用于隔离和测序微RNA并使用开源工具分析微RNA的完整管道

摘要

在这里，我们描述了一个分步策略，用于隔离小型RNA、丰富微RNA和为高通量测序准备样本。然后，我们介绍如何使用开源工具处理序列读取并将其与微RNA对齐。

摘要

一半的人类记录被认为是由微RNA调节的。因此，量化微RNA表达可以揭示疾病状态的基本机制，并提供治疗靶点和生物标志物。在这里，我们将详细介绍如何准确量化微RNA。简而言之，该方法描述了分离微RNA、将它们与适合高通量测序的适配器、放大最终产品以及准备样本库。然后，我们解释如何将获取的测序读数与微RNA发夹对齐，并量化、规范化和计算其差分表达。多功能且坚固，这种结合的实验工作流程和生物信息分析使用户能够从组织提取开始，完成微RNA定量。

引言

人类基因组2中首次发现于1993年1，现在估计有近2000个微RNA。微RNA是小型非编码RNA，通常为21-24个核苷酸长。它们是基因表达的转录后调节器，通常结合目标基因的3个未翻译区域（3-UTR）的互补位点，以抑制蛋白质表达和降解mRNA。量化微RNA可以给基因表达提供有价值的见解，并为此开发了几种协议3。

我们开发了一种定义、可重复和长期的协议，用于小型RNA测序，以及使用开源生物信息学工具分析规范化读取。重要的是，我们的协议能够同时识别内源性微RNA和外源交付的构造，从而产生类似微RNA的物种，同时最大限度地减少到其他小RNA物种（包括核糖体RNA）的读数。rRNA），转移RNA衍生的小RNA（tsRNA），重复衍生的小RNA和mRNA降解产物。幸运的是，微RNA是5-磷酸化和2-3羟基化4，一个功能，可以利用它们从这些其他小RNA和mRNA降解产物分离。对于微RNA克隆和测序，存在若干商业选择，这些选择往往更快、更容易进行多路复用;然而，试剂盒的专有特性及其频繁的修改使得比较样品运行具有挑战性。我们的策略通过丙烯酰胺和阿甘蔗凝胶纯化步骤，仅优化收集正确大小的微RNA。在此协议中，我们还描述了使用开源工具将序列读取与微RNA对齐的过程。这套说明对于信息学新手用户特别有用，无论我们使用的是库准备方法还是商业方法。

该协议已用于几个已发表的研究。例如，它被用来识别Dicer酶在距离茎环结构内部回路两个核苷酸的距离上切割小发夹RNA的机制，即所谓的"循环计数规则"5。我们还遵循这些方法，以识别从重组的阿德诺相关病毒载体 （rAAV） 表达的小发夹 RNA （shRNA） 的相对丰度，以识别在肝脏之前可以耐受的 shRNA 表达阈值毒性与过量shRNA表达6相关。利用这个协议，我们还确定了肝脏中的微RNA，这些微RNA对缺乏微RNA-122（一种高度表达的肝微RNA）作出反应，同时也确定了这种微RNA7的降解模式。由于我们在众多实验中一致地使用了我们的协议，因此我们能够纵向观察样品制剂，并且发现没有明显的批次效应。

在共享该协议时，我们的目标是使用户能够使用负担得起的设备和试剂以及免费的生物信息学工具，在几乎任何组织或细胞系中生成高质量、可重复的微RNA定量。

研究方案

动物实验得到了华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的授权。

小型RNA库制备

1. RNA分离

1. 使用标准RNA分离试剂或用于微RNA的试剂盒从生物源分离RNA。对于组织，最好从样品开始，用液氮冷冻样品，然后用预冷冻砂浆和虫子将样品冷冻到粉末中。
2. 在可量化RNA并提供RNA完整性数（RIN）的仪器上测量每个样品的RNA完整性。RiN 应为 >7。

2. 3' 适配器结扎

1. 在PCR带管中制备结扎反应，通过组合:11 μL RNA（1-3 μg，每个样品使用相同量），1.5 μL 10x T4 RNA结合酶反应缓冲液，无ATP，1μL聚乙烯乙二醇（PEG），0.5μL的3'-链接剂（100μM通用mi克隆RNA lin克）。
   注:ATP的缺失有助于丰富miRNA，并最大限度地减少mRNA降解产物的克隆。PEG作为分子挤出剂，增强成功的结扎。通用 miRNA 克隆链接器具有 3' 阻断组（胺），以防止在 5' 端的RNA自结、循环和结扎。
2. 在热循环器上加热95°C加热样品30-40秒，在冰上冷却1分钟。加入1μL的T4RNA连带酶2，在室温下孵育2小时。在样品孵育时制备凝胶（步骤2.3）。
   注:在室温下孵育有助于防止链接器结扎。我们还成功地使用了T4RNA利加酶1。
3. 用8M尿素制备30m%聚丙烯酰胺凝胶（用于20x20厘米凝胶）:14.4克尿素，3 mL 10x三层缓冲乙烯四乙酸（TBE），11.2 mL，40% 19:1丙烯酰胺，H₂O至30 mL。溶液最好在42°C溶解。在铸造前，加入150μL的10%过硫酸铵（APS）和30μL的四甲基二胺（TEMED）进行聚合。
4. 在塑料浇铸和插入梳中浇注 0.8 mm 分离的玻璃板。一旦凝胶凝固（约20分钟），加入0.5x TBE到水箱中，并通过大力移液清洗残留尿素。
5. 在恒定的375 V下预运行凝胶25分钟，无需样品，以便尿素可以进入凝胶，然后再次清洗水井。
   注:根据所使用的电源和电泳系统的类型，可能需要降低电压量。
6. 样品完成压接后，向样品中加入15μL丙烯酰胺加载染料（比例为1:1），然后在95°C下在热循环器上变性5分钟。
7. 准备 25 纳克/μL 的 37 和 44 bp 大小标记，用一部分丙烯酰胺加载染料稀释。序列列在表1中。
8. 将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，在每个样品之间至少留下一条通道。以不对称模式加载至少两组标记的 20 μL，以跟踪凝胶方向。
9. 在前 15 分钟内以恒定的 375 V 运行凝胶，然后增加到常量 425 V。运行，直到溴酚蓝色是约1-4厘米从底部，这需要大约2小时。
   注:如有必要，凝胶可以在较低的恒定电压下运行更长时间，直到溴酚蓝色从底部约1-4厘米。
10. 使用板分离器从玻璃板上取出凝胶，并将凝胶放在塑料页保护器上。在500 μL的蒸馏水中稀释5μL的溴化钠，将移液器移至顶部浅蓝色标记上方的标记通道上（见图1A）。
    注意:使用溴化苯的手套，并按照当地法规处理废物。坐5分钟。
11. 在紫外线 （UV） 光下，使用干净的剃须刀切割每个车道的凝胶从上部到下标记物（参见图 1A）。转移到4 x 4厘米的实验室密封膜的正方形，然后切割凝胶与约4个削减水平和3垂直产生12个小正方形（见图1B）。
12. 移液器 400 μL 的 0.3 M NaCl 上密封膜方形，并将凝胶片块输送到 1.5 mL 硅化管中（参见图 1C）。在4°C下搅拌了4°C上的样品。
    注:其他低保留率的1.5 mL管可以替代硅化管。
13. 在4°C下搅拌至少12小时后，取回样品，并把它们放在冰上，以及100%乙醇的锥形管。
14. 将400μL的上清液转移到新管中，然后加入1mL的100%乙醇和1μL的15mg/mL糖原联合沉淀剂。确保收集尽可能多的上清液，在4°C下旋转，并在必要时移液更多。在-80°C下放置1小时，或-20°C放置2小时或更长时间。糖原辅料可提高颗粒的可见性和恢复性。
15. 在4°C下以17，000 x g旋转20-30分钟。去除所有乙醇痕迹，让颗粒空气干燥5分钟。

3. 5' 链接器连接

1. 通过在6.5 μL无核酸酶水中移液，重新悬浮颗粒。让颗粒在水中坐几分钟，首先将有助于重新悬浮。
2. 向下旋转颗粒并在水中重新悬浮后，加入 0.5 μL 的 100 μM 5' 链接器（带条形码;参见表1），1 μL T4 RNA 结合酶缓冲液，1 μL 10 mM ATP，1 μL PEG。在90°C加热30s，然后放在冰上。加入1μL的T4RNA连带酶1，让在室温下孵育2小时。
3. 加入400μL的0.3M NaCl，然后加入400μL的酸酚/氯仿。涡旋 30 s - 1 分钟（溶液看起来多云），然后在 4°C 下以 10-15 分钟的速度在微离心机（±17，000 x g） 中以最高速度旋转 10-15 分钟。抽出顶层并放入新的 1.5 mL 管中。
   注:避免移液任何底层。
4. 加入350 μL的氯仿，短暂地涡旋，然后在4°C下以最大速度旋转10分钟（±17，000 x g）。稍后从顶部取下，放入新的 1.5 mL 管中。加入1.5μL的糖原辅剂和1mL的100%乙醇。
   注:同样，避免移液任何底层。
5. 短暂涡旋，然后在-80°C处放置至少1小时，或-20°C过夜。

4. 逆转录 （RT）

1. 打开 42 °C 热块。在 4 °C 和 ±17，000 x g下旋转样品 20-30 分钟。清除所有上清液，让颗粒空气干燥 5 分钟。
2. 在8.25 μL无核酸酶水中重新悬浮颗粒样品，然后加入:100 μM RT底漆（表1）的0.5 μL和cDNA合成试剂盒的5μL2xRT反应混合物。在42°C孵育3分钟。
3. 在每个样品中加入1.5μL的10倍RT酶，并在42°C下在热循环器中孵育30分钟。置于-20°C或继续水解和中和。
   注: 步骤 4.2 和 4.3 可用于多个 RT 套件。
4. 执行碱性水解和中和:制作 1mL 的 150 mM 氢氧化钾 （KOH） 溶液（150 μL 的 1 M KOH，20 μL 的 1 M Tris 基 pH 7.5，以及 830 μL 的 H₂O）和 1 mL 的 150 mM 盐酸 （HCl） （150 μL 1 M HCl 和 850 μL）H₂O）。
5. 在添加到样本之前，请确定中和 KOH 溶液所需的 HCl 量。一般来说，大约20-24 μL的HCl将中和KOH的25μL。检查 pH 条上的组合，以确保其处于正确的范围（pH 7.0 到 9.5）。
6. 加入25μL的150 mM KOH溶液，在95°C下孵育10分钟，对样品进行水解。
7. 通过加入步骤 4.4 中确定的 150 mM HCl 量来中和样品，以获得 7.0 和 9.5 之间的最终样本 pHH 值。

5. PCR扩增

1. 中和后，用:29.5 μL 的水、5 μL 的 10x Taq 缓冲液、1 μL 的 dNTP、2 μL 的 25 μM 正向底漆 （表1）、2 μL 的 25 μM 反向底漆 （表1）、0.5 μL 的 Taq 和 10 μL 的反向转录 cDNA 从步骤 4.6.
2. 运行以下 PCR 反应:94 °C 2 分钟，然后 20 个 94°C 循环，45 秒，50°C 75 秒，72°C 60 秒。
3. 使用步骤 5.2 的 5 μL 产品，运行大约 2-4 个周期的第二次 PCR 反应。混合: 34.8 μL 水， 5 μL 10x Taq 缓冲液， 1 μL dNTP， 1 μL 25 μM 正向底漆 （表1）， 1 μL 25 μM 反向底漆 （表 1） 和 0.2 μL 的塔克聚合酶.遵循步骤 5.2 中概述的相同热循环器参数。
   注:执行两次PCR反应——第一次为20次循环，第二次为2-4次以上——目的是确保cDNA扩增量处于动态范围内（即，非饱和量）。

6. 阿加玫瑰凝胶纯化

1. 用低熔胶制备4%的甘蔗凝胶。在凝胶上装载 40 μL 或更多 PCR 产品，以及加载染料。负载 100 bp 和 25 bp 大小标记。
   注:25 bp 梯子有助于区分放大产品与链接器连接产品。低熔性甘蔗凝胶必须比传统的甘蔗凝胶更小心铸造，因此请严格按照制造商的说明进行铸造。
2. 对于凝胶提取，选择凝胶上可见但未饱和的循环号（通常为 22-24 个周期）。运行多个样本时，请选择类似的强度带。
3. 切割高于 125 bp 波段的波段（25 bp 阶梯上较暗的波段;参见图 1D）。使用凝胶萃取试剂盒，按照制造商的说明添加基于4%凝胶的缓冲液，然后在室温下摇动以溶解缓冲液中的甘露。
   注: 在 55°C 下溶解会增加链接器连接的可能性。
4. 按照制造商的凝胶提取说明，在 30 μL 的洗脱缓冲液或水中脱脂。如果产品在凝胶上看起来较弱，则将洗脱量降低至20μL。
5. 使用敏感技术测量cDNA浓度，并准备样本库进行测序。准备将取决于所使用的排序类型。
   注: 测序库的最低要求通常是 10 μL 的 10 μM 产品。如果浓度过低，池和乙醇会沉淀样品，使库达到所需的浓度。
6. 使用可用设备对样品进行排序。一个常见示例是使用套件运行样本，用于 50 bp 单次读取，以 FASTQ 输出格式获取大约 1500-2500 万次读取。

小RNA序列对齐和生物信息学

7. 数据上传

1. 下载从每次排序运行生成的 FASTQ 文件。下载miRbase.org8、9、10的微RNA发夹序列列表。
2. 在www.usegalaxy.org生成 Galaxy 帐户，并将序列读取的 FASTQ 文件上载到此帐户。
3. 将条形码序列的文本文件上载到 Galaxy 帐户，例如条形码.txt，该文件可作为文本文件提供（补充表 1）。
4. 从miRBase.org等数据库将微RNA发夹的FASTA文件上传到Galaxy账户。补充表2和补充表3提供了小鼠（小鼠毛针.fa）或人（人毛针.fa）微RNA前体的例子。

8. 适配器拆卸、条形码排序和修剪

1. 在左侧选项卡中，导航到基因组文件操作 > FASTA/FASTQ > 剪辑适配器序列。
2. 在FASTA 或 FASTQ 格式的输入文件中，从下拉列表中输入 FASTQ 文件。将最小序列长度更改为 18。更改源以输入自定义序列。输入CTGTAGGC。保留所有其他默认参数。单击"执行"。
   注:短于18个核苷酸的序列读取很难唯一映射到微RNA，并且包含许多降解产物。
3. 在左侧选项卡中，导航到基因组文件操作 > FASTA/FASTQ > 条形码拆分器。
   注: Galaxy 函数和标头会定期更新，因此搜索功能可能需要查找等效工具或其位置。使用索引引基器的商业套件通常已经按条形码排序。因此，如果从商业套件开始，则不需要此步骤和条形码修剪步骤。
4. 对于使用条形码，指向条形码.txt。要拆分库，对上一步中生成的数据文件使用剪辑。在允许的不匹配数中，输入1。单击"执行"。
5. 修剪前 4 个核苷酸:导航到文本操作 > 修剪前导字符或尾随字符。对于输入数据集，单击文件夹图标，这是数据集集合。选择样本的批处理文件，其中包括数据上的条形码拆分器标签。在从开始到此位置的修剪中，输入5。在 FASTQ 格式的输入数据集中？输入"是"。单击"执行"。执行可能需要几分钟时间。

9. 读取与微RNA的对齐

1. 在银河，导航到基因组分析 > RNA-Seq > Sailfish 成绩单11 .
2. 对于问题，从历史记录中选择参考转录本或使用内置索引？选择"从历史记录中选择一个"。从下拉列表中输入上传的文件 mousehairpins.fa.在 FASTA/Q 文件中，单击文件夹图标以使用数据集集合，然后选择包含集合上的修剪的文件。单击"执行"。执行可能需要几分钟时间。
3. 在右侧的"历史记录"选项卡中，单击集合中的 Sailfish...单击每个单独的文件，然后单击要保存到本地计算机的磁盘图标。单独下载的文件首先需要解压缩。出于导入到电子表格中的目的，可能还需要使用 .txt 扩展重新保存它们。
4. 在 中打开每个电子表格文件，并将NumReads列重新命名为治疗条件。将列合并在一起，在第一列中生成微RNA矩阵，并在后续列中读取每个条件计数。
5. 要计算每种治疗条件的微RNA差异表示，请使用带有原始微RNA读取计数的文件作为DESeq2¹²等程序的输入。DESeq2 存在于银河基因组分析> RNA-seq > DESeq2选项卡中。
6. 将原始读取转换为规范化的微RNA读取计数。通过以下计算，计数归一化为库的库序列深度:[（原始读取/总微RNA读取）]（1，000，000 = 计数的微RNA数） = 1]。
   注: 此计算提供每百万映射的标准化读取 （RPM） 映射微RNA，可跨数据集和生物条件进行比较。输出是一个选项卡分隔文件。Sailfish 提供tpm输出列，尽管此值通过微RNA 发夹长度进行规范化，在此上下文中没有必要。
7. 如果相关，请重复对齐自定义输入序列（例如矢量），以标识映射到交付构造的读取，如 shRNA。

结果

图书馆准备中涉及的步骤图
图2概述了小RNA提取、测序和对齐的总体原理图。
采集了一只雄性小鼠和一只雌性小鼠的肝脏样本，并冷冻在液氮中。提取总RNA并评估质量和浓度。

小RNA测序产生足够的RNA测序
从两个独立的RNA提取中提取的3μgRNA被用作小RNA测序的起始材料。样?...

讨论

尽管20多年前鉴定了微RNA，但微RNA测序过程仍然十分费力，需要专门的设备，阻碍了实验室常规采用内部^协议14。其他技术可以同时评估微RNA，如微RNA微阵列和多路复用表达面板;然而，这些方法是有限的，因为它们只量化其探针集中存在的微RNA。因此，他们忽略了小RNA测序的重要特征，如新微RNA的鉴定，以及微RNA等形式-核苷变化，这些改变可以产生重要的生物?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 bp DNA ladder	NEB	N3231
19:1 bis-acrylamide	Millipore Sigma	A9926
25 bp DNA step ladder	Promega	G4511
Acid phenol/chloroform	ThermoFisher	AM9720
Acrylamide RNA loading dye	ThermoFisher	R0641
Ammonium persulfate (APS)	Biorad	161-0700
Bioanalyzer instrument	Agilent	G2991AA	For assessing RNA quality and concentration
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
Ethanol (100%)	Sigma	E7023
Gel Loading Buffer II	ThermoFisher	AM8547
GlycoBlue	ThermoFisher	AM9516	Blue color helps in visualizing pellet
HCl	Sigma	320331
KOH	Sigma	P5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm	Genesee	45-109
miRVana microRNA isolation kit	ThermoFisher	AM1560
miSeq system	Illumina	SY-410-1003	For generating small RNA sequencing data
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Nusieve low-melting agarose	Lonza	50081
Parafilm (laboratory sealing film)	Millipore Sigma	P7793
Poly-ethylene glycol 8000	NEB	included with M0204
ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit	NEB	E6560S
QIAquick Gel Extraction kit	Qiagen	28704
Qubit Fluorometer	ThermoFisher	Q33226	For quantifying DNA concentration
Qubit RNA HS Assay kit	ThermoFisher	Q32855
Razor Blades	Fisher Scientific	12640
Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes	Fisher Scientific	02-681-331
T4 RNA ligase 1	NEB	M0204
T4 RNA Ligase 2, truncated K227Q	NEB	M0351S
TapeStation	Agilent	G2939BA	For assessing RNA quality and concentration
Taq DNA Polymerase	NEB	M0273X
TEMED	Biorad	161-0800
Tris Base pH 7.5	Sigma	10708976001
Tris-buffered EDTA	Sigma	T9285
Trizol	ThermoFisher	15596026
UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml)	Invitrogen	15585-011
Universal miRNA cloning linker	NEB	S1315S
Urea	Sigma	U5378