使用动脉内血压监测和通气通过气管切除术的小鼠脑死亡诱导

摘要

我们提出了脑死亡诱导的鼠模型，以评估其病理生理学效应对器官的影响，以及固体器官移植背景下的连续移植的影响。

摘要

虽然活体捐献和循环后死亡捐赠为器官移植提供了替代机会，但捐献者脑死亡后捐献（BD）仍然是实体移植的主要来源。不幸的是，大脑功能的不可逆丧失已知会导致多种病理生理变化，包括血液动力学和荷尔蒙修饰，最终导致全身炎症反应。允许在体内系统地研究这些影响的模型很少。我们提出了BD诱导的鼠模型，可以帮助调查BD对异体质量的破坏性影响。通过常见的胡萝卜动脉实施动脉内血压测量，并通过气管切开术进行可靠的通气后，BD 通过气球导管稳步增加颅内压力诱导。BD诱导后四小时，可以采集器官进行分析或进一步移植程序。我们的战略使人体内的BD能够全面分析，从而深入了解固体器官移植中BD相关的影响，并有可能为优化器官预置铺平道路。

引言

移植是目前治疗终末期器官衰竭的唯一治疗方法。到目前为止，脑死亡（BD）患者一直是器官捐献的主要来源，尽管活体捐献和循环后死亡后捐赠是有价值的选择^1。BD的定义是一个不可逆转的昏迷（与已知的原因），没有脑干反射和呼吸暂停^2。不幸的是，BD器官在长期移植生存中表现出低劣的结果，而人类白细胞抗原（HLA）不匹配和冷缺血时间^3。同时，对这种抗原无关危险因素进行了深入的研究，结果产生了BD引起的病理生理变化的三个主要方面:血液动力学、荷尔蒙和炎症^4。

迄今为止，啮齿动物的BD实验模型大多使用大鼠进行。为了更深入地了解BD之后固体器官的免疫后果，我们旨在建立BD的鼠模型，因为目前只有小鼠模型才能对遗传或免疫因素进行全面调查。在此背景下，鼠标系统提供了种类更丰富的分析工具。

此处描述的BD感应原理基于颅骨下插入的气球导管的膨胀引起的颅内压力增加。增加的颅内压力模仿BD的生理机制，通过阻断脑脑、小脑和脑干的灌注^55，6。6为了保证周围器官充分灌注，在手术过程中必须测量血压。同时用于此目的的导管用于盐水管理，以便通过液体替代来稳定血压。由于BD伴随着自发呼吸的停止，必须确保充足的通风。电热毯能维持生理核心体温。

综上所述，该模型将能深入研究BD诱发损伤的影响、白细胞迁移^7、恭维激活^8、缺血再灌注损伤⁹等因素。

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研究方案

动物实验是按照国家医学研究学会制定的《动物实验室护理原则和国家科学院编制、国家卫生研究院出版的实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物第86-23号，1985年修订版）进行的。所有实验均获得奥地利教育、科学和文化部的批准（BMWF-66.011/0071-II/3b/2012）。

1. 动脉导管化

1. 根据当地惯例（如丁丙诺啡），用内腹注射氯胺酮和西拉辛¹⁰和镇痛剂麻醉小鼠。 用钳子捏住后四肢，以确认麻醉的正确深度。
   注:在这项研究中，使用8~12周的男性C57BL/6N小鼠（体重20~25克）。作者测试了同龄的男性BALB/c，但没有成功，但没有尝试过其他菌株（见讨论）。
2. 使用电动剃须刀去除感兴趣区域（头部、颈部）的头发。确保不留松发，防止伤口污染。随后用70%乙醇/氯西丁/贝塔丁对手术现场进行消毒，并将小鼠的苏佩放在头部面向外科医生的手术现场。
3. 用解剖剪刀做颈椎中线切口。
4. 解剖下颌腺和颈部肌肉组织，并分离它们，以暴露常见的胡萝卜动脉。使用主要通过钳子进行钝剖面。
5. 放置三个 8-0正确的常见胡萝卜动脉下的丝结扎。
6. 在近端连扎上加紧，使动脉张力变大，使水流暂停。
7. 关闭最直端的连字。
8. 通过切口颅面上的一个小、预先形成的皮肤孔插入动脉导管。如果导管看起来太大，无法减少血液回流，则挤压和变形导管的流明。用所有三个连字固定。
9. 将导管固定到皮肤上，以避免脱位。使用缝合线（例如，5-0单丝，不可吸收），将导管连接到预成型皮肤孔区域的皮肤。

2. 气管切除术

1. 使用钳子直接切除前气管肌肉。
2. 放置两个 8-0气管下的丝绸连扎。
3. 尽可能使用微剪刀进行气管化，避免单侧通风。在两个气管软骨之间使用水平切割线。
4. 插入通风管，用两个准备好的连字固定。
   注:气管的近端不需要加扎。
5. 用跑步缝合线关闭皮肤（例如，6-0 单丝，不可吸收）。
6. 以 150/分钟的频率和 200 μL 的潮汐体积为鼠标通风。

3. 脑死亡诱导

1. 将鼠标排列到易发位置。
2. 使用手术剪刀和钳子从头骨上取下皮肤以容纳皮肤。
3. 在左皮层上方进行1毫米口径的钻孔。在打破内部紧凑骨骼和杜拉母体之前停止钻孔。
4. 用钝力穿透头骨的最终组织桥，去除锋利的边缘。
5. 插入气球导管，使其完全位于颅腔内。确保气球预填充盐水，并疏散所有空气。
6. 在注射器泵的帮助下，在 10~15 分钟（总体积为 0.8~1.2 mL）内，以 ±0.1 mL/min 开始膨胀。
   注:小鼠将表现出肌阵挛，肌阵挛，进一步的癫痫发作活动和前喘。
7. 一旦老鼠的尾巴变得僵硬并竖立起来，就宣布老鼠的大脑死亡。
   注:BD由典型的初始血压峰值（反射反射）、脑干反射和自发呼吸的缺乏证实。在实验期间应避免定期呼吸暂停测试，因为小鼠可能因缺氧而变得循环不稳定。
8. 停止气球导管的膨胀。
9. 在鼠标上铺上加热毯，避免体温过低。

4. 在 BD 期间

1. 定期监测和记录血压。排除具有长期下压相的小鼠（平均动脉压力 [MAP] < 50 mmHg，持续 30 分钟）。
2. 每30分钟注入0.1mL盐水，以稳定小鼠的血压。
   注:在本研究中，每只小鼠总共施用0.8 mL的盐水。
3. BD持续时间4小时后，收获小鼠器官/组织。如果鼠标的心脏在实验结束时未跳动，则将鼠标从实验中排除。

5. 沙姆程序

1. 执行步骤 1.1_3.3。
   注:请勿打开内部紧凑骨骼。请勿插入或充气气球导管。
2. 靠近老鼠，不断观察动物。反复用钳子捏住后四肢，以确认麻醉的正确深度。如果小鼠出现觉醒迹象，则进行皮下麻醉（大约起始剂量的1/2），根据我们的经验，大约在麻醉后2⁄3小时后发生。
3. 应用与BD小鼠相同的静脉盐水。
   注:假老鼠在停止通风后将恢复自发呼吸。BD 鼠标不会。在建立模型时应进行呼吸暂停测试，但在实验期间应避免由于不必要的生理压力。

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结果

鼠BD模型成功执行超过100次，成功率超过90%。此外，心肾介入后器官移植已安全进行⁷项。

BD 诱导各种病理生理学变化，可能使用此模型进一步研究。如图1所示，血压显示初始高血压峰值，然后是长时间的期。为了避免低血压的有害生理影响，排除了血压长期不足的小鼠（MAP < 50 mmHg 超?...

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讨论

BD是多器官捐赠者异体移植质量的危险因素，需要大量的病理生理变化，这些变化只能使用体内模型进行充分评估。血动力学变化、细胞因子风暴、荷尔蒙变化及其对器官移植质量和生存的最终影响不能^在体外分析。大多数基础移植和免疫学研究都依赖于复杂的诊断工具，这些工具仅在小鼠模型中广泛提供。小鼠模型已经导致在BD相关研究^77，8，9

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G)	BD	391349
Blood Pressure Transducers (APT300)	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
Forceps	FST	11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
Micro scissor	FST	15018-10
Needle holder	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
Scissor	FST	14075-11
Stereotactic microscope	Olympus	SZX7
Transpore Tape	3M	1527-1
Underpads	Molinea.A	274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845)	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109