使用免疫过氧化物酶和免疫荧光方法鉴定成年斑马鱼中的奥列辛和内他大麻素受体

摘要

这里介绍的是免疫组织化学表征和定位的orexin肽,orexin受体,和内分泌大麻素受体在肠道和大脑中正常和饮食诱发肥胖(DIO)成年斑马鱼模型使用免疫渗透酶和双免疫荧光法。

摘要

免疫组织化学(IHC)是一种高度敏感和特异性的技术,涉及在带有标记抗体的组织部分检测靶抗原。这是一个多步骤过程,其中每个步骤的优化对于获得最佳特定信号至关重要。通过IHC,可以检测出特定生物标志物的分布和定位,揭示进化保护的信息。此外,IHC还有助于了解生物标志物在病理条件下(如肥胖)的表达和分布变化。IHC,主要是免疫荧光技术,可用于成年斑马鱼检测植物遗传保护分子的组织和分布,但标准的IHC协议没有被破坏。Orexin和内分泌大麻素是两个高度保守的系统,涉及控制食物摄入量和肥胖病理学。这里报道的是用于获取有关orexin肽(OXA)、orexin受体(OX-2R)以及大麻素受体(CB1R)的定位和分布在肠道和大脑中正常和饮食诱发的肥胖(DIO)成年斑马鱼模型的信息的协议。还介绍了免疫过氧化物酶和双免疫荧光的方法,以及试剂的制备、固定、石蜡嵌入和斑马鱼组织的冷冻保护,以及内源性活动阻断步骤和背景的准备反染色。完整的参数集来自以前的IHC实验,通过这些实验,我们展示了免疫荧光如何帮助理解OX、OX-2R和CB1R在成年斑马鱼中的表达分布、定位和保存组织。生成的具有高度特异性信号强度的图像证实斑马鱼是适合于特定生物标志物分布、定位和进化保护的免疫组织化学研究的动物模型。生理和病理状况。这里介绍的协议推荐用于成人斑马鱼的IHC实验。

引言

免疫组织化学(IHC)是一种公认的经典技术,用于通过抗原-抗体相互作用1,2识别细胞或组织成分(抗原)。它可用于识别组织内目标生物分子的定位和分布。IHC使用免疫学和化学反应来检测组织第3部分的抗原。用于抗原-抗体相互作用可视化的主要标志物包括荧光染料(免疫荧光)和酶-基质颜色反应(免疫过氧化物酶),两者均与^抗体4结合。使用微观观察可以确定标记组织的定位,这大约对应于组织中目标抗原的定位。

荧光或色原反应检测蛋白质的两种方法:直接检测方法,即直接标记特定原抗体的方法;间接检测方法,其中原抗体未结合,而二级抗体携带标签5,6,7。间接方法具有一些优点,主要是信号放大。此外,与其他分子和细胞技术不同,免疫荧光,可以可视化两个或两个以上蛋白质在细胞^和组织7中不同表达的分布、定位和共表达。所使用的检测方法的选择取决于实验细节。

迄今为止,IHC被广泛用于基础研究,作为了解生物标志物的分布和定位以及从人类到无脊椎动物在生物组织中不同蛋白质的一般轮廓的有力和必要的工具。^9,10,11.该技术有助于显示大量正常和改变的动物器官和不同组织类型的蛋白质表达图,显示生理和病理变化引起的表达可能向下或向上调节。IHC是一种高度敏感的技术,需要准确性和正确选择方法才能获得最佳^结果12。首先,许多不同的因素,如固定,交叉反应,抗原检索,和抗体的敏感性可能导致假阳性和假阴性^信号13。抗体的选择是IHC中最重要的步骤之一,取决于抗原特异性及其与被调查的蛋白质和物种的^亲和力。

最近,我们优化了IHC技术,以检测成年斑马鱼组织中的奥西辛/脱脂素和内分泌大麻素系统的成员。我们主要专注于固定,组织嵌入使用两种不同的方法,切片和安装(这会影响分辨率和细节在微观分析),和阻塞(防止误报和减少^背景)14。其他重要特征是单个IHC协议的抗体特异性和选择性和可重复性。提供抗体特异性的关键是使用阴性对照(包括没有已知不表达目标蛋白的初级抗体或组织)以及阳性对照(包括已知表达目标蛋白^的组织)15.IHC抗体的选择基于其物种特异性(它们与感兴趣的抗原发生反应的可能性)和使用4、5、6的抗原抗体结合检测系统 ^,7.在免疫过氧化物酶的情况下,反应的颜色是由沉淀的色原的选择决定的,通常是二氨基苯胺(棕色)16。另一方面,i mmunofluoresence 利用与荧光团结合的抗体来可视化冷冻组织部分的蛋白质表达,并可轻松分析与染色体检测系统相及的多种蛋白质^5,7.

在免疫过氧化物酶技术中,二次抗体与生物蛋白结合,生物锡是一种链接分子,能够招募致色报告分子[avid-生物蛋白复合物(ABC)],导致染色信号的放大。使用ABC报告器方法,过氧化物酶与3,3'-二氨基苯甲酸酯(DAB)发生反应,产生强烈的棕色染色,酶与二级抗体结合,然后用普通光学显微镜进行分析。ABC染色,由于阿维丁对生物锡的高亲和力,产生快速和最佳的反应,很少有二级抗体附着在原抗体反应的部位。这种色谱检测方法允许对信号进行密度分析,提供基于棕色信号水平与蛋白质表达^水平18相关性的半定量数据。

使用免疫荧光技术,由于不同荧光铬能够以独特的波长发出光,可以同时检测多种蛋白质,但仔细选择荧光铬以尽量减少光谱重叠^{非常重要。5.}此外,在不同宿主物种中使用原抗体可最大限度地减少交叉反应方面的困难。在这种情况下,每个物种特异性的二级抗体只识别一种类型的原发抗体。荧光记者是小有机分子,包括商业衍生物,如Alexa氟染料。

许多动物模型用于了解特定的生理和病理条件。迄今为止,已经确定许多代谢途径在进化过程中被保存。因此,在斑马鱼等模型生物体上的IHC研究,可以深入了解病理和非病理状况的起源和^维持17。本报告旨在说明可在成年斑马鱼组织上执行的IHC协议,用于获取OXA、OX-2R和CB1R在外围和中央层面的分布和定位的详细图像。报告还报告了在成年斑马鱼的周围和中心组织中应用两种主要IHC间接方法的协议。描述是间接方法,它允许在二级抗体与荧光染料(免疫荧光法)或酶报告器(免疫过氧化物酶方法)结合的情况下进行信号扩增。色化检测和荧光检测方法各有优缺点。该协议中报告是在成年斑马鱼中使用IHC,主要是免疫荧光,一种动物模型,广泛用于研究在不同生理和病理条件下进化保存的系统。

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研究方案

1. 免疫过氧化物酶方案

注:斑马鱼是由Omid Safari教授(伊朗马什哈德马什哈德费尔多西大学自然资源和环境系渔业系)获得。

1. 组织解剖
   1. 通过浸入冰水中牺牲斑马鱼(5部分冰/1部分水,4°C);离开他们,直到停止所有运动,以确保死亡的缺氧。
   2. 使用以下解剖方法快速切除肠道和大脑:
      1. 将鱼擦干,放在纸巾上,然后放在解剖垫上,阻塞眼窝的腹腔部分和尾巴的肉质部分。
      2. 对于肠道:切皮肤,小心地从鱼的一侧去除皮肤和底层肌肉,直到内部器官可见。从体腔中取出肠子,将其伸出。
      3. 对于大脑:用剃刀取下头部。用钳子从头骨的腹侧取出软组织。打开头骨,从大脑的腹侧取出骨头。从大脑的背侧去除皮肤和头骨。取出大脑。
2. 组织固定
   1. 在室温(RT)下,将新鲜4%的副质脱甲(PFA)浸入磷酸盐缓冲液(PB,pH 7.4,4°C)3小时,修复解剖组织。
      1. 在 450 mL 蒸馏水 (dH₂O) 中溶解 1.755 g 的 NaH₂PO₄H₂O 和 4.575 g 的 Na₂HPO_4,并调整到 pH 的 pH 7.4,且必要量为 NaOH 1N,从而制备 0.1 M PB。
      2. 通过在热板上搅拌,在 0.1 M PB (pH 7.4) 的 100 mL 中制备 4% PFA 溶解 4 g 的 PFA。当温度达到60°C时,加入2-4滴NaOH 1N,以获得清晰的溶液。在 RT 处将 PFA 保留 4%,并控制 pH。将 pH 调整到 7.4。
         注:组织固定超过4~6小时可能导致过度固定,从而掩盖抗原,限制抗体-表位结合。固定时间取决于组织大小。
3. 组织嵌入
   1. 将纸巾冲洗5次,每次5分钟,浸入0.1M PB(pH 7.4)。
   2. 通过随后浸入酒精 70%(6 分钟)、80%(6 分钟)、95%(5 分钟)、95%(5 分钟)、100%(1 分钟)和 100%(1 分钟)来脱水组织。
   3. 将组织浸入100%酒精:二甲苯(1:1)10分钟,然后2倍在二甲苯中,每次5分钟。
   4. 直接浸入石蜡,将石蜡(56°C)两次渗透,每次1小时。
   5. 在室温 (RT) 下将组织嵌入石蜡块中,并储存在 RT 直到切片。
4. 组织切割
   1. 用微缩器将组织切成8微米厚的冠状或下垂部分,并交替将部分收集到水面上的粘合玻璃玻片上,并在38°C下加热。
   2. 在 37°C 下干燥幻灯片,在 37°C 下过夜。
5. 组织部分的脱蜡和再水化
   1. 将部分浸入二甲苯5分钟,然后浸入二甲苯3分钟。
   2. 通过后续的幻灯片浸入酒精 100% II (1 分钟)、100% I(1 分钟)、95%(1 分钟)、75%(1 分钟)、50% (1 分钟)来补充部分,然后将幻灯片置于 dH₂O(5 分钟)中。
      注:在开始反应之前,完全脱蜡部分。如果部分仍然有石蜡的痕迹,在二甲苯中再浸泡5分钟或更长时间。
6. 抗原检索
   1. 将滑片浸入溶液中,在微波炉中加热 5 分钟,用玻璃酸盐缓冲液(0.01 M,pH 6.0)处理各部分。
   2. 让部分冷却。
   3. 在微波中以最大功率重复5分钟的循环,以完成抗原检索。
      1. 在 100 mL 的 dH₂O 中溶解 2.10 g 柠檬酸,在 200 mL 的 dH₂O 中将柠檬酸钠 (0.01 M) 与柠檬酸 (0.01 M) 混合,以 1:4 的比例按体积将柠檬酸溶解,从而制备柠檬酸缓冲液(0.01 M),并将 pH 调整到6 使用 HCl 0.1N。
7. 阻断内源性过氧化物酶
   1. 用耐溶剂笔划分幻灯片上的组织区域。
   2. 用三缓冲盐水溶液(TBS)(0.1 M,pH 7.3)冲洗部分3次,每次5分钟。
      1. 在 950 mL 的 dH₂O 中溶解 12.1 g 的 trizma 基和 9 g NaCl,并在 HCl 0.1N 下调节到 pH 7.3,从而制备 0.1 M TBS。
   3. 在RT处,在0.75%H₂O₂溶液中滑动浸泡,以5分钟的速度阻止内源性过氧化物酶活性。
      1. 准备 0.75% H₂O₂溶液溶解 5 mL 30% H₂O₂在 195 mL 的 dH₂O。
         注:ndogenos酶可与IHC试剂发生反应,并产生假阳性结果。此外,高度血管化组织表达许多内源性过氧化物酶,这可能导致强烈的非特异性染色和背景水平。处理0.75%H₂O₂淬火内源性过氧化物酶,并显著减少非特异性背景。
8. 阻止非特异性宾迪ng 站点和组织渗透
   1. 用TBS/0.4%Triton (TBS-T)阻断缓冲液(含有原发性抗血清(NRS)孵育组织部分,在RT处孵育30分钟,以阻止非特异性结合位点。
      1. 在 100 mL TBS 中溶解 0.4 mL 的 Triton X-100,制备 0.4% Triton。
      2. 通过在 TBS 中溶解包含 0.4% Triton X-100(正常血清 1 mL = 8.2 mL 的 TBS = 0.48 Triton X-100)中的 1% 正常血清,制备阻塞缓冲液 TBS-T 溶液。
         注:根据次生抗体的宿主选择动物血清的种类(例如,使用山羊抗兔子二级抗体时,使用正常的山羊血清)。
9. 与原抗体的组织孵育
   1. 在RT的潮湿箱中孵育部分过夜,在TBS-T中稀释原抗体。用以下初级抗体染色各部分:
      1. 山羊抗体对OX-2R稀释1:200,识别蛋白质的C端。
      2. 山羊抗体对OX-A稀释1:200[或exin-A(C-19)],识别蛋白质的C端。
         注:确保原抗体与感兴趣的生物分子发生反应。定义主要抗体使用基因对齐作用的生物分子的表位。例如,OX-A 表位已映射在人类 OX-A (O43612) 的 aa 50–100 之间,而 OX-2R 表位已映射在人类 C 端的最后 50 aa 附近。
10. 二次抗体的组织孵育
    1. 用 0.1 M TBS (pH 7.3) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    2. 在RT用生物仿当二级抗体和兔子抗山羊免疫球蛋白(H+L)与生物蛋白结合孵育1.5小时,然后在TBS-T中稀释1:100。
       注:测试并找出初级和次级抗体的不同稀释,以找到允许减少背景的最佳稀释。
11. 过氧化物酶反应
    1. 用 0.1 M TBS (pH 7.3) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    2. 用阿维丁生物复合物(ABC)孵育各部分1小时。
       1. 准备 ABC 解决方案,在 TBS 的 5 mL 中添加两滴组件 A,然后加入两滴组件 B。
    3. 用 0.1 M TBS (pH 7.3) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
    4. 用色原基质3,3'-二氨基苯甲酰胺-4(DAB)处理各部分。
       1. 制备 DAB 溶液,将 DAB 色原浓缩物加入一滴(约 30 μL)至 1 mL 的 DAB 稀释剂,并在使用前充分混合。
          注:在使用前至少30分钟准备ABC溶液,并将复合物保持在4°C,直到使用后允许稳定的avidin/生物素结合。准备新鲜的 DAB 工作溶液,应用于组织部分,并开发,直到颜色合适。当色原反应将表位位转换为棕色,并且信号强度适合成像时,继续下一步。DAB 开发的时间可能从几秒钟到 10 分钟不等。对于 OX-A 和 OX-2R 1,2 分钟就足够了。小心处理 DAB,因为它具有致癌性。
12. 组织脱水和安装
    1. 用 0.1 M TBS (pH 7.3) 冲洗所有部分 3x,每次 5 分钟,以停止 DAB 反应。
    2. 通过后续的幻灯片浸入酒精 50%(2 分钟)、75%(2 分钟)、95%(2 分钟)、100% I(2 分钟)、100% II(2 分钟)来脱水部分。
    3. 将2倍的二甲苯浸入其中,每次10分钟,以浸入2倍来澄清切片。
    4. 使用 DPX(二丁基邻苯二甲酸酯二甲苯)安装部分,用于组织学,在幻灯片中添加两滴安装介质,然后缓慢地用盖玻片浇头。
       注:由于组织在脱水期间浸入酒精浓度增加会导致组织酒精渗透和用酒精替代水,确定精确的脱水时间,不要过度脱水组织。脱水后在二甲苯中进行浸入,以澄清组织并去除任何多余的或残留的酒精。
13. 控制
    1. 重复第1.1~1.12节,省略原抗体和/或用TBS替代原抗体或二级抗体IgG(阴性对照)。
    2. 重复部分1.1~1.12预吸收每个原抗体与过量的相对肽(100毫克肽/1 mL稀释抗血清)。
    3. 使用不同的组织作为正对照(例如,小鼠组织)重复第 1.1-1.12 节。
       注:在开始之前,请新鲜准备所有缓冲区。在每个步骤时,用移液器或滤纸在各部分周围小心地清除多余的液体,始终保持部分湿润。
14. 图像采集和分析
    1. 使用配备数码相机的显微镜,在恒定的光照下以相同的放大倍率获取数字图像。
    2. 使用成像软件对染色强度进行半定量分析(参见材料表)。
       1. 以 .lif 或 .tiff 文件格式打开捕获的图像,以评估 OX-A 或 OX2-R 正性指数。
       2. 选择"测量"下的按钮,然后单击"手动计数"。通过单击鼠标在正单元格上放置标记,直接从屏幕上计算染色单元格配置文件的数量。
       3. 选择感兴趣的区域 (ROI) 区域 (3 x 10³ μm²) 来量化免疫信号密度(光密度、OD)。
       4. 确定分析图像内强度最高(高正)和最小强度(负)的像素,以指定零为背景值(即,没有染色细胞的组织部分)。
       5. 通过处理对数吸收度刻度来评估 OD。在数字图像分析中,DAB 像素强度范围从最暗(0 值)到最亮(255 值)阴影。
       6. 通过绘制以下直方图来确定 OD:日志₁₀(255/I),其中"I"是程序给出的像素强度值,并通过减去背景来确定。
          注:永久稳定的免疫过氧化物酶反应可随时在明场显微镜下分析。在备用截面上执行标记单元格的计数,以避免从相邻截面重复计算同一单元格。

2. 免疫荧光方案

1. 组织解剖
   1. 如第 1.1 节所述,牺牲和解剖动物。
2. 组织固定
   1. 在 4°C 下浸入 4% PFA 中 3 小时,修复肠道和大脑。
      1. 如第 1.2.1 节所述,准备 PB 和 4% PFA。
         注:固定时间取决于组织大小。组织固定超过4~6小时可能导致过度固定,从而掩盖抗原并限制抗体表位结合。
3. 组织嵌入
   1. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗组织 3 次,每次 5 分钟。
   2. 对于冷冻保护,将组织转移到PB(0.1 M,pH 7.4)中的20%蔗糖,并在4°C过夜。然后,将组织转移到0.1 M PB(pH 7.4)中的30%蔗糖,并在4°C下再维持一个晚上。
   3. 将组织嵌入最佳切割温度 (OCT) 化合物块中。为此,准备一小块液氮,取铝箔,切成两半,形成一个锅。含有充满OCT化合物的纸巾必须浸入液氮中,直到OCT化合物冷却。冷冻组织可储存在-80°C,直到切片。
4. 组织切割
   1. 将冷冻组织块转移到-20°C的低温中,切成10μm的冠状或下垂部分。
   2. 将组织以备用序列部分收集到适合免疫组织化学的胶合玻璃玻片上,并将其储存在-20°C,直到使用。
      注:将幻灯片存储在 -20 °C 和 4°C 之间,放在深色幻灯片盒或幻灯片簿中。
5. 阻止非特异性结合位点和组织渗透
   1. 使用耐溶剂笔划除幻灯片上的组织区域。
   2. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
   3. 用1%正常驴血清在渗透缓冲液PB-Triton X-100 0.3%(PB-T)中孵育30分钟,在RT中渗透细胞膜并阻断非特异性结合位点。
      1. 制备 Triton X-100 0.3% 溶解 0.3 mL 的 Triton X-100 在 100 mL 0.1 M PB (pH 7.4) 中溶解 0.3 mL。
      2. 制备阻断液溶解1%正常驴血清在PB含有0.3%TritonX-100。
         注:用于渗透和阻断缓冲液的血清的动物种类取决于二次抗体的宿主。
6. 培养与原抗体混合
   1. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
      1. 在RT的湿箱中孵育部分过夜,在PB-T中稀释原抗体。可以使用以下初级抗体的混合:山羊抗体对 OX-2R 稀释 1:100/兔子抗体对 CB1R 稀释 1:100,或山羊抗体对 OX-A 稀释 1:100/兔子抗体对 CB1R 稀释 1:100。
7. 培养与二次抗体的混合
   1. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
   2. 在RT孵育2小时,1)混合驴抗兔子Alexa Fluor 488结合二级抗体和驴抗山羊Alexa Fluor 594-结合二级抗体稀释1:100在PB-T;或2)混合驴抗山羊Alexa Fluor 488-结合二级抗体和驴抗兔子AlexaFluor 594-结合二级抗体稀释1:100在PB-T。
      注:使用在同一动物宿主中开发的二级抗体。正常血清必须属于同一种的二次抗体(例如,使用在驴和驴正常血清中开发的二级抗体)。用含有洗涤剂的阻断缓冲液稀释原抗体和二级抗体,以增加细胞渗透和减少背景。
8. 组织安装
   1. 用 0.1 M PB (pH 7.4) 冲洗 3 部分,每次 5 分钟。
   2. 用核染料DAPI(4',6-二酰胺-2-phenylindole)对部分进行反污染,在3 mL的PB中制备溶解1.5μL的DAPI(1mg/mL)。
   3. 带安装介质的盖玻片滑轨(参见材料表)。这种水性安装介质可稳定组织样品和污渍,用于长期使用。荧光样品可储存在黑暗中4°C。要延长氟利昂的使用寿命,请使用抗馈安装介质。
      注:选择良好的安装介质。安装剂最重要的参数之一是折射率(nD),折射率(nD)应为1.5左右,即玻璃的折射率。此处使用的安装介质特别可用于为酶和脂质测定制备的标本(即,不得用酒精上升系列脱水的试样)。
9. 控制
   1. 重复 2.1-2.8 部分,省略原抗体或二级抗体,或在特定步骤中用 PB(负控制)替换初级或二级抗血清。
   2. 重复部分2.1~2.8,用过量的相对肽(100mg肽/1 mL稀释的抗血清)预吸收每个原抗体。
   3. 在小鼠大脑切片(正控制)上重复第 2.1~2.8 节。
      注:在开始之前,请重新准备所有缓冲区。在每个步骤时,用移液器或滤纸在各路段周围小心地清除多余的液体,始终保持部分的湿度。
10. 图像采集
    1. 使用配备 x-y-z 电动舞台、数码相机以及采集和图像分析软件(如 NIS-Elements C)的共聚焦显微镜来观察和分析免疫染色部分。使用 5-20-40x 目标获取数字图像。
    2. 在每个可用通道中以低放大倍率(10 倍或 20 倍目标)拍摄每个部分的图像,以组成低放大倍率蒙太奇,提供整个区域的概览,以方便 OX-2R/CB1R 的本地化和文档化解剖共表达。在分析之前,将荧光图像标准化为最大的对比度和叠加。
    3. 收集整个感兴趣区域的连续 Z 堆栈图像。通过六个焦平面(Z 步)采集图像,焦阶为 1~1.8 μm,以覆盖 OX-2R/CB1R 共表达可视化为黄色双锥形的组织体积。使用 Z 电动显微镜分别为每个通道(红色、绿色、蓝色)执行此集合。
    4. 使用成像反卷积软件通过应用十次迭代来对图像进行去卷,并将串行 Z 平面图像折叠到单个最大投影图像中。
    5. 使用 Adobe Photoshop 6.01(加利福尼亚州圣何塞的 Adobe 系统)调整显微图以进行光和对比度。
       注: 在观察过程中执行去卷积步骤以进一步减小背景。将幻灯片曝光限制在光线下,以防止光漂白。
11. 图像分析
    1. 通过覆盖每只动物的所有感兴趣区域,对交替的 10 μm 厚部分(n = 每组 5 只动物)执行 OX-2R/CB1R 共表达的定量分析。
    2. 通过半自动化的图像分析系统,将 OX-2R/CB1R 共表达量化为黄色正双核的数量。Imagins 软件可以提供更高级别的细节,其中包含有关不同荧光探针之间重叠区域的定量数据。
    3. 使用阈值工具在两个通道中测量信号强度,量化双光。打开 .liff、.tiff 或 .jpg 图像文件,然后选择"图像阈值"。选择"自动设置"或"手动方法"并调节阈值,直到选择所有染色的双色。分析图像中不包含任何免疫标记对象的区域中的像素强度分布,以获得背景阈值。为每个图像单独确定此背景。然后,程序通过将像素强度的基线设置为背景值来删除背景阈值。
    4. 选择"分析"和"测量"并选择要测量的参数(标点强度最小值、最大值和平均值;免疫标记的双核子的数量/密度)。
    5. 在每个部分,使用位于上方或下方的堆栈到最佳对焦平面,沿 4 个 Z 堆栈中的组织体积计算黄色双节。从分析中排除焦点区域。
       注: 在备用节上执行标记单元格的计数,以避免从相邻部分重复计数相同的单元格。

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结果

免疫过氧化物酶染色的代表性数据如图1和图2所示。 成人斑马鱼肠道OX-A和OX-2R分布的免疫组织化学分析表明,OX-A和OX-2R的定位位点不同,在DIO斑马鱼肠道细胞中表达增加。在内肠和前肠的细胞中观察到OX-A的强烈棕色染色(图1A,A1)。OX-A的免疫表达在不同的肠道组成中发出明确的信号,从前向内肠下降(图1B,B1)。

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讨论

样品制备

样品制备是IHC的第一个关键步骤。可靠的协议允许维持细胞形态、组织架构和抗原性。此步骤需要正确的组织收集、固定和切片^22、23。固定的目的是保存组织,减少组织酶或微生物的作用。特别是,固定步骤可保留细胞成分和生物分子,防止细胞成分(如抗原和酶)的自解和转移,稳定细胞材料免受以下程序的?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti CB1	Abcam	ab23703
Anti OX-2R	Santa Cruz	sc-8074
Anti-OXA	Santa Cruz	sc8070
Aquatex	Merck	1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat	Vector Lab	BA-5000
citric acid	Sigma Aldrich	251275
Confocal microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti2
Cryostat	Leica Biosystem	CM3050S
DAPI	Sigma Aldrich	32670
Digital Camera	Leica Biosystem	DFC320
Digital Camera for confocal microscope	Nikon	DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies	Thermo Fisher	A21207
Ethanol absolute	VWR	20,821,330
Frozen section compound	Leica Biosystem	FSC 22 Frozen Section Media
H2O2	Sigma Aldrich	31642
HCl	VWR	20,252,290
ImmPACT DAB	Vector lab	SK4105
Microscope	Leica Biosystem	DMI6000
Microtome	Leica Biosystem	RM2125RT
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
NaH2PO4H2O	Sigma Aldrich	S9638
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
Normal Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Normal Rabbit Serum	Vector lab	S-5000
paraffin wax	Carlo Erba	46793801
Paraphormaldeyde	Sigma Aldrich	P6148
sodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	W302600
Triton X-100	Fluka Analytical	93420
Trizma	Sigma Aldrich	T1503
VectaStain Elite ABC Kit	Vector lab	PK6100
Xylene Pure	Carlo Erba	392603