角膜内皮细胞损失非侵入性激光辅助实验模型的发展

摘要

在这里，我们提出了一个协议，从Descemet的膜（DM）分离角膜内皮细胞（CEC），使用一个镉:YAG（Nd:YAG）激光作为牛角病（BK）的外活体疾病模型。

摘要

Nd:YAG激光器已经用于进行非侵入性的眼内手术，如眼内切除术几十年了。精辟效果依赖于激光对焦处的光学故障。产生声冲击波和气穴气泡，导致组织破裂。气泡尺寸和压力振幅随脉冲能量和焦点位置而变化。在这项研究中，被包裹的猪眼被放置在商业上可用的Nd:YAG激光器前。测试了角膜后焦点的不同位置的可变脉冲能量以及不同位置。由此产生的病变通过双光子显微镜和组织学进行评估，以确定角膜内皮细胞（CEC）唯一分离的最佳参数，并尽量减少附带损害。该方法的优点是CEC的精确消融，减少附带损害，最重要的是非接触式处理。

引言

角膜的透明度对于将光传输到视网膜及其光感受器¹至关重要。在这方面，相对脱水状态对于保持角膜基质内的胶原纤维正确对齐至关重要。这种平衡由位于Descemet膜^（DM）2上的角膜内皮细胞（CEC）维持。内皮是最内层角膜层。它有一个重要的屏障和泵功能，这是角膜透明度³的关键。与上皮相比，内皮不能自我更新^4。因此，疾病或创伤造成的任何细胞损伤刺激剩余的内皮细胞扩大和迁移，覆盖由此产生的缺陷，并保持角膜功能^5。然而，如果CEC密度低于临界阈值，内皮的解值会导致水肿，导致视力模糊和不适，甚至剧烈疼痛^4。尽管有缓解症状的药物，目前这些病例中唯一的明确治疗方法是角膜移植，这种移植可以以全厚移植或角膜内皮移植的形式进行。后一个程序是作为Descemet的膜内皮角膜（DMEK）以及Descemet的剥离自动内皮角膜（DSAEK）6。⁶然而，保护剩余的CEC并增强其生存能力可能是一个替代目标，这需要一个适当的疾病模型来测试潜在的治疗药物。

目前的CEC损失病模型侧重于通过注射有毒物质（如氯化苯甲酸酯）或使用侵入性脱氨血症技术^77、88的细胞机械磨损来破坏内皮。虽然这些模型已经确立，但存在一般炎症反应和不精确的附带损害等缺点。因此，这些模型更有可能代表疾病的最后阶段，当上述手术选择是不可避免的。

随着干细胞和基因治疗等细胞治疗策略的进步，这些细胞疗法的应用在CEC损失⁹的早期阶段可能很有用。随后，我们需要一个模型，更充分地代表疾病的这些早期阶段。在这方面，细胞培养模型在过去十年中有所改善，但其有效性仍然有限，因为体外细胞无法接近于复制角膜¹⁰内不同细胞类型之间发生的复杂相互作用。因此，活体和体内疾病模型仍然需求量大，改进现有的模式是十分感兴趣的。

非侵入性，眼内手术通过光干扰使用镉:YAG （Nd:YAG） 激光已成为世界各地的眼科医生的例行程序，因为它在20世纪70年代末推出¹¹.光中断依赖于非线性光吸收，导致等离子体的形成，产生声冲击波，并产生气穴气泡，每当应用地点位于液体环境中^12。一般来说，这些过程有助于精确组织切割的预期效果。然而，它们也可能成为不必要的附带损害的来源，限制了当地对激光手术的监禁^。

通过对冲击波传播和气穴过程的表征，对由此产生的机械效应的预测有了显著改善。我们的目标是以尽可能少地破坏周围组织而达到CEC为目标，为CEC损失的早期阶段提供非侵入性激光辅助实验疾病模型。为此，有必要确定激光焦点的最佳脉冲能量和位置。

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研究方案

所有涉及动物组织的程序都遵循当地动物护理和道德委员会的准则。

1. 器官培养和激光治疗的准备

1. 从当地的屠宰场获得新鲜镶有的猪眼。在Dulbecco的改良鹰中（DMEM）中保持凉爽（4°C），高葡萄糖，辅以L-谷氨酰胺、丙酮钠、青霉素/链霉素（1%）和猪血清（10%），本文今后称为全中量。
2. 用剪刀去除细胞外组织，将眼睛浸泡在5%povidone-碘眼科溶液中5分钟，然后放入消毒的磷酸缓冲盐水（PBS）中，直到使用为止。
3. 屏幕眼睛的主要前段病理，如角膜疤痕，水肿，和其他不透明与光谱域光学相干断层扫描设备（材料表）。
4. 将眼睛放在装有Nd:YAG激光（材料表）的狭缝灯单元前面，该激光表的波长为1，064nm，在空气中的焦点直径为10μm。
   注:为了优化定位，使用了 3D 打印的保持装置，该装置旨在保持眼睛牢固，而不会给眼睛施加太大的压力（图1）。
5. 使用 12 倍的放大倍数并偏转照明以可视化各个角膜图层。
6. 设置脉冲能量（例如，1.6 mJ）和焦点（例如0.16毫米），以选择性消融内皮细胞。
7. 在边缘附近放置一个清晰的角膜对羟基体，并注射粘弹性（材料表），以稳定前室。
8. 使用 8 mm 的角膜去除激光处理的中央角膜。
9. 将切除的角膜放在12孔板的孔中，内皮部位朝上，在37°C下以3 mL全介质孵育标本长达3天。
   注:在此步骤中，可以将潜在的细胞保护剂添加到介质中。

2. 准备进行本体学

1. 准备索伦森的缓冲器，pH为7.4，含有19.6 mL的133 mM KH₂PO₄和80.4 mL的133 mM Na₂HPO_4。
2. 从含角膜的溶液中取出介质，在室温（RT）下用不含甲醇的甲醛（4%）固定组织20分钟在索伦森的缓冲区。
3. 将组织在PBS中20%蔗糖中放入，直到组织下沉（1小时），然后在RT的PBS中过夜30%蔗糖。注意避免与气泡和气表面界面接触。将组织嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物中，并储存在 -80°C。
4. 在 -27 °C 下使用低温器切割 10 μm 厚的部分。
   注:骆驼毛刷有助于在刀刃上引导新兴部分。
5. 通过在切割时1分钟内将切片接触到组织，以避免组织冻干，将部分转移到显微镜幻灯片上。将幻灯片存放在 -80°C。

3. 赫马托西林和欧辛（H&E）染色

1. 空气干燥部分几分钟，以去除水分。
2. 在50 mL管中用过滤0.1%的梅耶斯血氧林染色10分钟。
3. 在 Coplin 罐子中，在运行的 ddH₂O 中冲洗 5 分钟，浸入 0.5% eosin 10x。
4. 浸入 ddH₂O，直到 eosin 停止条纹，然后以 50% （10x） 和 70% （10x） EtOH 下降。
5. 在 95% EtOH （30 s） 和 100% EtOH （60 s） 中进行平衡，然后多次浸入二甲苯中。
6. 最后，在使用光学显微镜拍摄图像之前，先安装并盖上样品。

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结果

使用此处介绍的程序，我们使用 Nd:YAG 激光治疗眼睛，评估不同的脉冲能量 （1.0±4.6 mJ） 和焦点的位置（与角膜后表面的距离:0.0±0.2 mm），以找到最佳参数。对激光参数的每个星座（12 x 21）计算了多个复制 （n = 3）。

除上述协议外，在固定和H&E染色之前，还使用双光子显微镜对试样进行了分析。双光子显微镜采用固态模式锁定的 80 MHz Ti:蓝宝石激光器，调谐范围为 690×1b040 nm...

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讨论

试验研究结果表明，在选择能量剂量和焦点位置的适当参数时，Nd:YAG激光器可用于选择性地退位角膜内皮细胞。

由于内皮功能对角膜透明度和角膜免受基质水肿影响十分重要，内皮功能障碍模型在抗水肿药物或外科手术的发展中起着重要作用。有几个既定的体外模型来模拟体内情况10，14，15，但众所周知，体外模型不能完全模仿酶和细胞因子的影响或细胞-细胞相互作用的影?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Cryostat	Leica	CM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	PAA	E-15009
Eye holder	Self	N/A
Inverted Microscope	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010056
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C
Spectral-domain optical coherence tomograph	Heidelberg Engineering	Spectralis
Tissue culture plate 12-well	Sarstedt	833921
Two-Photon Microscope	JenLab	DermaInspect
Viscoelastic	OmniVision	Methocel