成年大鼠复合再生外周神经接口（C-RPNI）的制造

摘要

以下手稿描述了开发一种称为复合再生外周神经接口 （C-RPNI） 的生物、闭环神经反馈系统的新方法。这种结构能够与外围神经集成，以放大运动信号，同时提供一个信号反馈。

摘要

神经假体的最新进展使那些患有肢体损失的人能够复制许多原生在缺失的四肢上的功能，这通常是通过与周围神经系统的整合来实现的。不幸的是，目前使用的方法往往与严重的组织损伤有关，防止长期使用。此外，这些设备通常缺乏任何有意义的感官反馈，因为他们复杂的结构抑制任何振动或其他感觉，用户以前可能依赖于使用更简单的假肢。复合再生外周神经接口 （C-RPNI） 是作为一种稳定的生物结构开发的，能够放大运动神经信号，同时提供同时的感官反馈。C-RPNI 由一段自由皮肤和肌肉移植组成，这些移植物固定在目标混合感觉运动神经周围，优先运动神经内移植肌肉移植和皮肤移植的感官神经内移植。在大鼠中，这种构造证明了复合肌肉作用电位（CMAP）的生成，将目标神经的信号从微伏到毫伏水平放大，信号噪声比平均约为30-50。刺激结构的皮肤组分在近端神经产生复合感觉神经作用电位（CSNAP）。因此，这种结构有广阔的未来效用，以实现理想，直观的假肢。

引言

截肢影响近190个美国人^1，其患病率预计将从现在的160万增加到超过360万到2050^年2。尽管有文件记载使用超过一千年，理想的假肢尚未实现^3。目前，存在复杂的假肢，能够进行多个关节操作，有可能再现原生四肢^4、5的许多运动功能。但是，这些设备不被视为直观，因为所需的假肢运动通常与输入控制信号在功能上是分开的。用户通常认为这些"高级假肢"难以学习，因此不适合日常使用^1，6。此外，目前市场上的复杂假肢不能提供任何明显程度的细微感官反馈，以进行适当的控制。触觉和自我感知对于执行日常任务至关重要，如果没有这些，简单的行为，如拿起一杯咖啡，就会变得很麻烦，因为它完全依赖于视觉线索^7，8，9。由于这些原因，先进的假肢与相当程度的精神疲劳有关，并经常被描述为负担和不满意^{5，10，11。}为了解决这个问题，一些研究实验室已经开发出了能够通过直接神经相互作用^{12、13、14、15}提供有限程度感官反馈的假肢，但反馈往往仅限于手和手指上的微小、分散的区域12、13，并且感觉有时¹⁵次是痛苦和不自然的。不幸的是，这些研究中有许多缺乏任何明显的长期随访和神经组织学来划定局部组织效应，同时指出界面衰竭的规模为周到月^16。

对于这些人群，理想的假肢装置将提供高保真运动控制，以及个人在其一生中从个人环境中获得有意义的躯体感官反馈。对于上述理想假肢的设计来说，关键是开发一个稳定、可靠的接口，允许同时传输具有有效运动信号的体感信息。目前最有希望的人机界面是那些直接与周围神经系统相互作用的界面，而神经集成假肢领域的最新发展有助于弥合生物电和机械信号之间的差距^。目前使用的接口包括:柔性神经板14，15，18，神经外袖口电极13，19，20，21，22，23，组织穿透电极24，25，31，32，和宫内电极^{26，27 ， 28}.然而，这些方法中的每一个都显示出神经特异性、组织损伤、斧子退化、骨髓消耗和/或疤痕组织形成与慢性外体反应相关的局限性16、17、18、19。最近，人们推测，最终植入电极故障背后的驱动因素是杨的调制在电子材料和原生神经组织之间的显著差异。脑组织每天受到显著的微运动的影响，据推测，由杨的月色差异引起的剪切应力会引起炎症，并最终造成永久性疤痕30，31，32。这种效应经常在四肢中复合，在四肢，周围神经受到生理微运动和故意四肢宏观运动的影响。由于这种恒定的运动，可以合理地得出结论，使用完全非生物的外周神经界面并不理想，并且与生物成分的接口将更合适。

为了满足对生物成分的需求，我们的实验室开发了一种生物神经界面，称为再生外周神经接口 （RPNI），将残肢中的外端外周神经与假肢装置集成。RPNI的制造包括手术将外周神经植入自体自由肌肉移植物中，随后再血管化和再生。我们的实验室在过去十年中开发了这种生物神经界面，在动物和人体试验中与植入的电极结合时，成功地放大和传输运动信号，从而可以进行具有多重自由度的适当假肢控制^。此外，我们分别演示了感官反馈，通过使用外周神经嵌入在皮肤移植，称为皮肤感官接口（DSI）3，35 。在较远端截肢时，同时使用这些构造是可行的，因为目标周围神经内的马达和感觉分节可以手术分离。然而，对于更近的截肢，由于运动和感觉纤维的混用，这是不可行的。复合再生外周神经接口（C-RPNI）是为更近的截肢而开发的，它涉及将混合感觉运动神经植入由自由肌肉移植物组成的结构中（图1）。外周神经表现出优先靶向的再生，因此感觉纤维将重新内层皮肤移植和运动纤维，肌肉移植。因此，这种结构能够同时放大运动信号，同时提供躯体感官反馈^36（图2），允许实现理想，直观，复杂的假肢。

研究方案

所有动物实验均经密歇根大学动物使用和护理委员会批准进行。

注:在皮肤和肌肉捐赠程序之前，允许捐赠大鼠免费获得食物和水。安乐死是在深度麻醉下进行的，然后用双边肺气肿的辅助方法注射心脏内氯化钾。任何大鼠菌株理论上都可以用于本实验;然而，我们的实验室在2至4个月大时，在雄性和雌性费舍尔F344大鼠（+200-250g）中取得了一致的结果。捐赠大鼠必须与实验鼠同源。

1. 准备皮肤移植

1. 在诱导室中利用氧气中5%的非氧溶液对供体大鼠进行麻醉，在0.8-1 L/min下。一旦大鼠被麻醉，从感应室中取出，放在重新呼吸的鼻锥上，将离锥体降至2-2.5%，以维持麻醉。
2. 在0.2 mL无菌盐水皮下，在肩部刀片之间施用0.02-0.03 mL卡洛芬（50mg/mL）溶液，用于麻醉。
3. 在双眼上涂抹人工泪膏，防止角膜溃疡。
4. 使用剪子，切切整个下肢、脚踝区域和爪子的侧面。
5. 用酒精清洁选择的爪后肢和植物表面，然后是碘多波维酮溶液，最后用酒精清洗，以去除残留的碘多波维酮。
6. 使用手持式微型电机高速钻头，带有可拆卸的圆形细砂抛光石（4000 rpm），在爪子的平面表面进行毛刺，以去除表皮。在打毛刺时，涂抹盐水滴，以便不灼伤皮肤。底层真皮具有闪亮的外观，具有精确出血。
7. 在下肢涂上止血剂，以减缓血流。
8. 用#15手术刀尖锐地去除植物皮肤，并放置在盐水湿润的纱布中，以防止干燥。在此步骤中，某些肌腱和结缔组织将固有的皮肤被移除，稍后将被移除。
9. 在出血的脚上涂上纱布包裹，以减缓出血。如果执行两个构造，请重复步骤 1.5-1.9。
10. 在显微镜下（20倍放大倍率），使用微剪刀从皮肤移植的深层去除肌腱和结缔组织。小心不要在移植物上打洞。薄皮移植物应略微不透明，仅含真皮，尺寸约0.5厘米x1.0厘米。
11. 放置在盐湿纱布，直到准备C-RPNI构造制造。在收获后2小时内应使用移植物。

2. 准备肌肉移植

1. 沿着下后肢的前肢进行纵向切口，从脚踝上方到膝盖正下方，用#15手术刀。通过皮下组织进行解剖，以暴露底层肌肉。
2. 在切口的远端，暴露下肢肌肉的肌腱插入。Tibialis 前体 （TA） 通常是肌肉中最大、最前，而此肌肉的下方和后部是扩展器数字长龙 （EDL）。将远端 EDL 肌腱与区域内的其他肌腱分离，注意此时不要将其插入。
3. 通过在肌腱下方插入两个钳子的齿，并通过打开钳子来引起肌腱偏移，确保正确肌腱的隔离。操纵这个肌腱应导致所有脚趾同时伸展。
4. 用锋利的虹膜剪刀进行远端切除术，用肌瘤（或其他钝尖剪刀）直接将肌肉与周围组织分离，以找到肌腱原点。
5. 一旦近端肌腱被可视化，再次使用锋利的虹膜剪刀进行脱风。将肌肉移植物放入盐水湿润的纱布中，以防止干燥。
6. 一旦从供体大鼠中取出所有所需的移植物，主要通过心脏内KCl注射（1-2 mEq K+/kg）进行安乐死，然后用#15刀片进行双边穿刺肺气肿的二次安乐死。

3. 常见的通神经隔离和制备

1. 根据步骤1.1-1.3中概述的协议，对实验大鼠进行麻醉和麻醉。
2. 切除所需的大腿，用酒精贝塔丁清洗，最后用酒精去除βdine的痕迹。
3. 将动物从手术准备台移到手术显微镜台，并放在加热垫上，并带有体温探头，用于体温维持。保持半拉尼在2-2.5%，氧气在0.8-1L/分钟。
4. 标记切口，从仅远端延伸到坐槽到膝盖的下部。这个标记应该比股骨差，并且离股骨倾斜。使切口与#15刀片切口通过底层二头肌女性筋膜。
5. 用海带或钝尖微剪刀仔细解剖二头肌，以二头肌女性为下的空间。
   注: 坐骨神经与最初切口大致相同。有三个分支，通常与耳膜神经后和常见的通骨和叶神经分别游离表面和深到膝盖。
6. 在识别常见的直肠 （CP） 神经后，使用一对微细尖钳子和微剪刀，小心地将 CP 神经从其他坐骨分支分离，并清除任何残留的结缔组织。
7. 在神经穿过膝盖表面的地方，用一把微剪刀尖锐地将神经横断。
   注意:使用锋利的剪刀在这一步中极为重要，因为对神经造成重大创伤可能会增加神经瘤形成的风险。
8. 小心地从CP神经中释放任何剩余的结缔组织，并密切工作，以释放神经约2厘米的长度。

4. C-RPNI 构造制造

1. 从盐水湿润纱布中取出肌肉移植物，并去除所有中央肌腱组织以及一小块中段。保持肌腱末端不变。
2. 使用 8-0尼龙缝合，确保CP神经的横端的外显膜到肌肉移植的区域，没有外皮，神经两侧有两个中断的缝合。
3. 用单6-0尼龙中断缝合，将肌肉移植到股骨上，与远离股骨的神经肌肉结连接一致。
   注意:固定肌肉，使其处于正常放松长度。尽量不要明显伸展肌肉或留下太多的松弛，当固定。
4. 放置一个8-0尼龙缝合在下级，中央边缘的肌肉移植，固定它到CP神经表膜的方式，以创造松弛的神经内的肌肉移植，并帮助缓解任何未来的紧张，它可能暴露与以后的气动。
5. 从盐水湿润纱布中取出皮肤移植物，并将其安排在肌肉移植上，以完全覆盖神经和大部分肌肉。确保真皮的深层位于肌肉上。修剪任何超出肌肉边界的皮肤。
6. 使用 8-0 将皮肤移植固定到肌肉移植周围尼龙中断缝合。通常，根据构造的大小，使用 4-8 个总缝合线。
7. 用5-0色谱缝合线在构造上关闭二头肌筋膜。
8. 关闭上覆的皮肤与4-0铬缝合在运行时尚。
9. 用酒精垫在手术区施以水泡，并涂抹抗生素药膏。
10. 停止吸入麻醉，让大鼠与从笼子伴侣分离的食物和水源中恢复。

结果

如果大鼠出现感染或无法经手术麻醉存活，构造制造被认为是不成功的。先前的研究表明，这些构造需要大约三个月的时间来重新血管化和再血管化^{2，3，17，36。}在三个月的恢复期之后，可以进行构造测试以检查可行性。三个月后的手术暴露将揭示血管化的肌肉和皮肤，如果?...

讨论

C-RPNI 是一种新颖的结构，它提供目标神经的运动信号同时放大，并提供一种可菲的感官反馈。特别是，C-RPNI对于近肢截肢患者具有独特的效用，因为他们的运动和感觉分节在手术过程中不易机械分离。相反，C-RPNI利用神经本身固有的优先再内生特性，鼓励感觉纤维再生到皮肤感觉末端器官和运动纤维到神经肌肉结。

由于C-RPNI制造依赖于目标神经的再内化能力，因此在手术过?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#15 Scalpel	Aspen Surgical, Inc	Ref 371115	Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15)
4-0 Chromic Suture	Ethicon	SKU# 1654G	P-3 Reverse Cutting Needle
5-0 Chromic Suture	Ethicon	SKU# 687G	P-3 Reverse Cutting Needle
6-0 Ethilon Suture	Ethicon	SKU# 697G	P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture)
8-0 Monofilament Suture	AROSurgical	T06A08N14-13	Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle
Experimental Rats	Envigo	F344-NH-sd	Rats are Fischer F344 Strain
Fluriso (Isofluorane)	VetOne	13985-528-40	Inhalational Anesthetic
Micro Motor High Speed Drill with Stone	Master Mechanic	Model 151369	Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones
Oxygen	Cryogenic Gases	UN1072	Standard medical grade oxygen canisters
Potassium Chloride	APP Pharmaceuticals	63323-965-20	Injectable form, 2 mEq/mL
Povidone Iodine USP	MediChoice	65517-0009-1	10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps
Puralube Vet Opthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Corneal protective ointment for use during procedure
Rimadyl (Caprofen)	Zoetis, Inc.	NADA# 141-199	Injectable form, 50 mg/mL
Stereo Microscope	Leica	Model M60	User can adjust magnification to their preference
Surgical Instruments	Fine Science Tools	Various	User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab
Triple Antibiotic Ointment	MediChoice	39892-0830-2	Ointment comes in sterile, disposable packets
VaporStick 3	Surgivet	V7015	Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister
Webcol Alcohol Prep	Coviden	Ref 6818	Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep