利用病毒进入检测和分子对接分析鉴定抗病毒候选药物,对抗Coxsackie病毒A16

摘要

该协议的目的是说明与病毒进入相关的不同检测,可用于识别候选病毒进入抑制剂。

摘要

抗病毒测定,机械检查病毒进入是相关的,以辨别哪个步骤评估的剂是最有效的,并允许识别候选病毒进入抑制剂。在这里,我们介绍通过靶向病毒颗粒或早期病毒进入中的具体步骤来识别能够阻止非包络的coxsackie病毒A16(CVA16)感染的小分子的实验方法。分析包括药物添加时间分析、基于流细胞学的病毒结合测定和病毒失活测定。我们还提出了一种分子对接协议,利用病毒帽蛋白来预测抗病毒化合物靶向的潜在残留物。这些检测应有助于识别对病毒进入作用的候选抗病毒药物。未来的方向可以探索这些可能的抑制剂,以进一步的药物开发。

引言

手足口病 (HFMD) 是一种最常见的疾病,由病毒病毒 A16 (CVA16) 和肠道病毒 71 (EV71) 在幼儿中引起。最近,在整个亚太地区,CVA16引起的手足口病显著上升。虽然症状可能是轻微的,严重的并发症可能发生,影响大脑和心脏,与潜在的死亡1,2。目前,CVA16没有获得许可的抗病毒疗法或疫苗接种,因此迫切需要制定抗病毒战略,以遏制未来的疫情和相关并发症。

CVA16 是一种非包络病毒,其病毒由五角星组装而成,每个病毒都含有 4 种结构蛋白,即 VP1、VP2、VP3 和 VP4。五角星中每个五折轴的包围是一个"Canyon"区域,它表现出抑郁症,并以其在受体^结合3中的作用而闻名。在这个峡谷的底部是一个疏水口袋在VP1区域,其中包含一个天然脂肪配体名为狮身人面像(SPH)。细胞受体,如人P选择糖蛋白配体1(PSGL-1)和清除受体B类成员2(SCARB2),已被建议在病毒结合中发挥作用,取代这种配体,导致与帽状的变化随后将病毒基因组喷射到宿主细胞4,5,6。识别阻止病毒进入过程中连续事件的可能抑制剂可以提供针对CV....

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研究方案

注:所有细胞培养和病毒感染必须在与所处理样品的生物安全水平相适应的经认证的生物安全罩中进行。两种单宁类小分子化学酸(CHLA)和双核蛋白(PUG),被观察有效阻止CVA16感染9,被用作候选抑制剂的例子。关于病毒学技术、病毒传播、病毒牙斑测定以及斑块形成单元(PFU)或感染多重性(MOI)的概念等基本原则,读者参考参考^文献10。

1. 细胞培养、病毒制备、化合物制备和复合细胞毒性

1. 人类横纹肌瘤(RD)细胞是宿主细胞,允许CVA16^感染11。在 Dulbeco 的改性 Eagle 培养基 (DMEM) 的 10 mL 中生长 RD 细胞,辅以 10% 胎儿牛血清 (FBS)、200 U/mL 青霉素 G、200 μg/mL 链霉素和 0.5 μg/mL 安培林 B 在 T-75 烧瓶中,在 37°C 的 Co₂培养箱中。
2. 通过在RD细胞中传播病毒,确定PFU/mL中的病毒性定位剂,制备CVA16。有关优化的协议,请参阅参考¹¹。
3. 使用各自的溶剂制备测试化合物和对照组:例如,将CHLA和PUG溶解在二甲基亚硫酸盐(DMSO)中。对于所有感染步骤,基础介质由 DMEM 加 2% ....

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结果

药物添加时间测定如图1所示,显示了使用小分子CHLA和PUG治疗对CVA16感染的影响,无论是病毒输入前(预治疗),病毒进入(共添加),还是病毒后进入(感染后)。无论是病毒感染前对宿主细胞的前期处理(图1A),还是在感染后治疗(图1C),这两种小分子对CVA16的感染性只产生轻微影响。相比之下,CHLA 和 PUG 在共增治疗中有效.......

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讨论

在本报告中,我们描述了有助于识别针对病毒进入的抗病毒候选项,特别是针对非包络的CVA16的抗病毒候选方案。检测方法旨在剖析病毒进入过程中的早期事件,有助于阐明检测剂抗病毒活性的作用机制和潜在靶点。"药物添加时间测定"允许广泛确定测试化合物的潜在目标,例如未感染的宿主细胞(预处理分析)、病毒颗粒或其与宿主细胞表面的相互作用(共增分析)),或病毒复制阶段(感染后分析)中受病毒感.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG	Invitrogen	A11029
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Anti-VP1 antibody	Merck-Millipore	MAB979	Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer	Beckman Coulter	FC500
Corina	Molecular Networks GmbH
Crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
Formaldehyde	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
Methylcellulose	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
PyMol	Schrödinger
UCSF Chimera	University of California, San Francisco