从小鼠横纹肌瘤分离的原发性肿瘤细胞的肿瘤球衍生和治疗

摘要

该协议描述了一种从肿瘤层培养开始分离小鼠横纹肌瘤原发细胞、肿瘤球的形成和治疗以及异体移植的可重复方法。

摘要

横纹肌瘤（RMS）是儿童最常见的软组织肉瘤。尽管已作出重大努力，能够识别与 RMS 相关的常见突变，并允许对不同 RMS 亚型进行区分，但开发新疗法以进一步改善预后仍面临重大挑战。虽然通过表达的致词标记，RMS是有致血的还是非造血的，由于对起源细胞的了解仍然不足，因此仍然存在重大争议。本研究为小鼠RMS的肿瘤球测定提供了可靠的方法。该测定基于肿瘤细胞的功能特性，允许识别肿瘤中具有肿瘤生成功能的稀有种群。还介绍了测试重组蛋白、将转染方案与肿瘤球测定相结合以及评估参与肿瘤发育和生长的候选基因的程序。进一步描述是一种将肿瘤球移植到受体小鼠中以验证体内肿瘤生成功能的程序。总体而言，所述方法允许可靠地识别和测试可在不同环境中产生的稀有 RMS 肿瘤群。最后，该协议可作为药物筛选和治疗学未来发展的平台。

引言

癌症是一种异质疾病;此外，同一类型的肿瘤可以在不同的患者中呈现不同的基因突变，在患者体内，肿瘤由多个细胞群^组成。异质性在识别负责引发和传播癌症的细胞方面提出了挑战，但其特性对于开发有效治疗至关重要。肿瘤传播细胞（TPC）的概念，一种罕见的细胞群，有助于肿瘤的发展，已经^{广泛审查2。}尽管TPC在多种癌症中具有特征，但识别其可靠分离的标记物仍然是几种肿瘤类型3、4、5、6的挑战。^,7,8,9.因此，一种不依赖于分子标记，而是依赖于TPC功能特性（高自我更新和低附着条件下生长能力）的方法，称为肿瘤层形成测定，可以广泛应用于从大多数肿瘤的TPC的识别。重要的是，这种测定也可用于扩大三氯图C，从而直接应用于抗癌药物筛选和研究^{抗癌1，10。}

横纹肌瘤（RMS）是一种罕见的软组织肉瘤，在^幼儿11中最为常见。Althoug RMS可以通过对造血标记物表达的评估进行组织学鉴定，由于肿瘤发育刺激的多种肿瘤亚型和高异质性，原源RMS细胞尚未被单体特征化。事实上，最近的研究已经产生了关于RMS是致幻或非造血源的重要科学讨论，这表明RMS可能来自不同的细胞类型，这取决于^{上下文12，13。14,15,16,17.}对RMS细胞系进行了大量研究，利用肿瘤层形成测定来鉴定肿瘤发育的通路，并鉴定与高度自我更新人群相关的标记物的表征^18,19,20,21.

然而，尽管肿瘤圈形成测定具有识别原源RMS细胞的潜力，但一种可用于原发RMS细胞的可靠方法尚未得到描述。在此背景下，我们小组最近的一项研究采用了优化的肿瘤球形成测定，用于鉴定Duchenne肌肉萎缩症（DMD）小鼠^模型22中的原源RMS细胞。从肌肉组织分离出的多种肿瘤前细胞类型，测试其在低附着条件下生长的能力，从而能够将肌肉干细胞识别为营养不良环境中RMS的原源细胞。这里描述的是肿瘤层形成测定的可重复和可靠的协议（图1），它已被成功地用于识别负责小鼠RMS发育的极其罕见的细胞群。

研究方案

小鼠的住宿、治疗和牺牲均按照桑福德·伯纳姆·普雷比斯医学发现研究所批准的IACUC协议进行。

1. 试剂制备

1. 制备100 mL的细胞分离培养基:F10培养基辅以10%马血清（HS）。
2. 制备50 mL的胶原酶 II 型溶液:在 50 mL 的细胞分离介质中溶解 1 g 胶原酶 II 型粉末（注意酶的单位，每 1 mL 培养基，因为单位数量会根据批次而变化）。将溶液与溶液加数，并储存在-20°C冷冻箱中，直到随时使用。
   注意:每一批胶原酶在使用前都应进行测试，因为酶活性可能会在不同的批次中变化。
3. 制备第二消化溶液每个样本10 mL:细胞分离介质，具有100单位/mL的胶原酶II型溶液和2个单位/mL的消血II新鲜加权。使用前立即做好准备。
4. 制备500 mL的肿瘤细胞培养剂:DMEM 高葡萄糖辅以20%FBS和1%笔/链球菌。
5. 准备500 mL的FACS缓冲液:1xPBS补充2.5%v/v正常山羊血清和1 mM EDTA。
6. 准备500 mL的肿瘤球培养体:DMEM/F12 辅以1%笔/链球菌。在使用前，添加以下生长因子:1%N2补充剂、10纳克/mL EGF和10纳克/mL β-FGF。

2. 细胞隔离和培养

1. 准备一个含有5 mL细胞分离介质的10厘米板（每个肿瘤样本一个板），并将其置于37°C的培养箱中，直到准备好收获肿瘤组织。
2. 据报道，RMS在雄性小鼠和雌性小鼠模型中都自发地发育，用于杜琴肌肉营养不良症，如18个月左右的B10 mdx小鼠和B6 mdx/mTR小鼠在9^{个月22、23}日。使用异胶对产生 RMS 肿瘤的小鼠进行麻醉，并通过宫颈脱位或根据机构 IACUC 指南牺牲动物。用剪刀，在肿瘤局部区域对皮肤进行切口，（使用钳子）将皮肤从感兴趣的区域拉开。使用剃刀刀，从动物中切除肿瘤。
3. 称量500~1，000mg的肿瘤组织，并将其放入步骤2.1中准备的板中（图1A）。
   注:大量的组织对消化步骤产生负面影响，降低总产量。如果收获的肿瘤大于1000毫克，将其分成多个部分并随机取样，直到达到所需的重量。随机抽样是评估组织异质性所必需的。
4. 将含有肿瘤组织的板放入无菌细胞培养罩中，用剃刀将其切碎。来自RMS的肿瘤组织是异构的;因此，不同的区域可能会对削减产生不同的阻力。确保所得碎块的大小均匀，以确保最佳消化。
   注:RMS作为不同组织类型（主要是纤维化、血管化和脂肪组织）的混合物存在，可以在每个肿瘤中识别。以1）分离异质细胞群准确重述原肿瘤的组成，2）不偏置分离程序，对收获的组织进行随机采样。肿瘤不同区域的细胞应在第3节所述的测定中，在体外平行消化和测试。
5. 将切碎的组织和细胞隔离介质移入 15 mL 离心管中，用 4 mL 的细胞隔离介质清洗板并将其放入管中。
6. 加入700单位/mL的胶原酶溶液，以消化组织，并在37°C的摇水浴中孵育1.5小时。
7. 孵育后，在RT下以300 x g旋转组织5分钟，在不干扰颗粒的情况下吸收上清液，将颗粒重新悬浮在10 mL的第二消化溶液（消血液中），并在37°C的摇摇水浴中孵育30分钟。
8. 第二次消化完成后，上下移液，并通过50 mL离心管上的70μm尼龙过滤器将细胞悬浮液通过。然后加入10 mL的细胞分离介质，清洗过滤器并稀释消化溶液，并在300 x g和RT下旋转组织5分钟。
9. 吸出上清液，在20 mL的肿瘤细胞培养物中重新悬浮颗粒。然后在15厘米细胞培养板中转移细胞悬浮液。将细胞置于37°C的培养箱中过夜。此板将标识为 P0。
10. 隔离后的第二天，更改介质。此步骤对于确保清除可能对细胞生存产生负面影响的碎片和死细胞是必要的。
11. 根据起始材料和细胞大小，评估介质更换后的细胞汇合度，范围从 30%到 60%。让细胞在孵化器中生长，直到它们达到90%的汇合。每天监控细胞，每 2 天更换一次介质。肿瘤细胞成汇所需的时间取决于多个参数:肿瘤攻击性、肿瘤基因型、小鼠年龄、组织异质性。
12. 对于细胞传递，执行以下操作:
    1. 在37°C的水浴中预加热细胞分离溶液和肿瘤细胞培养基。
    2. 用1x无菌PBS清洗细胞，在37°C温细胞分离溶液中孵育5~10分钟。
    3. 当所有细胞从板中分离时，加入10 mL的温暖肿瘤细胞介质，将溶液移入50 mL离心管中，并在RT处以300 x g将细胞旋转5分钟。
    4. 根据颗粒大小，在肿瘤细胞培养的5~10 mL中重新悬浮细胞，并使用Trypan蓝色（1:5稀释）计数活细胞以排除死细胞。
    5. 板 10⁵细胞在 10 厘米板或 3 x 10⁵细胞在 15 厘米板。细胞翻倍时间因步骤 2.10 中详述的因素而异。

3. 肿瘤球推导

1. 在通过P1或P2时使用肿瘤细胞，以避免通过多个通道选择细胞（图1B）。要从盘子中分离细胞，首先用1x PBS清洗盘子，不要干扰细胞，然后用细胞分离溶液（10厘米板5 mL，15厘米板10 mL）覆盖，并将其放入培养箱5-10分钟。
2. 通过在明亮的显微镜下观察板，确认细胞分离，加入1:1体积的肿瘤细胞培养基（细胞分离溶液:肿瘤细胞培养基），将细胞悬浮液置于离心管中，将细胞旋转至300 x g，为5最小在RT。
3. 根据用于电镀的方法，在FACS缓冲液（第3.4节）或肿瘤球介质（第3.5节）中重新悬浮细胞。
4. 通过流式细胞仪电镀细胞
   1. 在 FACS 缓冲区中重新悬浮细胞（数量取决于颗粒大小），并使用 Trypan 蓝色排除手动计数活细胞。确保最终细胞浓度为10⁷细胞/mL（每10⁶个细胞100μL的FACS缓冲液）。每10⁶个细胞添加1μL的Fx循环紫罗兰染色，在细胞分类期间区分死细胞。准备一个未染色的控件，其中 Fx 循环紫罗兰染色不添加到细胞中。
      注:浓度经过优化，可有效染色和分拣过程中的速度。较低的细胞浓度将导致更长的分拣时间，而较高的浓度将影响染色。
   2. 使用未染色的控制，设置一个FACS门分离活着（Fx循环紫^罗兰-）从死（Fx循环紫^罗兰+）细胞。然后，采用荧光激活细胞分拣（带450/50滤带通），分离和计数活细胞/死细胞，并在96孔低附着板的每个孔中电镀所需数量的活细胞。在开始分拣之前，板中的每口孔都需要填充200μL的肿瘤球介质。
      注:鉴于TPC是整个肿瘤中罕见的亚群，通过从小鼠RMS电镀100个细胞/井来优化协议，以观察悬浮培养中肿瘤球的形成。每孔的细胞数应根据测试的特定肿瘤进行调整。
   3. 将细胞放在培养箱中，直到实验结束。除非必要，否则尽量不要干扰盘子。对于30天的实验，每个井应该补充媒体和适当比例的生长因子每周（媒体往往蒸发和生长因素无效后1周）。
   4. 实验完成后，在明亮的视场显微镜下手动筛选板以识别肿瘤球（参见步骤3.6）。
      注:经过优化，30天的时点经过优化，可轻松检测直径为50~300微米的小鼠RMS肿瘤球。时间点应根据被测肿瘤的侵略性及其增殖率进行调整。
5. 手动电镀电池
   1. 在肿瘤圈培养层中重新悬浮细胞（数量取决于颗粒），并使用锥形蓝色（1:10稀释）手动计数活细胞。计算管中的细胞浓度，并在96孔低附着板中盘取适当数量的细胞。将细胞放在培养箱中，直到实验结束。尽量不要干扰板材，除非需要补充介质和生长因子，如步骤 3.4.3 所述。
   2. 实验完成后，屏幕板在明亮的场显微镜下手动识别肿瘤球或使用Celigo软件，如Kessel^等人24中所述，见下面的步骤3.6。
6. 请注意，两个独立的读出可以评估作为这个测定的结果:形成肿瘤球的数量和大小。
   注:当一个多细胞在孔中镀层时，肿瘤球或细胞簇可以形成（图1C，第三和第四面板）。细胞簇是小细胞聚集体，在悬浮培养中形成，可提高细胞存活率，其特征是形状不规则。肿瘤球体很大，结构更紧凑，呈球形。它们来自单个细胞，它有能力以独立于锚固的方式生存，并在高^速率25中增殖。根据实验室提供的功能，通过流式细胞计或手动电镀电池可以互换使用。此外，使用大小与 96 孔板不同的低附着板是可能的，并且取决于所需的结果。事实上，肿瘤圈频率的评估应采用96孔低附着板，而对细胞肿瘤发生电位的评估进行初步筛选，将在6个孔低附着板上产生更快、更可靠的结果。

4. 肿瘤球与重组蛋白的治疗

1. 重复步骤 3.1 和 3.2。
2. 如果设置重组蛋白的治疗，首先确定第4.3节后使用的最佳浓度，或者如果先前已经确定最佳浓度，请跳到第4.4节。
3. 确定重组蛋白处理浓度。
   1. 在肿瘤圈介质中重新悬浮细胞（体积取决于颗粒大小），并使用Trypan蓝色排除手动计数活细胞。在6孔低附着板中计算管和板中的细胞浓度100，000个。每个浓度测试两个孔和两口未处理对照井（图2）。要测试的蛋白质浓度基于文献搜索。
   2. 用不同的蛋白质浓度处理每个悬浮细胞，并将细胞置于培养箱48小时（需要时间来评估治疗对细胞活力和下游目标基因表达的影响）。然后，评估以下参数:
      1. 细胞存活:使用明场显微镜，并与未经治疗的对照进行比较，检查细胞形态。健康的细胞在显微镜下显得明亮和反光，而过多的细胞死亡会导致介质中碎片的积累。为了对细胞死亡的可量化测定，可以使用Trypan蓝色排除、水晶紫罗兰染色、MTT或TUNEL测定（在这种情况下，在原电镀中添加一口孔）。
      2. 重组蛋白对下游通路的影响:使用 PubMed 进行文献搜索，以识别已知受测试蛋白影响的下游基因。为目标基因设计qRT-PCR引源，并对从处理细胞中分离的RNA进行qRT-PCR分析（图2）。
4. 用重组蛋白治疗。
   1. 在肿瘤圈介质中重新悬浮细胞（体积取决于颗粒大小），并使用Trypan蓝色排除手动计数活细胞。确定所需实验所需的细胞总数（96孔低附着板每口井100个细胞），并在适当的肿瘤球介质体积中稀释。如果进行多项治疗，则准备单独的细胞管。
   2. 用适当浓度的重组蛋白处理每根管，并将细胞盘在96孔低附着板的单独孔中。根据重组蛋白的半寿命，治疗将在每口井上重复，直到实验的30天结束。
   3. 在实验结束时，按照步骤 3.4.4 和 3.6 分析数据。

5. 过度表情质粒的肿瘤球处理

1. 重复步骤 3.1 和 3.2。
2. 如果设置一个新的肿瘤类型的治疗，首先确定质粒的最佳浓度使用后第5.3节，或者如果是否已经确定最佳DNA浓度之前已经确定，跳到第5.4节。
3. 确定最佳质粒浓度。
   1. 在肿瘤细胞介质中重新悬浮细胞（体积取决于颗粒大小），并使用Trypan蓝色排除手动计数活细胞。盘计数的细胞实现70%-90%的汇合（细胞数在细胞大小和形态上高度依赖）。GFP-质粒将用于根据粘附细胞转染试剂的制造商协议测试转染效率。同时，还要测试未经处理的控件 （图 3A）。在 24 孔板中执行效率测试。
      注:粘附细胞用于提高转染效率，因为对悬浮细胞进行的转染效率不高，对细胞活力有负面影响。
   2. 转染后48小时评估细胞的以下参数:
      1. 细胞存活:使用明场显微镜，比较每个孔中的细胞数量，并将其与未经处理的细胞很好地进行比较。
      2. GFP表达式:计算GFP阳性细胞占每个井中细胞总数的百分比（图3B）。
4. 过度表情质粒治疗
   1. 在肿瘤细胞培养基中重新悬浮细胞（体积取决于颗粒大小），并使用Trypan蓝色排除手动计数活细胞。板 200，000 细胞每孔 6 孔板。每口井将用于独立的转染事件。每口井都将使用为特定肿瘤类型开发的设置进行转染（图3A）。
   2. 转染后24小时，用1x PBS清洗每口孔，并在温细胞分离溶液中孵育细胞（足以覆盖油井）。根据第 2.15 节中详述的因素，将板置于 37°C 的培养箱中 5-10 分钟。
   3. 分离单元格时，使用 Trypan 蓝色排除单独计算从每个井派生的单元格。将6孔低附着板每孔放置100，000个细胞，确保不要混合从不同孔中提取的细胞。将盘子置于37°C的培养箱中，保持一周不受干扰。
      注:此测定的持续时间为7天，有足够的时间允许肿瘤球形成，同时防止肿瘤球融合。当10万或更多细胞被悬浮在一起超过1周时，肿瘤球融合是一种明显现象，这可能对肿瘤圈形成能力的评估产生偏差。如果实验需要较长的孵育时间，应调整细胞密度或聚合物支架，以避免肿瘤球^融合26。
   4. 在实验结束时，按照步骤 3.5.2 和 3.6 分析数据。

6. 异体移植的肿瘤球制备

1. 将细胞外基质 （ECM） 溶液（每个异体移植物 50 μL）和肿瘤细胞培养基（每个异体移植物 50 μL）放在冰上。
2. 肿瘤球可用于异体移植。将所有从特定细胞类型或治疗中获得的肿瘤球聚集到15 mL或50 mL管中（根据介质总量）（图1D）。在RT处以300 x g旋转肿瘤球5分钟，去除肿瘤球上的上清液，用10 mL的无菌1x PBS清洗。
3. 在RT处以300 x g再次旋转肿瘤球，5分钟，吸出1x PBS，并在细胞颗粒顶部向1mL的细胞分离溶液中加入500μL，从而启动分离过程。在37°C下将消化溶液中的肿瘤球孵育到摇动的水浴中，每10分钟检查一次消化进展。为了帮助肿瘤球分离成单个细胞溶液，移液细胞上下机械中断。消化过程可能需要长达 30 分钟。
   注:尽管当肿瘤球从不同的原发性RMS细胞衍生时，孵育时间差异很大，但从未观察到细胞活力与消化时间的关系显著下降。
4. 当获得单个细胞溶液时，加入一卷肿瘤细胞培养基（1:1，细胞分离溶液:肿瘤细胞培养基），并在4°C下以300 x g旋转5分钟。
   注:从此时起，所有步骤都需要在冰上执行。旋转后，肿瘤球不会像单细胞溶液那样形成稳定的颗粒。为了确保不去除或吸出肿瘤球，使用1mL移液器，轻轻吸气。当仅保留 1 mL 时，移动到 200 μL 移液器。
5. 在冷肿瘤细胞培养中重新悬浮细胞（体积取决于颗粒大小），将细胞放在冰上，并使用Trypan蓝色排除对活细胞进行计数。确定用于异体移植的适量细胞后，将其重新悬浮在总体积为50μL的冷肿瘤细胞培养物中。在冷肿瘤细胞介质中冷却移液器尖端。当尖端是冷的，使用它采取50μL的ECM溶液，并将其添加到含有细胞的管。在此过程中，请勿从冰上取出管子。
   注:用于移植的细胞数量应根据肿瘤测试和实验目标确定:大量移植细胞将减少肿瘤发育时间（小鼠RMS肿瘤球中的20，000个细胞已被显示为注射后6周发展成肿瘤）。为了能够比较不同的细胞系或不同的治疗，重要的是从相同数量的细胞开始。
6. 由于细胞现在已做好移植的准备，在冰上保持，直到注射。将带29G针头的带29G针头的带盖0.5 mL胰岛素注射器放在冰上，以防止细胞溶液在吸入时变硬。
7. 将流量计打开至 200 mL/min 氧气，将子氧蒸发器打开至 2.5%。将一只2个月大的雄性NOD/SCID小鼠放入感应室，麻醉该小鼠。等待 2-3 分钟，直到鼠标出现睡眠，繁殖速度减慢。在开始手术之前，首先通过脚捏确认鼠标正在睡觉，然后在眼睛上涂上兽医膏。切掉动物的右侧，在预冷却注射器中吸出细胞溶液，然后分皮注射到被切割的区域。如果注射执行正确，皮肤下会形成可见的凸起。
   注:细胞异体移植可以在与移植细胞相同的小鼠菌株中进行。例如，如果 RMS 细胞最初从 C57BL/6 鼠标中分离出来，则可以在 C57BL/6 小鼠中执行异体移植。如果菌株不同，则应利用免疫缺陷受体小鼠避免排斥。接受者小鼠的年龄也可以根据实验目标进行调整。
8. 每周监测小鼠肿瘤形成一次。
   注:为了验证异体移植产生的肿瘤的特性，应将其与分离细胞的原始肿瘤进行比较。为此，可以对形态特征和造血标记表达进行组织学分析，并可以进行更全面的RNAseq分析。

结果

肿瘤球检测
细胞分离得到优化，以获得肿瘤组织中细胞群的最大异质性。首先，由于分离组织呈现形态上不同的区域，为了增加分离均匀稀有细胞群的机会，从肿瘤的多个区域进行了取样（图1A，左侧第一面板）。第二，对采集的样品进行机械解离，同时保持切碎组织大小的均质性，尽管样品中可能存在不同的电阻（?...

讨论

已采用多种方法从肿瘤异质细胞群中分离和表征TPC:肿瘤克隆测定、FACS分离和肿瘤球层形成测定。肿瘤克隆测定在1971年首次被描述，用于干细胞研究，后来才应用于癌症^{生物学29，30。}该方法是以癌症干细胞的内在特性为基础，在软胶囊培养中不受约束地^扩展31。该方法自开发以来，已广泛应用于癌症研究，包括肿瘤细胞异质性研究、?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase cell dissociation reagent	Gibco	A1110501	Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
Celigo	Nexcelom	Celigo	Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type II	Life Technologies	17101015	Tissue digestion enzyme
Dispase II, protease	Life Technologies	17105041	Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose media	Gibco	11965092	Component of tumor cells media
DMEM/F12 Media	Gibco	11320033	Component of tumosphere media
EDTA	ThermoFisher	S312500	Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse protein	Gibco	PMG8041	Component of tumosphere media
FACSAria II Flow Cytometry	BD Biosciences	650033	Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent	MWI Vet Supply	502017	Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet Stain	Life Technologies	F10347	Discriminate live and dead cells
Goat Serum	Life Technologies	16210072	Component of FACS buffer
Ham's F10 Media	Life Technologies	11550043	Component of FACS buffer
Horse Serum	Life Technologies	16050114	Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagent	ThermoFisher	L3000015	Transfection Reagent
Matrigel membrane matrix	Corning	CB40234	Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X)	Gibco	17502048	Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	MWI Vet Supply	701008	Eyes ointment
PBS	Gibco	10010023	Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1	Addgene	6084-1	GFP plasmid
Penicillin - Streptomyocin	Life Technologies	15140163	Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basic	Peprotech	10018B	Component of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein	R&D Systems	427-FL-005	Recombinant protein
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	Discriminate live and dead cells