免疫细胞衍生细胞外囊泡的表征及研究功能对细胞环境的影响

摘要

本报告强调了从微胶质或血液巨噬细胞分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。微胶质衍生的EV被评价为神经外生长的调节器，而血液巨噬细胞衍生的EV在体外检测中控制C6胶质瘤细胞入侵时被研究。目标是更好地了解这些EV功能作为免疫中介器在特定微环境中。

摘要

中枢神经系统（CNS）的神经炎状态在生理和病理状况中起着关键作用。微胶质，大脑中的常驻免疫细胞，有时渗入骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM），调节其微环境在中枢神经系统的炎症特征。现在人们承认，免疫细胞的细胞外囊泡（EV）种群充当免疫中介。因此，它们的收集和隔离对于识别其内容，但也评估其对受体细胞的生物影响也很重要。本数据强调了从微胶质细胞或血液巨噬细胞（包括超中心化和大小排除色谱（SEC）步骤中分离EV的时间顺序要求。非靶向蛋白组分析允许将蛋白质特征验证为EV标记，并特征为生物活性EV含量。微胶质衍生的EV也功能地用于神经元的主要培养，以评估它们作为中微子生长中免疫中介的重要性。结果表明，微胶质衍生的EV有助于促进体外微子的生长。同时，血液巨噬细胞衍生的EV在C6胶质瘤细胞的球体培养物中作为免疫中介器，结果表明这些EV在体外控制胶质瘤细胞入侵。本报告强调了评估EV介导免疫细胞功能的可能性，但也了解这种通信的分子基础。这种破译可以促进使用天然囊泡和/或体外制备治疗性囊泡，以模仿中枢神经系统病理学微环境中的免疫特性。

引言

许多神经病理学与神经炎症状态有关，这是一种日益被考虑的复杂机制，但由于免疫过程多种多样，并且依赖于细胞环境，因此仍难以理解。事实上，中枢神经系统疾病没有系统地涉及相同的激活信号和免疫细胞群，因此亲炎反应很难作为病理的原因或后果来评价。大脑常驻巨噬细胞称为"微胶质"，似乎在神经和免疫系统^{之间的接口1。}微胶质有一个骨髓起源，从原始造物病期间的蛋黄囊派生，以殖民大脑，而外周巨噬细胞从胎儿肝脏在决定性的造物形成过程中，成为外周巨噬细胞^2。微胶质细胞与神经元和神经元衍生的胶质细胞（如星形细胞和寡^核糖3）通信。最近的几项研究表明，微胶质在中枢神经系统发育和成人组织平衡过程中，以及与神经退行性疾病^44、55相关的炎症状态中，都涉及神经元可塑性。否则，血脑屏障的完整性可能会在其他中枢神经系统疾病中受损。免疫反应，特别是在胶质细胞瘤多肠癌中，不仅由微胶质细胞支持，因为血脑屏障通过血管生成过程和淋巴血管^{的存在6，77}重组。因此，在整个肿瘤依赖性血管生成机制⁸中，脑肿瘤中出现了一个大的骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）。癌细胞对渗透的BMDM有显著影响，导致免疫抑制特性和肿瘤生长^9。因此，由于细胞起源和激活^{信号多种多样，}免疫细胞与其大脑微环境之间的通信是难以理解^的。因此，在生理条件下，对免疫细胞相关分子特征的功能进行鉴定是很有趣的。在这方面，通过释放细胞外囊泡（EV），可以研究免疫细胞和细胞微环境之间的细胞-细胞通信。

在调节健康及^{病理状况的,}免疫功能方面，EV正研究得^{越来越多。}可以考虑两个种群，外体和微囊。它们呈现不同的生物发生和大小范围。外泌体是直径±30~150nm的囊泡，由内体系统生成，在多孔体（MVB）与等离子膜融合期间分泌。微囊直径约为100~1000纳米，由细胞等离子膜¹⁴外萌芽产生。由于外泌体与微囊歧视仍难以根据大小和分子模式来实现，因此本文仅使用"EV"一词。CNS的EV相关通信代表了一种祖先机制，因为研究表明它们与无脊椎动物物种（包括线虫、昆虫或阴叶^{15、16）,16}有牵连。此外，结果显示，EV可以与不同物种的细胞通信，表明这种机制是一个关键锁系统，首先基于囊泡和受体细胞之间的表面分子识别，然后允许接受调子^{16，17。16,}事实上，EV含有许多分子，如蛋白质（如酶、信号转导、生物成因）、脂质（如神经酰胺、胆固醇）或核酸（例如DNA、mRNA或miRNA），作为受体细胞活动的直接或间接调节剂^14。这就是为什么方法学研究也进行免疫细胞分离EV和充分表征他们的蛋白质特征^{18，19。18,}

最早的研究表明，在Wnt3a-或血清素依赖活化^20，21,21之后，从原培养大鼠微胶质中释放外体是一种诱导机制。在CNS的功能中，微胶质衍生的EV调节突触神经质释放通过神经元的预显终端促进神经元兴奋性控制^{22，23。22,}微胶衍生的EV也可以传播细胞因子介导的炎症反应在大大脑区域^{24，25。24,}重要的是，收费型受体家族的多样化配体可能会激活微胶质²⁶中特定EV的生产。例如，体外研究表明，LPS激活的微胶质BV2细胞系产生微分EV含量，包括亲炎细胞因子^27。因此，通过自身的EV种群，包括EV对受体细胞的影响和EV内容的识别，可以评估中枢神经系统中免疫细胞亚群的功能多样性、微胶质和渗透性BMDM。

我们之前描述了在微胶质和BMDM衍生的EV分离^16，19,19后的功能特性的方法。在本报告中，我们建议独立评估微胶质衍生的EV对神经质外生长的影响，以及巨噬细胞衍生的EV对胶质瘤细胞聚合控制的影响。本研究还提出了对EV分数进行广泛的蛋白质组分析，以验证EV分离程序，并识别生物活性蛋白特征。EV内容的有益效果和分子破译可以帮助它们可能操纵，并作为脑疾病的治疗剂使用。

研究方案

1. 微胶质/巨噬细胞的主要文化

1. 微胶质的主要文化
   1. 培养商业大鼠原生微胶质（2 x 10⁶细胞）（见材料表）在Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）中补充10%无异体血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链球菌素和9.0克/L葡萄糖，37°C和5%CO2 。₂
   2. 收集48小时培养后的条件介质，然后进行 EV 隔离。
2. 巨噬细胞的主要培养
   1. 培养商业大鼠原发性巨噬细胞（1 x 10⁶细胞），在制造商提供的介质中（参见材料表），温度为37°C，CO2为5%，具有无外体血清。₂
   2. 收集24小时培养后的条件介质，然后进行与 EV 隔离。

2. 隔离电动汽车

1. EV 与空调介质的预隔离
   1. 将条件培养介质从微胶质或巨噬细胞培养（步骤 1.1.2 或 1.2.2）转移到圆锥形管中。
   2. 在室温 （RT） 下，在 1，200 x g下离心 10 分钟，以颗粒细胞。
   3. 将上清液转移到新的锥形管中。在 RT 时以 1，200 x g的离心机 20 分钟，以消除凋亡体。
   4. 将上清液转移到 10.4 mL 聚碳酸酯管中，并将管转移到 70.1 Ti 转子中。在 100，000 x g下超离心机，在 4 °C 下 90 分钟，以颗粒 EV。
   5. 丢弃上清液，在 200 μL 0.20 μm 过滤磷酸盐缓冲液盐水 （PBS） 中重新悬浮含有 EV 的颗粒。
2. 隔离电动汽车
   1. 准备自制尺寸排除色谱柱（SEC）
      1. 空一个玻璃色谱柱（长度:26厘米;直径:0.6厘米）（见材料表），清洗和消毒。
      2. 在柱的底部放置一个 60 μm 过滤器。
      3. 用交联的琼脂凝胶过滤基质堆叠柱，以创建直径为 0.6 厘米、高度为 20 厘米的固定相。
      4. 用 50 mL 0.20 μm 过滤 PBS 冲洗相位。储存在4°C，以便以后在必要时使用。
   2. 将重新悬浮的 EV 颗粒放在 SEC 柱的固定相的顶部。
   3. 收集 20 个 250 μL 的连续分数，同时在固定相的顶部继续添加 0.20 μm 过滤 PBS，以防止柱干燥。如有必要，将分数储存在 -20 °C。
      注:储存时间超过一周，可在-80°C下进行，以保持分子分析的EV完整性。
3. SEC分数的矩阵辅助激光脱电电位（MALDI）质谱分析
   1. 按照第 2.2 节所述，继续 EV 隔离。
   2. 使用 200 μL 肽校准混合溶液重新悬浮 EV 颗粒（参见材料表）。
   3. 按照第 2.2.1 节到 2.2.3 节所述，继续进行 EV 收集。
   4. 使用真空集中器完全干燥分数。
   5. 用10μL0.1%的三氟酸（TFA）重新组成分数。
   6. 在 MALDI 抛光钢靶板上将 1 μL 的重组分数与 1 μL 的 β-氰酸 -4-羟基辛酸 （HCCA） 基质混合。
   7. 使用 MALDI 质谱仪分析所有分数。
   8. 使用专用软件分析生成的光谱（参见材料表）。

3. 电动汽车的特性

1. 纳米粒子跟踪分析（NTA）
   注:NTA分析使用纳米粒子跟踪分析仪器（参见材料表）和自动注射器泵进行。
   1. 使用 0.20 μm 过滤 PBS 从步骤 2.2.3 对每个 SEC 分数进行稀释（范围为 1:50 到 1:500）。
   2. 涡旋消除 EV 聚合的解决方案。
   3. 将稀释后的溶液放入 1 mL 注射器中，并将其放入自动注射器泵中。
   4. 调整摄像机设置以屏幕增益级别 （3） 和摄像机级别 （13）。
   5. 单击"运行"并启动以下脚本。
      1. 将样品装入分析室（输液率:1，000，15 s）。
      2. 减少和稳定视频录制的速度流量（输注率:25 为 15 s）。捕获三个连续的 60 s 粒子流视频。
      3. 在视频分析之前调整摄像机级别 （13） 和检测阈值 （3）。单击"设置"*好的，开始分析，并在分析完成后单击"导出"。
   6. 在每个分数分析之间，用 1 mL 0.20 μm 过滤 PBS 进行洗涤。
2. 电子显微镜分析
   1. 隔离第 2 节中所述的 EV。
      注:不需要无菌条件。
   2. 重复第 3.1 节以量化 EV。
      注:只有正分数用于 EM 分析。
   3. 使用 50 kDa 离心滤波器（参见材料表）浓缩含 EV 的 SEC 分数。
   4. 在30μL的2%甲醛（PFA）中重新悬浮浓缩EV。
   5. 将样品的10μL加载到碳涂层铜网格上。
   6. 在潮湿的环境中孵育20分钟。
   7. 重复步骤 3.2.5 和 3.2.6，以很好地吸收网格上的样品。
   8. 在 RT 中将电网转移到 PBS 中 1% 谷醛的下降 5 分钟。
   9. 用超纯水清洗样品几次。
   10. 将样品在冰上对比10分钟，混合4%醋酸酯和2%甲基纤维素（1:9，v/v）。使用滤纸去除混合物的过量。
   11. 干燥样品，并在200千伏的透射电子显微镜下观察（参见材料表）。
3. 西方斑点分析
   1. 蛋白质提取
      1. 重复步骤 3.2.1 到 3.2.3 以隔离和浓缩电动汽车。
      2. 混合50μL的RIPA缓冲液（150 mM氯化钠[NaCl]，50 mM三酯，5 mM乙二醇-双乙酯（2-氨基乙酰乙酯）-N，N，N+，N+-四乙酸[EGTA]， 2 mM 乙烯二胺-四乙酸 [EDTA]， 100 mM 氟化钠 [NaF]， 10 mM 硫酸钠， 1% Nonidet P-40， 1 mM 苯甲烷磺酸素氟化物 [PMSF]， 1x 蛋白酶抑制剂） 与 EV 样品 （25 μL 产生的滤芯上的 EV 浓度） 为 5 min 在冰上提取蛋白质.
      3. 5 s（振幅:500 W;频率:20 kHz）的声波，冰上3次。
      4. 在4°C时，在20，000 x g处离心，将车辆碎片移走10分钟。
      5. 收集上清液，用布拉德福德蛋白测定法测量蛋白质浓度。
   2. 硫酸钠磺酸聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 和西印迹
      1. 将蛋白质提取物 （30 μg） 与 5c 莱姆利样品缓冲液 （v/v） 混合。
      2. 将蛋白质混合物装入12%聚丙烯酰胺凝胶上。
      3. 使用 TGS 缓冲液（25 mM Tris pH 8.5、192 mM 甘氨酸和 0.1% SDS）在 70 V 下迁移凝胶中的蛋白质，15 分钟和 120 V 45 分钟。
      4. 在230 V时将蛋白质转移到半干燥系统中的硝基纤维素膜30分钟。
      5. 在 RT 时用阻塞缓冲液饱和膜 1 小时（0.05% Tween 20 w/v，5% 奶粉在 0.1 M PBS 中，pH 7.4）。
      6. 用小鼠单克隆抗人热冲击蛋白90（HSP90）在阻断缓冲液中稀释的抗体（1:100）在4°C下孵育膜过夜。
      7. 使用 PBS-Tween（PBS，0.05% Tween 20 v/v）清洗膜三次，15 分钟。
      8. 在RT孵育膜1小时，用山羊马萝卜过氧化物酶-偶联抗小鼠IgG二次抗体稀释在阻塞缓冲液（1:10，000）。
         注:仅使用辅助抗体执行负控制。
      9. 重复洗涤步骤（步骤 3.3.2.7）。
      10. 使用增强的化学发光 （ECL） 西印迹基板套件显示膜（参见材料表）。
4. 蛋白酶分析
   1. 蛋白质提取和凝胶内消化
      1. 重复步骤 3.2.1 到 3.2.3 以隔离和集中电动汽车。重复步骤 3.3.1 进行 EV 蛋白质提取。
      2. 在 12% 聚丙烯酰胺凝胶的堆叠凝胶中执行蛋白质迁移。
      3. 在RT中用coomassie蓝色固定凝胶中的蛋白质20分钟。
      4. 去除每个彩色凝胶片，并切成1毫米³的小片。
      5. 用每种溶液的300μL连续清洗凝胶片:超纯水15分钟，100%丙酸酯（ACN）15分钟，100m碳酸氢铵（NH₄HCO 3）15分钟₃，ACN:100 mM NH₄HCO 3（1:1，v/v）15分钟，100%ACN连续搅拌5分钟。₃
      6. 使用真空集中器干燥完全凝胶片。
      7. 在56°C下，使用100 μL的100μL NH₄HCO_3，含有10mM二硫硫醇，在56°C下1小时，进行蛋白质还原。
      8. 在 RT 黑暗中，使用 100 μL 的 100 μL NH₄HCO₃进行蛋白质烷基化，含有 50 mM 碘化酰胺，在黑暗中 45 分钟。
      9. 用每种溶液的 300 μL 连续清洗凝胶片:NH₄HCO₃的 100 mM 15 分钟，ACN:20 mM NH₄HCO 3（1:1，v/v）15 分钟，100% ACN 持续搅拌 5 分钟。₃
      10. 使用真空集中器完全干燥凝胶片。
      11. 在20 mM NH₄HCO₃中，在37°C下过夜，用50μL的胰蛋白素（12.5微克/米）进行蛋白质消化。
      12. 从凝胶中提取消化的蛋白质，在37°C下，在37°C下用50μL100%ACN提取30分钟，然后在RT中连续搅拌15分钟。
      13. 重复以下提取程序两次:50 μL 5%TFA在20 mM NH₄HCO₃溶液中连续搅拌20分钟。
      14. 加入 100 μL 100% ACN，持续搅拌 10 分钟。
      15. 使用真空集中器干燥消化的蛋白质，并在 20 μL 中重新悬浮 0.1% TFA。
      16. 使用带有C18反向相介质的10μL移液器尖端对样品进行脱盐和浓缩肽（参见材料表）和具有ACN:0.1%的福酸（FA）（80:20，v/v）的蛋白精肽。
      17. 使用真空集中器完全干燥样品，重新悬浮在 20 μL 的 ACN:0.1% FA （2:98， v/v） 用于液相色谱串联质谱仪 （LC-MS/MS）。
   2. LC-MS/MS 分析
      1. 将消化的肽加载到LC-MS/MS仪器中，并根据其他地方⁴²详细描述的参数进行样品和数据分析。
   3. 原始数据分析
      1. 使用标准参数处理质谱数据，以识别每个样品的蛋白质并将每个样本的已识别蛋白质与定量蛋白质组学软件包进行比较。
      2. 使用标准参数导出预测蛋白质网络和生物过程的软件中来自EV阳性样品的排他性和过度代表蛋白列表。
      3. 将分数中已识别的蛋白质列表与 Exocarta 开放访问数据库中的前 100 个 EV 标记进行比较（参见材料表）。

4. 功能性电动汽车效果测定

1. PC-12细胞系的Neurite外生长测定
   1. 培养PC12细胞系在完整的DMEM介质（2 mM L-谷氨酰胺，10%胎儿马血清（FHS），5%胎儿牛血清（FBS），100 UI/mL青霉素，100微克/mL链球菌霉素）。
      注:在整个过程中，血清是无外生体。
   2. 在 24 孔板中添加盖玻璃（所有孔）;用聚D-莱辛（0.1毫克/mL）和种子260，000个细胞/孔覆盖板。
   3. 在5%CO₂以下的37°C下孵育细胞。
   4. 孵育24小时后，将介质改为DMEM分化介质（DMEM与2 mM L-谷氨酰胺，0.1%FHS，100 UI/mL青霉素，100微克/mL链球菌霉素）与1 x 10⁶微胶质EV（从步骤1.1.2起）。
      注:在分化介质中，无需微胶质 EV即可执行控制条件。
   5. 在播种后的第 4 天，用 100 μL 的完整 DMEM 介质加载所有井。
   6. 在播种后的第7天，用4%PFA在RT上固定细胞20分钟，用PBS冲洗三次（每10分钟）。
   7. 在4°C下用红胺偶联性邻苯二苯二胺对细胞染色30分钟，用PBS冲洗3次（每次10分钟）。
   8. 在 RT 上用稀释的 Hoechst 33342 （1:10，000） 染色细胞 30 分钟，然后用 PBS 冲洗 3 次（每次 10 分钟）。
   9. 将盖玻璃安装在带有荧光安装介质的幻灯片上（参见材料表）。
   10. 使用共聚焦显微镜分析幻灯片，拍摄每张幻灯片的 5 张随机图像。
   11. 使用自动定量软件（总神经内粒长度）测量神经衰弱的生长，如其他地方⁴³详细描述的那样。
2. 大鼠原神经元的Neurite外生长
   1. 用聚D滑苯（0.1毫克/米）和层压（20微克/米L）涂抹8井玻璃滑道。
   2. 培养大鼠在适当的培养基中的商业原神经元（见材料表），通过每口电镀50，000个细胞，并在5%CO2下37°C孵育细胞48小时。₂
      注:在整个过程中，血清是无外体的。
   3. 将 1 x 10⁶微胶质 EV 添加到神经元培养基中，并在 5% CO₂低于 5% 的 37°C 下孵育 48 小时以上。
      注:在神经元培养基中，没有微胶质EV，控制条件。
   4. 按照步骤 4.1.6 到 4.1.9 修复和染色细胞。
   5. 按照步骤 4.1.10 和 4.1.11 分析幻灯片。
3. 胶质瘤细胞入侵
   1. 在全DMEM介质中重新悬浮C6大鼠胶质瘤细胞（含有10%FBS的DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，1倍抗生素），在20μL的最终浓度为8，000个细胞时含有5%的胶原蛋白。
      注:在整个过程中，血清是无外体的。
   2. 在60毫米组织培养盘的底部放置5 mL的PBS。将细胞悬浮液的 20 μL（8，000 个细胞）的盖子和沉积液滴倒置到盖子底部。
   3. 将盖子倒置到PBS填充的底部腔室上，以37°C和5%CO2孵育板72小时₂，直到形成细胞球形。
   4. 将 1 x 10⁸巨噬细胞 EV（从步骤 1.2.2）添加到 2.2 mg/mL 胶原蛋白混合物（2 mL 牛胶原蛋白 I 型溶液 [3 mg/mL]，250 μL 的 10 倍最小必需介质 （MEM） 和 500 μL 的 0.1 M 氢氧化钠）。
      注:控制条件在胶原蛋白混合物中不含巨噬细胞EV。
   5. 将含有EV的胶原蛋白混合物分布在24孔板中，用于嵌入细胞球体。
   6. 将新形成的细胞球体植入每个孔的中心。
   7. 在 37°C 和 5% CO₂下孵育板 30 分钟，将凝胶凝固。
   8. 此后，在每个井的胶原基上叠加400 μL的完整DMEM介质。
   9. 在37°C和_5%CO2下孵育整个系统共6天。
      注:使用 4x/0.10 N.A. 目标使用倒置光学显微镜通过数字摄影监控球体中的细胞入侵。
   10. 每天获取每口井的图像。
   11. 使用软件处理图像和量化细胞球形区域的入侵，如前面所述的细节^42。
       注:入侵和球形区域每天正常化到第0天测量的入侵和球形区域。

结果

将生物效应归因于细胞外囊泡 （EV） 的主要挑战之一是能够将 EV 与整个培养介质隔离开来。在本报告中，我们提出了一种使用超中心（UC）和大小排除色谱（SEC）的方法，该方法与蛋白质特征的大规模分析相结合，以验证EV标记物并识别生物活性化合物。巨噬细胞或微胶质衍生的EV分别在24小时或48小时培养后与条件介质分离（图1）。

讨论

中枢神经系统（CNS）是一个复杂的组织，细胞到细胞的通信调节平衡所需的正常神经元功能^30。EV现已被广泛研究，并被描述为细胞到细胞通信的重要分子货物^31。他们特别向受体细胞提供一种调子鸡尾酒，从而影响其在健康和病理条件下的功能^32。最近的研究表明，EV在中枢神经系统^{24、33、3433,34...}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-rad	4561045EDU
Acetonitrile	Fisher Chemicals	A955-1
Amicon 50 kDa centrifugal filter	Merck	UFC505024
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	sc-13119
B27 Plus supplement	Gibco	A3582801
BenchMixer V2 Vortex Mixer	Benchmark Scientific	BV1003
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford)	Bio-Rad	5000006
C18 ZipTips	Merck Millipore	ZTC18S096
C6 rat glioma cell	ATCC	ATCC CCL-107
Canonical tubes	Sarstedt	62.554.002
Centrifuge	Eppendorf	5804000010
CO2 Incubator	ThermoFisher
Confocal microscope LSM880	Carl Zeiss	LSM880
Cover glass	Marienfeld	111580
Culture Dish (60 mm)	Sarstedt	82.1473
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
DMEM	Gibco	41966029
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph	ThermoFisher
Electron microscope JEM-2100	JEOL
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich	03777-10G
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	ED-100G
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)			http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum	Gibco	16140071
Fetal Horse Serum	Biowest	S0960-500
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe	Fisherbrand	12893543
FlexAnalysis	Brucker
Fluorescence mounting medium	Agilent	S3023
Formic Acid	Sigma-Aldrich	695076
Formvar-carbon coated copper grids	Agar scientific Ltd	AGS162-3
Glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	340855
Hoechst 33342	Euromedex	17535-AAT
Idoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
InstantBlue Coomassie Protein Stain	Expedeon	ISB1L
Invert light microscope CKX53	Olympus
L-glutamine	Gibco	25030-024
LabTek II 8 wells	Nunc	154534
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Laminin	Corning	354232
MaxQuant software (proteins identification software)			https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell	Brucker	8268711
MEM 10x	Gibco	21090-022
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M6385-100G
MiliQ water	Merck Millipore
Milk	Regilait	REGILAIT300
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC
MonoP FPLC column	GE Healthcare		no longer available
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	NS300
NanoSight NTA software v3.2	Malvern Panalytical
NanoSight syringe pump	Malvern Panalytical
Neurobasal	Gibco	21103-049
Nitrocellulose membrane	GE Healthcare	10600007
Nonidet P-40	Fluka	56741
Nunc multidish 24 wells	ThermoFisher	82.1473
Paraformaldehyde	Electro microscopy Science	15713
PC-12 cell line	ATCC	ATCC CRL-1721
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peptide calibration mix	LaserBio Labs	C101
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
Perseus software (Processing of identified proteins)			https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate	Santa-cruz	sc-362065
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	78830
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190094	no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm	pluriSelect	43-50060
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
Polycarbonate centrifuge tubes	Beckman Coulter	355651
Protease Inhibitor	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
PureCol	Cell Systems	5005
Q-Exactive mass spectrometer	ThermoFisher
rapifleX mass spectrometer	Brucker
Rat cortical neurons	Cell Applications	R882N-20	Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium	Cell Applications	R620K-100	Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages	Cell Applications	R8818-10a
Rat primary microglia	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Healthcare	17014001
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Slide	Dustsher	100204
Sodium Chloride	Scharlau	SO0227
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Sodium hydroxide	Scharlab	SO0420005P
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	S6422-100G
SpeedVac Vacuum Concentrator	ThermoFisher
String software (functional protein association networks)			https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate	ThermoFisher	34075
Syringe 1.0 mL	Terumo	8SS01H1
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell	Bio-Rad	1703940
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508
Tris	Interchim	UP031657
Tris-Glycine	Euromedex	EU0550
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95765
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
Uranyl acetate	Agar Scientific Ltd	AGR1260A
Whatman filter paper	Sigma-Aldrich	WHA10347510
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	C2020-25G