精确实施最小红斑剂量（MED）测试，以评估人体炎症反应中的个体变异

摘要

最小红斑剂量 （MED） 测试用于确定紫外线辐射光疗的剂量时间表。它可以评估炎症反应的个体变异，但缺乏实现可重复结果的方法。在这里，我们介绍了MED的精确实现，并展示了它捕捉炎症反应个体变异的能力。

摘要

最小红斑剂量 （MED） 测试常用于临床设置，以确定在皮肤表面产生红斑（炎症变红）所需的最小紫外线 （UV） 照射量。在此背景下，MED被视为确定紫外光疗法的起始剂量，如牛皮病和湿疹的起始剂量。在研究环境中，MED 测试也有可能成为评估炎症反应中和人之间变化的有力工具。然而，MED测试没有被广泛用于研究环境，可能是由于缺乏已公布的指南，这是从该测定中获得可重复结果的障碍。此外，建立MED的协议和设备差异很大，因此很难比较不同实验室的结果。在这里，我们描述了一种精确和可重复的方法，使用新设计的协议和方法诱导和测量表面红斑，这些协议和方法可以很容易地适应其他设备和实验室环境。此处描述的方法包括详细的程序，将允许推断一个标准化剂量时间表到其他设备，以便此协议可以适应任何紫外线辐射源。

引言

最小红斑剂量（MED）测试是FDA批准的评估对辐射的皮质敏感性的程序，通常在UVB范围内，尽管MED可以在紫外线和可见^光谱1的其他波长确定。红斑被定义为由毛细血管的灌注引起的皮肤表面的浅发（红斑的后期阶段更通常被称为晒伤）。MED 测试已广泛应用于皮肤科文献和临床光疗设置中，以识别紫外线 （UV） 辐射的最小量，从而产生皮肤红度可测量变化的最小单位。MED 测试可通过市售的紫外线灯完成，相当于大多数商业制革设施中使用的紫外线灯。

MED测试涉及紫外线辐射或光从可见光谱到皮肤表面持续分散，在预定的时间长度，剂量时间表主要取决于皮肤的色素沉着和辐射的强度和类型.这个程序通常用于临床设置，以确定患者接受紫外线放射治疗的皮肤条件，如牛皮病和湿^疹2，3的剂量时间表。在临床环境中确定MED的基本程序已在其他地方^描述，并可用于调整紫外线辐射的总剂量向上或向下，这取决于皮肤敏感性的个别变化。

皮肤色素沉着可能是MED^程序6中进行和测量结果的最重要的主题特定变量。这是因为唤起最小红斑反应所需的紫外线照射持续时间主要取决于参与者皮肤的亮度或黑暗度，由参与者的菲茨帕特里克皮肤类型 （FST） 定义。FST⁷是一种对人体肤色进行分类的数值方案。菲茨帕特里克鳞表是皮肤学研究人类皮肤色素^沉着8，9公认的工具，并将人类皮肤分为六大类之一，从最轻（FST I）到最暗（FST VI）。

较暗的 FST 类型需要较长的紫外线持续时间，因此准确分类 FST 非常重要。关于准确评估FST的方法，有广泛的文献，使用各种方法，包括自我报告，皮肤科医生访谈和仪器为基础的评估。FST 的观察者评级已被证明与当前（而不是自然肤色^10）相关，但 FST 可通过问卷¹²和/或客观评估通过自我报告主观地确定¹¹分 光 光度 法。菲茨帕特里克通过分光光度测定进行打字，在一些研究中，10、13、14、15的一些研究已经证明与参与者的自我报告密切相关。

尽管MED检测在临床服务中具有实用性和广泛应用，但该程序在实验室环境中并未被广泛采用，用于测量针对亲炎刺激的个体变异。此处概述的方法的目的是提供提高 MED 测试程序的精度和可重复性的技术和分步程序，以便今后在侧重于细粒度的实验室环境中开展工作炎症反应中个体内变异性的定量。我们进一步提供具有代表性的结果，说明此标准化协议准确捕获炎症中人对人变异的能力。

研究方案

下文所述的所有方法，包括使用人类志愿者，都经过当地机构审查委员会（IRB）的审查和批准，并符合《赫尔辛基宣言》和《贝尔蒙特报告》。所有参与者（N=72）签署了IRB议定书所禁止的知情同意。纳入/排除标准和中止程序旨在最大限度地提高参与者的安全，任何偏离这些程序的问题都应考虑到这些程序对风险的影响和对人体的容忍程度。就本文介绍的工作而言，排除性标准将参与限制为没有个人或家族有炎症病史的个人或任何合法或非法物质。这样做的理由是这些因素可能会影响对 MED 测试过程的响应。

1. 参与者选择

1. 使用以下包含标准:18-55岁;由医疗症状检查表（MSCL）5确定的普通健康良好;能够理解和沟通用英语提出的实验室安全协议;可以提供书面同意。
2. 使用以下排除标准:菲茨帕特里克皮肤类型 I，由自我报告确定;定期使用商业制革设备;在计划的接触地点的皮肤伤口或病变;目前的皮肤癌，或皮肤癌的个人病史;皮肤癌家族史;糖尿病;银屑病或其他炎症性皮肤状况;外周血管疾病、外周动脉疾病、雷诺病或任何其他诊断的循环系统疾病;任何非自愿运动障碍;对胶带过敏;服用吸入类固醇治疗哮喘（如氟提他酮）;服用任何皮质类固醇;下列2项或以上（诊断为高血压、高脂血症、高胆固醇、吸烟、冠心病或动脉粥样硬化症家族史（55岁前的父母/兄弟姐妹））;活性物质依赖 - 合法或非法;物质依赖者恢复新（不到一年）;在过去3个月内使用影响中枢神经系统功能的药物，包括精神药物、阿片剂药物或皮质类固醇;任何处方的精神药物，目前或在过去3个月（其中包括治疗焦虑、抑郁或其他心理问题的药物）。

2. MED 的日程安排和准备

1. 安排两个约会的参与者:第一次，MED曝光事件（约45分钟），第二次，收集分光度读数的后续（约10分钟）。在第一次预约后，将后续预约安排为 24 小时。
2. 在学员到达之前，布置并设置基本设备，包括两个剂量测试袖口和安全设备。为参与者和研究人员提供各种防紫外线防护服（如防紫外线运动套、防紫外线手套、长袖医用磨砂、防紫外线床单和胶带，以覆盖所有暴露在紫外线下的皮肤辐射。
3. 根据制造商规格校准分光光度计。为每个主题和每个会话执行此操作。

3. 确定菲茨帕特里克皮肤类型 （FST）

1. 当参与者到达参加 MED 曝光事件（访问 1）时，通过自我报告或分光光度法确定 FST。为了最大限度地提高参与者的安全性，不要对被归类为 FST 1 的参与者进行 MED 测试。对于所有其他菲茨帕特里克皮肤类型 （2+6），使用 FST 分数来确定应使用哪种曝光计划。

4. 袖口 1 申请

1. 向学员解释 MED 测试的工作原理，并在继续操作之前征求问题。
2. 通常，在非主导前臂内侧执行 MED 程序。
3. 放置袖口 1 （去除所有孔径覆盖物） 避免雀斑， 摩尔， 疤痕， 头发 （尽可能）， 和皮肤上的任何削减， 挫伤或病变.仅从袖口 1 的侧侧（而不是中央）部分拆下保护蜡纸背衬。重要的是，不能去除 Cuff 1 中央部分的蜡纸背衬，因为粘合剂在基线读数后剥离时具有很强的刺激皮肤的潜力，导致皮肤接近孔径发红。
4. 在预定曝光地点放置袖口 1 后，使用永久标记放置地标，以确保袖口 2 将位于完全相同的位置。将皮肤标记在袖口 1 的每个侧皮瓣的折痕之外的四个点，右上、左上、右下和左下角。
   1. 使这些标记足够暗，以生存约24小时，因为他们也将被用来把Cuff 3在完全相同的位置在后续预约24小时后。

5. 基线读数:袖口 1 应用程序

1. 使用根据制造商规格校准的分光光度计，按顺序获取并永久记录六个开放孔径中的每个孔径的读数。
2. 确保分光光度计放置在袖口孔的中心，同时尽可能避免摩尔、疤痕或其他瑕疵。
3. 永久记录所有"SCI"值（L、A、B）。为确保具有相同校准点的读数一致，在 MED 过程中将分光光度计保持在ON中，在曝光后读数完成之前不要关闭。
4. 记录基线分光度测量后，拆下袖口 1。为了尽量减少参与者的不适，在袖口 1 的周围涂抹医用粘合剂溶剂，以免手臂上的头发被痛脱。

6. 曝光前读数:袖口 2 应用

1. 去除袖口 1 后，使用在皮肤上绘制的"袖口 1"地标将袖口 2 定位在同一位置。可以暴露并涂抹完全的胶粘剂衬垫，以确保 Cuff 2 密封充分，以防止由于对皮肤的粘附性不足而使孔径之间交叉暴露。
2. 让参与者和研究人员都穿上防紫外线防护服和安全配件。至少，参与者、操作程序的技术人员和房间里的任何其他各方必须戴防紫外线眼镜。技术人员应穿长袖或使用防紫外线套筒。
3. 在激活灯泡之前，让技师协助学员覆盖所有裸露的皮肤，包括贴片上方的手臂、贴片下方的手臂和手腕、手以及可能暴露在贴片侧面的手臂前或后部（UV-保护纸和胶带，以粘贴的纸张可能有助于这一点）。此外，一些穿着开放领口衬衫的参与者可能希望将防紫外线布覆盖在颈部和胸部，如果这些区域靠近紫外线源。
4. 将防紫外线布铺在参与者的手臂下（以减少表表面的反射率）。

7. MED 程序:暴露前

注:灯的光线必须垂直于曝光部位。一般来说，灯的物理运动比运动或安排参与者手臂的角度的可能性小。

1. 在激活灯泡之前，请安排参与者的手臂，使灯中的紫外线垂直于参与者手臂上的袖口 2 角度。
2. 识别学员手臂上的灯和袖口 2 之间的适当距离。将辐射计传感器朝向与皮肤表面平行的紫外线灯，并尽可能靠近袖口 2 的位置。
3. 用防紫外线布盖住学员手臂以防止暴露，并短暂激活灯以调整到袖口 2 的距离，直到辐射计的传感器读数为 270 μW/cm²。
   1. 要达到此读数，请调整灯与皮肤表面之间的距离，直到辐射计读取 270 μW/cm² （± 10 μW）。确定适当距离后，停用灯。
      注:这里需要注意的是，辐射计角度的微小差异将极大地影响读数。因此，辐射计的角度应尽可能接近皮肤表面的平行度。
4. 在整个曝光过程中进一步调整距离，以防止手臂位置漂移。每次读数时，确认距离并根据需要进行调整，以将辐射计读数保持在大约 270 μW/cm² （± 10 μW） 处。

8. MED 程序:暴露

1. 使用秒表实现 MED 计划。在激活紫外线源之前，拆下第一个孔径覆盖物。根据 FST，同时激活源和秒表，并根据下面指定的计划移除袖口 2 上的每个光圈覆盖物。
2. 在每个孔径覆盖物的去除点，记录辐射计读数时，辐射计与皮肤表面平行，并指向灯。如果距离发生变化，请调整到灯的距离，以确保辐射计再次读取 270 （± 10） μW/cm²。
3. 让技术人员监控学员的手臂，以确保一致的定位。特别是，如果手臂旋转，请调整手臂，因为许多参与者在放松时会旋转手臂。进行任何调整后，重新确认辐射计读数为 270 μW/cm² （± 10 μW）。
4. 在表1中剂量表规定的准确时间关闭灯。请勿停用秒表，因为应在灯停用后 7 分钟收集额外的分光光度计读数，如下所述。

9. 7 最小暴露后读数

1. 在灯停用后整整 7 分钟，在 Cuff 2 中记录每个光圈的最终分光光度计读数。在暴露程序之后立即收集数据的目的是首先确认对紫外线辐射没有不良反应，其次评估初始反应，在某些情况下，反应可能很小，但与基线（显著不同）曝光前）值。7 分钟后红度的任何增加都可能是热效应，而不是红斑。
   注:7分钟后对紫外线辐射暴露的不良反应可能与太阳麻疹的最小剂量有关，这是一种获得性光敏性障碍。光敏性障碍在MED程序之前进行评估，应排除这些紊乱的受试者。但是，如果在测试期间的任何一点都观察到这种情况，则应立即停止暴露协议。
2. 暴露于紫外线辐射后，袖口 2 可能特别难以去除。如有必要，使用医用级粘合剂溶剂，以尽量减少在取出袖口 2 时对参与者的不适。皮肤特别高毛或其他敏感皮肤的参与者可能会发现，在 Cuff 2 的边缘下涂抹橄榄油或酒精性粘合剂去除剂会很有帮助，因为他们会慢慢去除贴片。手铐2被移除后，参与者的皮肤上可能有残留的粘合剂，也可以用橄榄油或医用粘合剂溶剂去除。
3. 在离开曝光环节之前，提醒与会者不要清洗地标，不要对曝光部位施以任何乳液。

10. 后续预约:袖口3申请

1. 在学员到达之前，根据制造商规格校准分光光度计。
2. 通过去除所有孔径覆盖物（将白蜡纸背在贴片的中心部分）来准备袖口 3。将袖口 3 放在学员的手臂上时，从贴片的两侧活门上取下白蜡纸背衬。使用参与者前臂上的地标，将 Cuff 3 放在与前两个修补程序相同的位置。
3. 按顺序在六个打开的孔径中每一个进行读取。此外，目视检查每个光圈，并记录在六个光圈（红色或粉红色皮肤表示红斑）中是否有红斑反应的视觉证据。永久记录分光光度计读数后，在必要时使用溶剂取下袖口 3。
4. 为了进一步提高参与者的舒适度和安全性，提供 4-6 种一次性烧伤凝胶或芦荟，并指示参与者，如果暴露部位变得发痒或不舒服，可能会在柜台产品上与这些或类似产品一样被视为晒伤。

结果

表 1中介绍的定时时间表是一个新的剂量计划，计算在暴露事件的中点（即光圈 3 或 4）上，平均捕获每个 FST 的 MED。计算时间表的基础如下。

先前的工作已经确定，对于FST 2的个体，UVB范围内辐射的中位MED为每厘米266.9毫瓦（mW），FST3为77.429 mW/cm^2，FST 4¹⁶为85.0。在 270 μW/cm²的恒定 UVB 能量假设下，我们推断到时态域中，?...

讨论

与已经实现流行用途的其他基于实验室的炎症挑战，此处描述的 MED 测试的精确实现可以提供若干优势。例如，吸水泡协议17，18，19在皮肤上引发一个充满液体的吸水泡，随后用注射器吸气，直接进入细胞因子微环境。虽然皮肤起泡是研究皮肤免疫学^和炎症的众所周知的工具，并且对于获得稀有的细胞和

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aperture dose testing patch (“Cuff”)	Daavlin
Medical grade adhesive solvent
Non-reflective UV proof cloth
Radiometer	SolarLight	Model 6.2 UVB Meter
Single use aloe or burn gel
Spectrophotometer	Konika-Minolta	CM-2600D
Stopwatch
UV lamp – Fiji Sun	Sperti		Emission spectrum 280 nm-400 nm, approximately 25% UVB
UV-proof safety glasses (2 pair)
UV-proof sleeve
White cotton gloves (2 pair)