程序设置为手动，则用户必须通过单击"停止"按钮结束程序。如果程序设置为AUTO，则一旦当前时间与结束时间匹配，程序将停止收集原始数据。
2. 在飞行测试期结束后，单击"退出"。
3. 确保 TDMS 文件保存在程序初始化过程中输入的文件名下（步骤 2.2）。
4. 单击 TDMS 文件并将文档另存为电子表格 （.xlsx）。

5. 从保存的电子表格 （.xlsx） 检索飞行参数

注: 电子表格可以自定义设计为操作来自飞行磨机软件的原始数据输出。在这里，软件程序与Jones^等人18日描述的相同，但增加了一个额外的程序来识别和总结单个昆虫在测试期间最长的不间断飞行。

1. 对于参与飞行活动的每个人，电子表格将包括以下信息:航班号、总转数、开始时间、结束时间和飞行持续时间（以分钟）。
   1. 要计算测试期间飞行的总距离，请将标记为"总修订数"的列相和，并将其乘以每圈飞行的距离。每圈的距离取决于飞行臂从中心枢轴到附加昆虫的长度。例如，如果此距离为 15.9 厘米，则每次旋转相当于一米飞行。转数总数也可在"测试统计信息"选项卡中找到。
   2. 要计算测试期间飞行的总持续时间，将标记为"飞行持续时间（分钟）"的列求和。
   3. 要确定最长不间断飞行的距离和持续时间，请转到"测试统计信息"选项卡，并查看标记为"最长飞行*"的列下。
   4. 飞行速度可以通过将飞行距离除以飞行时间来计算。对于昆虫，速度通常以米/小时或公里/小时表示。

结果

图 4显示了飞行测试后预期输出的代表性示例。飞行数据来自爱荷华州立大学昆虫学系的实验工作。六天大，交配的西方玉米根虫成人被拴在飞行磨坊，并放置在一个受控的环境室设置在14:10 L:D，60%RH和25°C。甲虫在模拟黎明前30分钟开始连续22小时留在飞行工厂，并记录了它们的飞行活动（图4）。黎明和黄昏是在30分钟的时间里，通过从黎明时分到完全...

讨论

描述西方玉米根虫的飞行行为对于制定有效的抗虫管理计划具有重要意义。这种害虫的飞行行为已在实验室中使用各种方法进行了研究，包括电图仪、飞行隧道和飞行机。如本文所述和说明，飞行机允许昆虫进行不间断的飞行，以便研究人员能够在整个测试期间量化飞行参数，如飞行距离、持续时间、周期和速度。

与大多数昆虫物种一样，对西部玉米根虫进行飞行机厂实验?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butane multi-purpose lighter	BIC	UXMPFD2DC	To soften wax when tethering
Clear polystyrene plastic vial (45-ml)	Freund Container and Supply	AS112	To hold beetle while anesthetizing
Dehydrated culture media, agar powder	Fisher Scientific	S14153	To make agar for holding moisture for adults
Delrin rod (1" diameter, 3.75" long)	Many suppliers: can use cheapest on the internet.		For post of flight mill
Dental wax	DenTek	47701000335	Adheres wire tether to prothorax
Ferrite ring magnets (OD: 0.69”, ID: 0.29”, Thickness: 0.118”; 7oz pull)	Magnet Shop	63B06929118	Opposing - to generate the float.
Hall effect sensor	Optikinc	OHN3120U	Look under magnetic sensors on the left side of the Optekinc website then look for the part number. A link is given for current suppliers.
Hypodermic tubing (22 gauge; 0.0358” OD x 0.01975” ID x 0.004” wall)	Small Parts, Inc.	HTX-22T-12	Used for flight mill arms and main axis rod.
Incubator (104.1 x 85.4 x 196.1 cm)	Percival Scientific	I-41VL
LabVIEW Full Development System software, system-design platform	National Instruments (See http://www.ni.com/en-us/shop/labview/select-edition.html)	LabVIEW 2018 (Full Edition)	Provides environment needed to run flight mill files (.vi extensions) available for download from Jones et al.18 at http://entomology.tfrec.wsu.edu/VPJ_Lab/Flight-Mill.  LabVIEW 2018 Full is compatible with Win/Mac/Linux operating systems.
Mesh cage (18 x 18 x 18 cm)	MegaView Science Co. Ltd.	BugDorm-4M1515	mesh size = 44 x 32, 650 µm aperture
Needle tool	BLICK	34920-1063	For scoring soil surface for egg laying in laboratory
Nickel ring magnets (3/16” OD x 1/16” ID x: 1/16” thick)	K&J Magnetics	R311	Used to trigger the digital hall effect sensor.
Petri dish (100 mm x 15 mm)	Fisher Scientific	S33580A
Plastic container (44-ml)	Dart	150PC	For initial rearing of young larvae
Plastic container (473-ml)	Placon	22885	For rearing of older larvae
Round brush (size 2)	Simply Simmons	10472906	For transferring freshly hatched neonates to surface of roots
Sieve (250-µm)	Fisher Scientific	08-418-05	To separate eggs from soil
Steel wire (28-gauge)	The Hillman Group	38902350282
Teflon rod (3/8" diameter, 3/4" length)	United States Plastic Corporation	47503	To accept the rotating arm.
Vacuum	Gast Manufacturing, Inc.	1531-107B-G288X	For aspirating adults in laboratory
White poly chiffon fabric	Hobby Lobby	194811	To prevent escape of larvae from rearing container