分析泛性基质和泛性基质样的依从性转化后修饰和重大改变的识别

摘要

该协议旨在建立泛素 （Ub） 和泛素样 （Ubls） 特定蛋白酶，以便识别与特定条件（如治疗或表型）相关的此类翻译后修饰 （PTM） 的更改。

摘要

蛋白质的泛素（ub）和泛素样（ubl）依赖性转化后修饰通过控制蛋白质稳定性、活性、相互作用和细胞内定位，在细胞内发挥基本的生物调节作用。它们使细胞能够响应信号并适应其环境的变化。这些机制内的改变可能导致严重的病理情况，如神经退行性疾病和癌症。此处描述的技术的目的是从培养的细胞系快速准确地建立 ub/ubls 依赖型 PTM 配置文件。比较从不同条件下获得的不同轮廓，可以识别特定的改变，例如治疗引起的改变。Lentiviral介导细胞转导用于创建稳定的细胞系，表达修饰剂的双标记（6His和Flag）版本（泛素或ubl，如SUMO1或Nedd8）。这些标签允许从细胞中纯化泛基蛋白，因此也允许泛泛蛋白。这通过两步纯化过程完成:第一个在变性条件下使用 6His 标记执行，第二个在本机条件下使用 Flag 标记执行。这导致对修饰蛋白进行高度特异性和纯分离，随后通过液相色谱技术进行识别和半量化，然后采用串联质谱法（LC-MS/MS）技术。使用 Excel 软件对 MS 数据进行轻松的信息化分析，通过消除背景信号，可以建立 PTM 配置文件。这些配置文件在每个条件之间进行比较，以便确定具体的变化，然后更具体地研究，从标准生物化学技术验证开始。

引言

这里提出的方法致力于研究由培养的哺乳动物细胞中泛素家族成员介导的PTM，以便识别与特定条件（治疗、分化等）相关的潜在变化。PTM代表蛋白质功能调节的最后一^步1。事实上，一旦由翻译机制产生，大多数（如果不是全部）蛋白质会经历不同类型的PTM，调节其活性、分子相互作用和细胞内^位置1。在过多的PTM中，由无素蛋白家族、泛素本身和所有泛素样子介导，具有调节所有细胞内或部分细胞质^蛋白2的潜力。因为它们本身是蛋白质，它们可以相互结合，形成不同拓扑的同质和异质链，每个与特定的调控^函数2相关。需要工具来尝试破译和理解这个复杂的机器。世界各地的许多方法都是开发的，各有优缺点，在这里，我们提出了一种适合培养细胞的高性能方法。

该方法的主要优点是精度高。事实上，通过组合使用两个标记（6His和Flag）和两个步骤过程，分离修饰蛋白的纯度大大提高，因此它比单个标记融合Ub/Ubl^3，4更具选择性。6His 标签的存在使纯化在完全变性条件下迈出了第一步，从而避免了任何含有泛素结合域的蛋白质或与泛素结合的其他蛋白质结合。这是一个技术问题，其他几个方法基于亲和纯化泛化蛋白酶使用特定^抗体5或串联泛性结合元素（TUBEs）6。重要的是，这种技术没有偏向于对某种泛化的纯化，因为其他一些方法可能如此，因为单体和不同种类的多聚体被^识别7。因此，一旦发现，泛化的变化将不得不更详细地研究标准生化方法，以确定所涉及的完全化的确切类型。

最后，该协议的另一个技术优势是使用慢病毒，它可以轻松快速地创建稳定的表达细胞系，具有合理的标记修饰剂表达水平，而不会干扰正常的细胞行为。

虽然泛化的一个重要作用是靶向蛋白进行蛋白体降解，但现在已知它具有许多其他调节特性，可能大多数细胞内或部分细胞内^{蛋白质1。}这些功能的数量进一步增加与许多泛素像蛋白质的存在，形成一个蛋白质家族调节几乎每一个细胞^机制1。它们的改变会对细胞生物学产生剧烈的影响，并可能导致或参与病理^情况8，如^癌症9。因此，需要工具来探索这一广阔的景观，并确定与病理学疾病相关的改变，可以作为新的治疗目标。

该协议专用于培养中的细胞，因为它们需要转导以表达外源标记 Ub/Ubl。一旦创建，这些稳定的细胞系可用于从 2D 或 3D 或异种移植培养物中生成 Ubl 轮廓，从而扩展可用于研究 PTM 轮廓的不同实验模型的视野。

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研究方案

1. 生成表示 6His-Flag-Ubl 的稳定细胞系

注:用pCCL-6HF-Ubl、pVSVG和增量帮助器联合转染HEK-293T细胞。

1. 第0天:种子293T细胞在6孔板获得50-70%汇合后天。
2. 第1天:联合转染50-70%的转染细胞，混合1μgpCL-6HF-Ubl或pCCL-GFP，1μgpVSVG和1μg的增量-帮助剂载体，使用转染试剂和试剂生产慢病毒。转染6小时后，将培养基改为与要转导的细胞对应的新鲜介质。将细胞分在6孔盘中，以便在后天（开始转导的当天）获得10-20%的汇合。
3. 第2天:转染后24小时，使用0.45 μm过滤器回收含有慢病毒颗粒的培养基和过滤器。如果需要，此时添加新的培养基，以便产生第二批慢病毒。用含有慢病毒的细胞取代转导细胞的培养基（10-20%汇合）。
   注:伦蒂病毒介质可在转导前在+4°C下保存数天，或在-80°C下储存数月。
4. 在标准培养箱（37°C，CO2）中孵育24小时至72小时之间的慢病毒细胞，然后改变培养基，用于新的标准培养基。如果可能，使用倒置荧光显微镜检查GFP表达，以评估转导效率:表达细胞的百分比和每个细胞的相对表达水平。如果未检测到荧光，则等待额外的 2-3 天，因为表达可能需要更长的时间，具体取决于要转导的细胞类型。
5. 如果GFP控制为阳性，则生长所有细胞，直到有足够的功能，通过免疫荧光和西方斑点使用抗旗抗体执行6HF-Ubl的表达控制。

2. 改性蛋白质的双重纯化

注: 缓冲液1:6 M关尼迪-HCl，0.1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH 8.0，0.5% Triton X-100。
缓冲液 2: 50 mM NaH₂PO₄， 150 mM NaCl， 1% Tween20， 5% 甘油， pH 8.0.
缓冲液3:100 mM NH₄HCO₃，pH 8.0。

1. 细胞莱沙:一旦准备就绪，在室温（RT）下至少用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗一次培养皿，然后进行细胞变干，或者，在_液体N2中闪冷冷冻，并储存在-80°C。对于莱沙，在RT处每15厘米的培养皿中加入2 mL的缓冲液1。使用细胞刮刀在50 mL圆锥形离心管中回收所有液分物（最终体积约为20 mL）。
2. 以1分钟的停顿将分时三次，以30秒分开。
3. 在15，000 x g下将声波莱沙离心15分钟。
4. 使用细胞过滤器（40 μm）将上清液转移到新管中。
5. 确定样品的浓度，并在必要时进行调整，以获得相同量的蛋白质和相同的体积。使用总含量在50至100毫克的蛋白质（10个直径为15厘米的MiaPaCa-2细胞）。
6. 加入Ni^2+-NTA珠子，使用每1毫克蛋白质2μL的珠子。
7. 在 RT 处的 2.5 小时内以 30 rpm 转速旋转。
8. 在 500 x g下将珠子颗粒 5 分钟。
9. 用缓冲器1的1 mL清洗珠子，将样品转移到1.5 mL微离心管中，然后将管转移到冰上。在冰上或 4°C 处执行所有后续步骤。
10. 用含有10 mM imidazole的1 mL冰冷缓冲液2洗涤两次。
11. 要洗去结合蛋白，加入含有250 mM imidazole的缓冲液2600μL，并在4°C下旋转2小时。
12. 在500 x g下离心将珠子离心1分钟，将上生子转移到新的预冷却1.5 mL管中，并加入50μL的抗Flag M2抗体偶联珠。
13. 在 4°C 下以 30 rpm 旋转 2.5 小时，然后用 500 μL 的缓冲液 2 洗涤 2 次，然后用 500 μL 的缓冲液 3 洗涤 2 次。
14. 对于最终洗脱，加入100 μL的缓冲液3，在0.1 μg/μL处加入含有标记肽的缓冲液3，并在4°C下旋转1.5小时。
15. 在 500 x g下离心 1 分钟，并将上生子转移到新的预冷却管中。
16. 在 SDS-PAGE 上加载 10% （10 μL），对凝胶进行银染色，以控制纯化质量。如果纯化看起来良好，则分析 LC-MS/MS 留下的 90%。

3. 处理质谱数据，生成 Ub/Ubls PtM 的配置文件，并确定它们之间的显著差异

注:MS分析的结果包含许多信息，包括肽的总数以及每个样本中标识的每个蛋白质的峰值面积值（TOP 3肽^面积10的平均值）。这些数据可以使用肽计数数或峰值面积值处理，或两者兼而有之。对于峰值区域的计算，由于这些值通常位于 10⁶的范围内，因此在应用与下面的相同公式之前，有必要按此顺序将它们除以。两种计数方法获得的结果应表现出与通常相同的很强的相关性。对于每个已识别的蛋白质，请使用以下公式:
v1未处理泛性青基辛样品中的肽值（例如Ub - 药物）
v2在 Gemcitabine 处理的泛性基辛样品中的肽值（例如 Ub + 药物）
k1未处理对照 GFP 样品中的 k1 肽值（例如，GFP - 药物）
k2肽值在Gemcitabine处理控制GFP样品（例如，GFP + 药物）。

1. 规范化:使用以下公式使多宝他金和GFP的药物治疗细胞和未处理细胞之间的值正常化。规范化 v = V 和规范化 k = K。
   V1_v1。（[v1] [v2） / （2. [v1） ;V2_v2。（[v1] [v2] / （2. [v2） ]
   K1_k1.（[k1] [k2） / （2. [k1） ;K2_k2.（[k1] [k2] / （2. [k2）
2. 去除背景:使用以下公式，从泛化蛋白样本中的值中减去对照样本 （GFP） 中的值，以获得两种情况下每个已识别蛋白质的特定值 （V'1 和 V'2）。
   如果 V1-K1=0，则 V'1=V1-K1;如果 V1-K1_lt;0，V'1=0
   如果 V2-K2=0 ，则 V'2=V2-K2;如果 V2-K2_lt;0，V'2 =0
3. 泛化的变异（Var）。要获得药物引起的 PTM 正差和负变化的分数（介于 -100 和 +100 之间），请使用以下公式，其中处理过的样本和未经处理的样本的特定值之间的差值除以所有值的总和，包括控制（惩罚在控制GFP中也识别的蛋白质），并乘以100。
   Var = （V'2-V'1）/（V1_K1_V2_K2）=100 ;-100低于 -50（PTM 的抑制）或高于 50（PTM 的感应）的变异通常被认为是显著的。
4. 信心（信任）。使用以下公式获取介于 0 和 100% 之间的置信值:
   Conf = （（V1+V2）²/（1+V1_V2_K1+K2）2）=100 - 100/（1+V'1+V'2）;如果 <0
   高于 50 的值通常被认为是自信的。
5. 为了获得归纳/抑制值的更好分布，并考虑变异和置信参数，请使用以下公式将 Var 和 Conf 值相乘，其中 V Var 和 C Conf
   [SI（V2>0;（（V2+C2）+2）/（10+6）;-（（V2+C2）2）/（10+6））
   注:由于峰值面积值通常比肽计数更准确，因此可以使用专用于解释此类数据的特定软件，如 Perseus （https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus），以下使用建议。

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结果

培养哺乳动物细胞的转导，以创建GFP和6HF-Ub表达细胞
为了产生以后用于转导MiaPaCa-2细胞的慢病毒，70%的转化HEK-293T细胞与三种载体（pCCL-6HF-Ubiquitin或GFP/Delta-Helper/pvSvG）的等量共同转染。生产24小时后，回收并过滤含有慢病毒颗粒的介质。此时，通过检查在倒置显微镜上表达 293T 细胞的 GFP 的绿色荧光，可以控制转染效率。它应该接近100%的细胞。MiaPaCa-2细胞?...

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讨论

我们已经开发出一种强大而可靠的方法，用于生成由主要泛性家族成员修饰的蛋白质的配置文件。事实上，我们已经成功地应用了该协议，通过泛素、SUMO和Nedd8生成PTM的配置文件，并检测与^治疗7相关的改变，以回应特定基因的过度表达或敲除（数据不显示）和在细胞中获得对各种化疗药物的耐药表型。

在操作程序过程中，操作者应小心的只是几个关键步骤?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag