JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们提出了一种用于工程遗传编码的细胞内蛋白质传感器执行器的方案。该设备通过细胞内抗体 （intrabodies） 特异性检测靶蛋白，并通过开启基因转录输出来响应。构建了一个通用框架来快速替换内部组织，能够在不改变一般结构的情况下快速检测任何所需的蛋白质。

摘要

蛋白质可以作为病理状况的生物标志物，例如神经退行性疾病、感染或代谢综合征。对细胞进行工程改造以感知和响应这些生物标志物可能有助于理解病理背后的分子机制，以及开发新的基于细胞的疗法。虽然已经开发了几种检测细胞外蛋白的系统，但缺少一个可以轻松重新设计以感知不同细胞内蛋白的模块化框架。

在这里，我们描述了一种实现模块化遗传平台的方案，该平台可感知细胞内蛋白质并激活特定的细胞反应。该设备对细胞内抗体或小肽进行作，通过基于 TEV 蛋白酶 （TEVp） 的驱动模块，以高特异性感知目标蛋白质，触发输出基因的转录激活。TEVp 是一种选择性切割短同源肽的病毒蛋白酶，因其与切割位点的高度正交性而广泛用于生物技术和合成生物学。具体来说，我们设计了识别并响应病毒感染和遗传疾病的蛋白质生物标志物的设备，包括突变的亨廷顿蛋白、NS3 丝氨酸蛋白酶、Tat 和 Nef 蛋白，以分别检测亨廷顿病、丙型肝炎病毒 （HCV） 和人类免疫缺陷病毒 （HIV） 感染。重要的是，该系统可以根据所需的输入-输出功能结果进行手动定制，例如生物传感器的荧光读数、刺激抗原呈递以产生免疫反应或启动细胞凋亡以消除不健康的细胞。

引言

通过可控工程基因回路研究和调节细胞反应是合成生物学 1,2,3 的主要目标，用于开发在癌症 4、感染5、代谢疾病6 和免疫学7 中具有相关生物学或医学应用的前瞻性工具。

响应特定信号对细胞功能进行重编程需要设计智能接口，将细胞外或细胞内动态变化的传感（输入）与下游加工联系起来，触发特定输出，用于诊断目的（即报告基因）或重新连接细胞反应（治疗）。传感模块检测到的输入可以是小分析物8、蛋白质9、10、11 或 microRNA11、12、13，对疾病的发作或进展具有特异性。此外，可以通过多个输入信息处理实现复杂的电路调控，从而增加对转基因表达的严格控制，以响应定义的条件 14,15,16。例如，基于 microRNA 的传感器可以识别特定细胞类型，例如癌细胞，通过凋亡基因的表达诱导其清除13。由于 microRNA 很容易以模块化方式在合成电路中实现，因此它们代表了基因编码生物传感器的广泛使用的输入 12,13,17。蛋白质也是基因突变、癌症和感染的有效生物标志物，事实上已经报道了许多细胞外蛋白质传感装置18,19。

许多检测细胞外蛋白的回路依赖于工程受体的使用，这些受体将转录因子 （TF） 拴在膜上，并与 TEVp 反应性切割位点 （TCS） 融合。TEVp 的一个主要优点是切割的特异性和对内源性蛋白质加工的无干扰。在这些系统中，TEVp 与第二肽融合，该肽在细胞外分子结合时与工程受体相互作用。因此，外部输入诱导 TEVp 介导的切割和 TF 释放。与这种机制一起工作的系统是 Tango/TEVp18、光诱导20 和模块化细胞外传感器架构 （MESA）19。尽管在检测细胞外蛋白方面取得了进展，但以前从未实现过以模块化方式传感细胞内蛋白的技术，其局限性在于对响应特定蛋白质的单个设备要经历多次构建和测试迭代。

我们的系统是第一个用于细胞内蛋白质感应的平台21。通过使用定义靶标特异性的体内机构来保证模块化，而细胞重编程是 TEVp 介导的。具体来说，一个体内体膜结合并与荧光蛋白 mKate、TCS 和 TF（融合蛋白 1）的 C 端融合;第二个内部与 TEVp 融合并位于胞质溶胶（融合蛋白 2）中（图 1）。

因此，两个内部抗体与靶蛋白之间的相互作用发生在细胞质中，并导致 TEVp 切割 TCS，导致 TF 易位到细胞核以激活功能输出。传感驱动装置成功测试了四种细胞内疾病特异性蛋白：HCV 病毒表达的 NS3 丝氨酸蛋白酶22，HIV 感染的 Tat 和 Nef 蛋白 23,24，以及亨廷顿病的突变亨廷顿蛋白 （HTT）25。输出表达包括荧光报告基因、凋亡基因 （hBax）26 和免疫调节剂 （XCL-1）27。我们证明该系统还可以损害其靶标的病理功能。例如，Nef 反应装置通过隔离靶蛋白并恢复受感染 T 细胞上 HLA-I 受体的下调来干扰病毒感染的传播24。所描述的传感驱动平台是首个用于检测细胞内蛋白质的此类平台，可用于检测异常蛋白质表达、翻译后或表观遗传修饰，用于诊断和治疗目的20。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 传感器-执行器装置的构造和测试设计原则

  1. 选择目标蛋白。
    注意：我们为位于细胞质中或在细胞质和其他隔室之间穿梭的蛋白质设计了一个系统。
  2. 选择两个结合靶蛋白不同表位的内体。在我们的研究中，我们选择了已经开发并测试了内部抗体的蛋白质 28,29,30,31。当没有 intrabodies 时，它们应该是新开发的。
    注：内体的替代物可以是与目标蛋白质相互作用的其他分子。例如，Nef 传感装置包括一个体内 （sdAb19） 和 p59fyn 蛋白酪氨酸激酶32 的 SH3 结构域。
  3. 用计算机设计带有编码融合蛋白的 DNA 序列的质粒。
    注：用于质粒设计的软件可免费获得，也可以购买。
    1. 生成包括以下模块的序列：膜标签、荧光标记物（例如 mKate）、体内、 融合蛋白 1 的 TCS 和 TF，以及 融合蛋白 2 的体内和 TEVp。
      注：基于多个组分的相互作用构建新架构需要注意在检测到目标蛋白时可能最大化信号激活的参数。具体来说，我们专注于嵌合蛋白的 TEVp 活性和灵活性，以促进蛋白质-蛋白质相互作用（表 1）。所有这些功能都在以下几点中指定。
    2. 在体内 - TCS 和/或 TEVp - 体内之间插入一个灵活的甘氨酸-丝氨酸接头结构域 （LD）。LD 的长度可以是可变的（0、10 或 15 个氨基酸-AA）。
    3. 融合蛋白 1：设计包括高亲和力 TCS （S） 或低亲和力 TCS （L） 的变体，以调节 TEVp 切割活性。该构建体的表达由组成型启动子驱动。在 TCS 的 C 端包括 GAL4VP16 转录因子，以允许在 TEVp 切割时易位到细胞核。
      注意：我们使用了 hEF1a 启动子，但可以选择其他组成型启动子。
    4. 融合蛋白 2：使用组成型 （hEF1a） 或双氧树脂诱导型 （pTET） 启动子来调节 TEVp 转录。使用由小分子屏蔽调节的降解结构域 （DD） 来调节蛋白质稳定性。
      注意：可以选择其他调节蛋白质表达的诱导系统。
    5. 输出：将对转录因子有反应GAL4VP16报告基因置于 UAS 启动子下游。根据设备的应用（即荧光蛋白、细胞因子等）选择输出。
  4. 使用任何首选策略执行克隆。在这里，我们使用 Golden gate 或 Gateway 技术构建质粒。
  5. 通过瞬时转染在所需细胞系中测试设备的各种配置。用获得的融合蛋白 1 和 2 以及荧光报告基因（如 UAS-EYFP）质粒共转染细胞。融合蛋白 1 包括用作转染标记物的红色荧光蛋白 （mkate）。
    注：从易于转染的细胞系（如 HEK293FT 细胞）开始测试设备。
    1. 在 HEK293FT 细胞中转染。将 2 x 105 个细胞接种到装有 500 μL DMEM 的 24 孔板中。使用转染试剂用 300 ng 总 DNA 转染细胞，涡旋混合物并在室温下孵育 20 分钟。
      1. 将细胞置于 37 °C/5% CO2 培养箱中。转染后 24 小时加入新鲜培养基。
    2. 在 Jurkat 细胞中转染。在 500 μL RPMI 细胞培养基中使用 3 x 105 个细胞进行 24 孔板。按照制造商的说明进行电穿孔。每个样品使用 2-4 μg 总 DNA。转染后 24 小时加入 500 μL 新鲜细胞培养基。
      1. 在电穿孔过程中，将细胞和 DNA 混合物置于冰上。然后，将细胞置于 37 °C/5% CO2 培养箱中。
        注：可根据设备的具体应用选择不同的细胞系和转染方法。
  6. 获取显微镜图像以获得对设备功能的定性了解。通过检测细胞膜附近的荧光信号 （mkate） 来确认融合蛋白 1 的膜定位。在靶蛋白存在或不存在（阴性对照-NC）的情况下可视化荧光输出 （EYFP）。
    1. 使用配备 Tx Red 和 GFP 光立方的细胞成像系统检测 mKate 和 EYFP 荧光蛋白。使用 10 倍或 20 倍物镜。
      注：使用未转染的细胞以确保没有自发荧光。
  7. 使用流式细胞术 （FACS） 分析转染。
    注：样品制备参见方案 2。
    1. 在存在靶蛋白的情况下评估设备。创建一个实验基质，结合融合蛋白 1 和 2 的变体，用 （i） 组成型 hEf1a 启动子 （ii） 多西环素诱导型 TET 启动子和 （iii） 蛋白质稳定性屏蔽调节 TEVp。添加浓度为 （0-1000 nM） 的多西环素和盾牌。
    2. 进行 FACS 分析以比较有或没有目标蛋白的样品之间 EYFP 的倍数诱导。
      注：与 OFF（不存在靶蛋白）模式相比，最高倍数诱导对应于 ON（存在靶蛋白）模式下的最大输入灵敏度。
  8. 测试设备相对于所需应用程序的功能。
    1. 运行 FACS 分析以测量输出蛋白或细胞凋亡的水平，或其他相关分析。
    2. 如果设备的输出部分调节靶基因的表达水平，则进行 RT PCR 分析。计算关于管家基因（GAPDH 或等效物）的 2-ddCT ，并比较 ON 和 OFF 模式下输出表达的倍数变化。

2. 流式细胞术分析的样品制备

  1. 转染后 48 小时用流式细胞仪 （FACS） 对蛋白质装置进行定量分析。
    1. 吸出 DMEM 培养基并用 300 μL PBS 洗涤 HEK293FT 细胞。加入 100 μL 胰蛋白酶，在 37 °C/5% CO2 培养箱中放置 2-4 分钟。
      注：Jurkat 细胞不需要胰蛋白酶。
    2. 加入 400 μL 不含酚红的 DMEM 培养基，并重悬细胞以避免结块。在 FACS 管中转移。
    3. 使用配备 405、488 和 561 nm 激光器的流式细胞仪。
    4. 使用以下细胞仪设置从活细胞群中收集 30,000 – 100,000 个事件：用于 EYFP/EGFP 的 488 nm 激光和 530/30 nm 带通滤光片，用于 mKate 的 561 nm 激光和 610/20 nm 滤光片，以及用于 EBFP 的 405 nm 激光、450/50 滤光片。
      注：要设置流式细胞仪，请包括未转染的细胞和转染单一荧光蛋白的细胞。
    5. 使用首选软件（例如 DIVA 软件、Flowjo 或 TASBE33 方法）对收集的样品进行分析。

3. HCV 传感器-执行器设备的特性

  1. 选择用于检测 NS3 蛋白的 intrabodies。scFv35 和 scFv162 与两个不同的表位结合，因此被选中。
  2. 按照步骤 1.3 中描述的合理性设计和测试 NS3 响应装置的变体（例如，融合蛋白 1：膜标签、mKate、单链片段体内 scFv35、LD0、TCS-L 和 TF GAL4VP16;融合蛋白 2： 单链片段 body 内 scFv162 、 LD0 和 TEVp;输出：UAS-EYFP 或 UAS-hBax（细胞凋亡）;NS3（见 表 2））。
  3. 在 HEK293FT 细胞中测试构建体。
    注：对于每个实验，设置一个阴性对照，即在不存在目标蛋白质的情况下递送设备和输出定量。
    1. 在存在或不存在 NS3 的情况下，在组成型启动子下测试设备的 TEVp。如步骤 1.5.1 所述，在HEK293FT细胞中转染融合蛋白 1（步骤 1.3.3）、融合蛋白 2（步骤 1.3.4）和 EYFP 输出步骤 （1.3.5）。通过流式细胞术（方案 2）测量荧光报告基因 （EYFP），在转染后 48 小时分析样品。
    2. 使用 BFP-NS3 融合蛋白评估 mKate 和 BFP 共定位的体内 NS3 相互作用。使用包含 mKate 的融合蛋白 1 和 BFP-NS3 转染细胞。转染后 48 小时，在共聚焦显微镜（63 倍物镜）上观察细胞，以检测荧光蛋白的共定位。
      注：使用 BFP（未与 NS3 融合）作为阴性对照。在这种情况下，BFP 应显示弥漫性细胞定位，并且不应与膜结合的 mKate 共定位。
    3. 在存在或不存在 NS3 的情况下，在 pTET 启动子下测试设备的 TEVp。比较不存在和存在 NS3 的 EYFP。使用步骤 1.5.1 中描述的方案，将融合蛋白 1（步骤 1.3.3）、融合蛋白 2（步骤 1.3.4）和 EYFP 输出（步骤 1.3.5）与细胞共转染。在存在或不存在 NS3 的情况下进行转染。通过流式细胞术（方案 2）测量荧光报告基因 （EYFP），在转染后 48 小时分析样品。
  4. 由 NS3 设备驱动的测试细胞杀伤。
    1. 用凋亡基因 hBax 替换 EYFP 输出。
    2. 重复步骤 3.3.3。转染后 48 小时收集细胞，并在开始测定前用 PBS 洗涤。
    3. 使用与 Pacific Blue 偶联的 Annexin V 进行细胞凋亡测定。在室温下用结合缓冲液（1：20 体积比）稀释的凋亡标志物 Annexin V（与 2.5 μL Pacific Blue 偶联）对细胞进行染色 10 分钟。
    4. 通过流式细胞术分析细胞。计算种群内的细胞凋亡水平，即 Pacific-Blue （Annexin V） 阳性细胞的数量。

4. Nef 响应 HIV 传感器-执行器装置的表征

  1. 选择绑定到 Nef 的内部实体。选择单结构域体内 sdAb19 和 SH3，因为它们与不同的表位结合。
    注意：SH3 不是体内，而是 p59fyn 蛋白酪氨酸激酶的结构域，它在生理上与 Nef 相互作用。
  2. 按照步骤 1.3 中描述的合理性设计和测试 Nef 响应装置的变体（例如，融合蛋白 1：膜标签、mKate、sdAb19、LD0、TCS-L 和 GAL4-VP16;融合蛋白 2：SH3、LD0 和 TEVp;输出：UAS-EYFP;Nef（见 表 3））。
  3. 在 HEK293FT 和 Jurkat T 细胞中测试设备。
    注意：对于每个实验，我们设置一个阴性对照，即在不存在目标蛋白质的情况下递送装置并输出定量
    1. HEK293FT 的转染：在存在或不存在 Nef 的情况下，按照步骤 1.5.1 中描述的程序进行作。
    2. Jurkat T 细胞的转染：在存在或不存在 Nef 的情况下，遵循步骤 1.5.2 中描述的程序。
    3. 转染后 48 小时，按照方案 2 中的说明使用流式细胞仪分析样品。
  4. 用 HIV LAI 菌株感染 Jurkat 细胞以进行 HIV 检测。
    1. 在实验前至少 48 小时准备病毒原液。按照制造商的说明，使用从感染性分子克隆（NIH AIDS 试剂计划）和市售试剂转染 HEK-293T 细胞中获得的病毒。40 小时后，通过在 20% 蔗糖上超速离心 1 小时、64,074 x g、4°C 浓缩病毒，以避免病毒无颗粒蛋白。使用 HIV-1 p24 ELISA 测定病毒储液滴度。
    2. 用 500 ng p24 接种物用 HIV-1 菌株感染细胞。感染后 40 小时，通过用 KC57-FITC 偶联抗体检测病毒蛋白 p24 并进行流式细胞术分析，量化感染细胞的百分比。
    3. 用 AlexaFluor 647 偶联抗体克隆 W6/32 对细胞进行染色，抗 HLA-A、B、C。固定细胞并在流式细胞仪上分析。Nef 介导了 Jurkat T 细胞中 HLA-I 的下调，无论是否存在蛋白质传感器装置。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

模块化细胞内蛋白质检测的架构
如图 1 所示，该装置由以下部分组成：1） 体内 1 连接到膜栓系荧光标记物 （mKate） 和 TEVp 切割位点 （TCS），然后是转录激活剂 GAL4VP16 （TF）;2） 体内 2 与 TEV 蛋白酶 （TEVp） 融合，游离于胞质溶胶中;3） 对 GAL4VP16 有反应的合成启动子，驱动报告基因的表达。模块化由内部抗体保证，内部抗体可以即?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

直到最近，基于细胞内环境的细胞检测都是使用针对特定靶标从头开发的系统进行的。本方案描述了一个最新的细胞工程方法的实例，该方法用于在一个设备中进行蛋白质感应和驱动，该方法可以快速适应新的所需生物标志物。

这种开创性的系统感知细胞内蛋白质并提供特异性输出来检测或中和疾病。这类遗传电路的优点是体内提供的模块化，并且?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

致谢

这项工作得到了 Istituto Italiano di Tecnologia 的支持。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AlexaFluor 647 mouse anti-human HLA-A, B, C antibody clone W6/32Biolegend311414Antibodies
Annexin VLifeTechnologiesA35122Apoptosis marker
AttracteneQiagen301005Transfection reagent
BD Falcon Round-Bottom TubesBD Biosciences352053FACS tubes
DoxycyclineClonetech-Cell Culture: Drugs
Dulbecco's modified Eagle mediumCellgro10-013-CMCell Culture: Medium
Evos Cell Imaging SystemLife TechnologyEVOS M5000Imaging systems; Infectious molecular clones
FACSDiva8 softwareBD Biosciences659523FACS software
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR reaction
FBS (Fetal Bovin Serum)Atlanta BIOS11050Cell Culture: Medium
Gateway SystemLife Technologies-Plasmid Construction
Golden Gate Systemin-house-Plasmid Construction
HEK 293FTInvitrogenR70007Cell Culture: Cells
Infusion Cloning SystemClonetech638920Plasmid Construction
JetPRIME reagentPolyplus transfection114-15Transcfection reagent
Jurkat CellsATCCTIB-152Cell Culture: Cells
L-GlutamineSigma-AldrichG7513-100MLCell Culture: Medium
Lipofectamine LTX with Plus ReagentThermo Fisher Scientific15338030Transfection reagent
LSR Fortessa flow cytometer (405, 488, and 561 nm lasers)BD Biosciences649225Flow cytometer
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)ThermoFisher Scientific4346907qPCR reaction
Neon Transfection SystemLife TechnologiesMPK10025Transfection reagent
Non-essential amino acidsHyCloneSH3023801Cell Culture: Medium
Opti-MEM I reduced serum mediumLife Technologies31985070Transfection medium
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4458-100MLCell Culture: Medium
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205313Rev Transcriptase kit
RNeasy Mini KitQiagen74106RNA extraction kit
RPMI-1640ATCCATCC 30­2001Cell Culture: Medium
ShieldClonetech632189Cell Culture: Drugs
SpheroTech RCP-30-5-A beadsSpherotechRCP-30- 5A-2Compensation set up
StepOnePlus 7500 Fast machineApplied Biosystems4351106qPCR reaction

参考文献

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, Clifton, N.J. 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, New York, N.Y. 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , New York, N.Y. 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477(2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364(2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881(2018).
  22. Lin, C. HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232(2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448(2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852(2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93(2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, London, England : 1993. 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

TEV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。