佩尔维奇自主性甘利亚与雄性大鼠和雌性大鼠相关神经的解剖

摘要

主要的骨盆侧腹含有寄生和同情神经元，内含骨盆器官。在这里，我们描述了一个解剖方法，并提供图解图，以识别这些坏疽及其相关的神经。这些方法可应用于体内这些坏疽的实验操作或去除后检，供进一步研究。

摘要

双边主要骨盆侧腺（MPG;同义词、骨盆侧腹）是后刚体寄状和寄生神经元内侧啮齿动物骨盆器官的主要来源;人类的功能等效结构是低胃类的。主要的骨盆坏疽也提供了腰椎和腹腔感觉斧子到达骨盆器官的路线。这些复杂的混合性坏疽病可以证明是难以识别和解剖，以进一步实验研究正常的自主机制或建立疾病，损伤或内脏疼痛的临床前模型。在这里，我们描述了一个协议，以访问和可视化这些坏疽及其相关的神经道。我们为男性和女性大鼠提供原理图，因为性别之间的轮联大小和识别地标不同。该协议描述了为体外研究去除结群，但这种方法可以集成到手术恢复协议中，用于实验干预（例如神经挤压、神经切除）或绘制神经元回路图（例如，通过微注射神经跟踪器）。我们还演示了解剖后及其相关神经的主要结构，以及免疫组织化学染色之后。

引言

大鼠是骨盆器官生理学和解剖学研究中具有最佳特征的物种之一。虽然这些器官的描述存在极好的资源^1，2，它们通常不提供有关神经结构的信息，或者以不足的分辨率来指导实验研究。如下文所述，调节骨盆器官功能的自主性神经群的组织与自主神经系统的其他部分有很大不同，因此很难从可用于其他自主性神经性神经学信息中准确推断骨盆内侧特征。这种资源不足，以指导研究人员进入这一领域，可能减缓了对骨盆器官神经调节的研究。在这里，我们描述了进入神经系统的这个区域以进行进一步的体外研究或实验干预的协议。

双边主要骨盆性结体（MPG;同义词:骨盆性坏疽;宫颈性结腔[女性]）;弗兰肯赫瑟的侧结[女性]）是后刚体寄感和寄生神经元内化啮齿动物骨盆器官的主要来源;劣质低胃丛包括人类^{3、4、5、6}的等效神经元结构。来自腰椎和腹腔背根神经的感官投影也通过MPG到达骨盆器官。因此，了解MPG的神经回路和生物学对于临床前研究与骨盆器官发育和成人功能有关的无数临床条件至关重要。啮齿动物MPG的一些极好的描述已经发表^7，8，但我们的经验是，一般来说，这些描述并不总是提供足够的指导，以实际通知实验解剖或操纵这些结构时，需要恢复动物。此外，大多数MPG研究侧重于雄性大鼠。在雌性大鼠中，MPG 较小^9，具有明显的解剖地标，因此需要一个明显定制的可视化和解剖指南。

交感和寄生通路由他们的解剖学区分，特别是其前刚神经元的位置，与同情通路有前刚体神经元在胸椎脊髓和寄生前刚体神经元位于脑干（颅神经投影）和囊性脊髓。在自治系统的大多数其他区域，它们的目标神经神经元位于明显的寄感或寄生性神经。然而，MPG在混合同情性寄生性脊柱方面并不常见，因此在宏观尺度上，是胸椎和腹腔脊柱区域前刚连体斧子的收敛点。因此，我们在协议中包括了这些连接每个脊柱区域与MPG的主要神经道的位置和描述，促进实验分析或对这些神经成分的单独操作。我们还特别为读者指出，在啮齿动物中，脊柱前脊柱神经元是功能性囊性，例如，在排骨、排便和勃起期间是活跃的和必需的，位于脊柱水平 L6 - S1 ，而不是完全在食层部分^{10 ;}同样，L6和S1背根性神经质为骨盆器官提供主要的"囊性"感官输入。在啮齿动物中，来自更玫瑰色神经回路的感官和预旋输入集中在脊柱水平L1和L2^10。

在这里，我们描述了一个协议，以访问MPG及其相关的神经道在男性和女性大鼠，并支持它与原理图，以说明特定的地标。该协议指导手术访问这些结构在实验背景下去除组织进行体外研究，例如，分离MPG神经元的分子表征或初级培养。它也可以适应MPG去除后，心脏内灌注与固定，虽然这是一个更难的解剖，因为神经组织变得更加难以可视化时，相邻的组织没有血液。该协议也可以集成到手术环境中，用于这些神经通路的实验干预（例如神经切除、神经示踪剂的微注射）。这些类型的解剖对于生物电子医学的不断发展领域越来越重要，在那里，神经调节治疗骨盆内脏临床条件的新靶点和方法正在开发^中。我们首先为雄性大鼠提出完整的协议，然后复制专门为雌性大鼠定制的协议。

研究方案

所有程序均应根据动物实验的体制和供资机构要求进行。墨尔本大学动物伦理委员会批准了使用动物进行解剖和安乐死议定书（第1814639号议定书）。

注:此处所示的解剖对成年（约10周）雄性和雌性斯普拉格-道利大鼠（墨尔本大学生物医学科学动物设施）进行，体重280克（雌性）和350克（雄性）。在这些解剖之前，大鼠在_CO2室内安乐死4~5分钟。死亡后，MPG立即被解剖。如果从带有固定性转性血管灌注的动物处解剖组织，请采取预防措施保护操作员免受固定性接触，即在烟柜或下进柜进行解剖，并佩戴合适的个人防护设备。转体灌注协议已经详细公布了^12。

1. 主要骨盆结群和邻近神经:在雄性大鼠的进入和切除

注:图 1显示了雄性大鼠 MPG 可视化的解剖地标。

1. 进入腹腔和骨盆
   1. 将大鼠置于上部位置，并通过腹腔中切口进入腹部和骨盆，注意避免用毛皮污染手术场。
   2. 使用钳子或棉尖施用器将腹部器官轻轻移到一侧。注意前列腺和膀胱的腹叶位置。
   3. 将开创性的囊泡移到对侧。
   4. 切断血管延迟，以提供更好的进入覆盖黑帮的区域。
      注:从解剖的这一点开始，组织不得干燥;用生理盐水（用于新鲜组织解剖）或固定性（用于灌注固定动物）保持组织湿润。用盐水保持组织湿润不仅有利于组织结构，而且使解剖更容易，因为干燥的神经在操作过程中更加脆弱和撕裂更容易。
   5. 识别前列腺的背侧叶，其背面是侧骨的位置;这还不可见。
   6. 要可视化黑社会，请小心清除在黑帮附近和上覆的组织中。如有必要，使用缩回器保持解剖字段清晰。
   7. 取出附近的脂肪组织聚集体，并打开骨盆的侧筋膜。
2. MPG 及其相关神经的解剖
   1. 确定为解剖的下一步提供地标的以下位置:前列腺的方侧叶（侧轮位于此叶的表面，比开创性囊泡和前列腺）和开创性的囊泡（它们在中线收敛表示动物的rostrocaudal轴上的结群位置）。
   2. 根据这一点的要求，小心地去除任何阻碍神经结构完全视图的组织，避免对前列腺或主要血管的薄胶囊造成损害。
   3. 通过可视化以下地标和特征识别骨盆神经。
      1. 找到内部硅静脉及其细枝投射到MPG和膀胱。这种血管分支平行运行，有时嵌入骨盆神经中，然后穿过结群。
      2. 轻轻地将细尖角钳放在骨盆神经下，然后沿着钳子滑动，使其从周围组织中释放出来。
         注:也可以将骨盆神经与平行运行的小容器隔离开来，但对于大多数类型的实验来说，这并非必不可少。确认结构是骨盆神经，通过在高放大倍率下观察，以确定神经包含几个松散聚合的筋骨，这些筋骨很容易在解剖显微镜下区分，并且是骨盆的特征神经，因为没有其他的主要神经与黑帮显示这种明确的裂射。
   4. 通过可视化以下地标和特征，识别洞穴神经。
      1. 跟随骨盆神经到其与黑骨的交界处后，跟随洞穴神经穿过前列腺，然后向阴茎的洞穴状身体弯曲。
      2. 如果显微镜放大允许，请注意，有一小群细腻的神经从骨盆和洞穴神经之间的结群中浮现出来;这些是直肠神经，传播到下肠。
   5. 通过可视化以下地标和特征识别低胃神经。
      1. 在与输尿管一起旅行后，确定低胃神经在颅边与神经结群的加入位置。
      2. 确认低胃神经比骨盆或洞穴神经薄得多，并且不伴有大型血管。
   6. 通过可视化以下功能识别 MPG。
      1. 可视化轮背、背和颅边，形成三角形。
      2. 确认每个主要神经的位置:从神经结核的背边冒出的骨盆神经，在黑帮最牛角的洞穴神经，来自其颅边缘的低胃神经，以及从黑帮的从小神经中浮现的附属神经通风边缘。
   7. 通过可视化以下地标和功能，识别附件神经。
      1. 清除组织以可视化结孔的腹缘后，确定向泌尿道和生殖道投射的神经团。
      2. 如果显微镜放大允许，识别一个在前列腺和一个玫瑰体组之间的前列腺和膀胱之间的神经的锥状组。
3. 去除MPG及其相关神经
   1. 轻轻地在结群和下部前列腺之间滑动钳子，小心不要刺穿前列腺的薄胶囊。破坏黑帮和前列腺之间的任何联系。
   2. 清除实验所需的神经长度与周围组织的任何最终连接，然后切断每个神经。
   3. 使用细钳子，将神经的结群移动到实验的适当溶液中，并确认每个主神经都完好无损。

2. 主要骨盆结群和邻近神经:雌性大鼠的进入和切除

注:图 2显示了母鼠 MPG 可视化的解剖地标。

1. 进入腹腔和骨盆
   1. 将大鼠置于上部位置，并通过腹腔中切口进入腹部和骨盆，注意避免用毛皮污染手术场。
      注:从解剖的这一点开始，组织不得干燥;用生理盐水（用于新鲜组织解剖）或固定性（用于灌注固定动物）保持组织湿润。
   2. 使用钳子或棉尖施用器将腹部器官轻轻移到一侧。注意子宫角、膀胱和直肠的位置。
   3. 切开卵巢和子宫容器，并收回子宫角。
   4. 进入盘骨空间，轻轻清除位于子宫颈附近的脂肪组织聚集物。
2. MPG 及其相关神经的解剖
   1. 识别子宫颈的侧壁，只需与子宫角交界处;该区域是定义动物的rostrocaudal轴上的MPG位置的主要地标。
   2. 根据这一点的要求，小心地去除任何阻碍神经结构完全视图的组织，避免对主要血管的损害。
   3. 通过可视化以下地标和特征识别骨盆神经。
      1. 找到内部硅静脉及其细枝投射到MPG和膀胱。这个分支平行运行，有时嵌入骨盆神经中，然后穿过结群。
      2. 确认结构是骨盆神经，通过在高放大倍率下观察，以确定神经包含几个松散聚合的筋骨，这些筋骨很容易在解剖显微镜下区分，并且是骨盆的特征神经，因为没有其他的主要神经与黑帮显示这种明确的裂射。
   4. 通过可视化以下地标和特征识别低胃神经。
      1. 在与输尿管一起旅行后，确定低胃神经在颅边与神经结群的加入位置。
      2. 确认低胃神经比骨盆或洞穴神经薄得多，并且不伴有大型血管。
   5. 通过可视化以下地标和特征，识别洞穴神经。
      1. 跟随骨盆神经到其与黑狮的交界处后，跟随洞穴神经，沿着子宫颈的侧壁向阴道移动。
      2. 如果显微镜放大允许，请注意，有一小群细腻的神经从骨盆和洞穴神经之间的结群中浮现出来;这些是直肠神经，传播到下肠。
   6. 通过可视化以下地标和功能，识别附件神经。
      注:附件神经很难看到，但从MPG的中段方面投影。清除组织以可视化结孔的腹缘后，确定一组非常细腻的神经，这些神经投射到泌尿道和生殖道上。
   7. 通过可视化以下功能识别 MPG。
      1. 可视化轮背的腹腔、背和颅边，形成三角形。
      2. 确认每个主要神经的位置:从神经结核的背边冒出的骨盆神经，在黑帮最牛角的洞穴神经，来自其颅边缘的低胃神经，以及从黑帮的从小神经中浮现的附属神经通风边缘。
3. 去除MPG及其相关神经
   1. 轻轻地将细尖角钳放在骨盆神经下，然后沿着钳子滑动，使其从基础子宫颈和周围组织中释放出来。
      注:也可以将骨盆神经与平行运行的小容器隔离开来，但对于大多数类型的实验来说，这并非必不可少。如果演示解剖，在骨盆神经下放置缝合线，以方便其可视化。
   2. 重复这个过程为洞穴神经，然后低胃神经，最后配件神经。
   3. 轻轻地滑动钳子之间的结群和潜在的子宫颈。破坏黑恶势力和子宫颈之间的任何联系。
   4. 清除实验所需的神经长度与周围组织的任何最终连接，然后切断每个神经。
   5. 使用细钳子，将神经的结群移动到实验的适当溶液中，并确认每个主神经都完好无损。

3. 确认共性成分（可选）

1. 去除结核后，浸入常规组织固定（例如，4%缓冲形式内）至少1小时，用0.1M磷酸盐缓冲液洗出固定剂和过程组织低温切除和荧光免疫组织化学，如前所述^13。
   注:许多专门识别这三种神经标记的高质量抗体在商业上可用。有关图 3所示的标签的试剂，请参阅材料表。
2. 或者，使用上述类似方法进行免疫组织化学的工艺坏疽（整体），但将抗体的孵育时间增加到4天（原抗体）和2天（继发抗体）。
3. 为了证明主要人群的感官斧子，使用抗体对抗钙化蛋白基因相关肽（CGRP）。
   注:本研究中使用的抗体建议稀释时间为1:5，000。
4. 为了证明神经质致感神经元，使用抗体对抗酪氨酸羟基酶（TH）。
   注:本研究中使用的抗体建议稀释时间为1:5，000。
5. 为了证明胆碱能神经元的主要种群，使用抗体对抗神经元一氧化氮合成酶（NOS）。
   注:本研究中使用的抗体建议稀释时间为1:500。

结果

成功的解剖不仅将MPG的完整主体完整地去除，而且还将保留仍然连接的每个主要神经的第一段。这些神经是体内神经定向的宝贵指标，因此为许多类型的解剖研究（例如，绘制实验扰动后表达模式或细胞变化图）提供了基本信息。虽然保存相关的神经对于某些实验类型（例如，分离分离分离分离分离）而言可能不太重要，但神经的存在也提供了一种在不接触的情况下处理结群的方法（并且可能破坏）神经元细胞体。

不成功的解剖将有一个不完整或损坏的坏疽，或主神经不再连接。在解剖过程中，坏疽或神经也可能在不知不觉中受损，要么是因为物理损伤太微妙，无法在解剖显微镜下检测到，要么是因为损伤仅在某些类型的检测过程中才显现出来。例如，如果结节组织在解剖过程中变干，组织在以后处理过程中可能正常，但表面将显示高水平的非特异性荧光。

图3中显示了解剖MPG的例子，它提供了整个MPG被可视化为整体厚度的完整结核的示例（图3A），以及一个MPG，后者已被冷冻切除，用于执行免疫荧光，以证明无核神经和胆碱能神经元（图3B，C）。

图1:雄性大鼠MPG可视化的解剖地标。1、开创性囊泡;2、膀胱;3、凝固腺体;4和5，附件神经;6、前列腺（瓣叶）;7、洞穴神经;8、瓦斯递延;9、尿道;10、球形肌肉;11、心肌;12、直肠神经;13、绑架者考达·特特努斯;14、主要骨盆结群;15、骨盆神经;16、绑架者考达拘留;17、低胃神经;18、内静脉;19、柔韧性高胸;20、柔韧性师考达龙;21、输尿管;22、普索斯少校;23、腹部大田;24，劣质的维娜卡瓦。请点击此处查看此图形的较大版本。

图2:雌性大鼠MPG可视化的解剖地标。1、远端结肠;2、膀胱;3、子宫体;4、胃神经下垂;5、附件神经;6、主要骨盆结群;7、洞穴神经;8、阴道;9、尿道;10、直肠;11、绑架者考达·特特努斯;12、直肠神经;13、柔韧性高胸;14、骨盆神经;15、内静脉;16、绑架者考达拘留;17、柔韧性师考达龙古斯;18、外动脉;19、输尿管;20、普索斯少校;21，子宫角;22，腹部大田。请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:从成年雄性大鼠身上贴上MPG的免疫组化学标签。所有准备工作均采用配备单色摄像机的传统宽场荧光显微镜进行可视化，然后进行数字着色。（A） 全山（完全厚度），固定MPG与相关神经，免疫组织化学标记的感官神经，表达钙素基因相关的肽 （CGRP）;1、骨盆神经（显示多筋骨）;2、洞穴神经;3、胃神经下垂;4、附件神经;5、直肠神经;6、主要骨盆结群（MPG）。（B， C）固定MPG的冷冻科（14μm），免疫组织化学标记，以证明共和子核素的混合神经质;（B） 由酪氨酸羟基酶抗体证明的诺拉德神经神经元和（C）由神经元一氧化氮合成酶抗体的胆碱能神经元的主要种群。校准条表示 （A） 1，000 μm， （B， C） 200 μm.请点击这里查看此图形的较大版本.

讨论

骨盆器官的神经控制由复杂的通路进行调节，包括躯体、寄生、寄感和内脏感觉成分^{14、15、16、17。}这些途径大多源自或通过 MPG。此处概述的解剖协议介绍了 MPG 解剖学、相关神经和附近的宏观解剖地标;后者用解剖原理图加以说明。其他MPG解剖方法也可能成功，但我们发现这里描述的方法非常健壮，适合神经系统这一领域的研究人员。

该协议最关键的方面是正确识别每个主要神经和完全切除MPG组织。通过仔细观察和处理组织，MPG组织可以去除解剖学，分子和电生理学体外研究18，19，20，21，22。该协议也可以适应体内实验操作23，24，25，指出在这种情况下，必须非常小心，以尽量减少接触与结群相关的主要神经或损害附近的血管。如果实验需要选择性脱硝，通过中断一个或多个神经，建议对被切断的神经进行隔离，以防止重新受压和分析。这个解剖协议也可用于鼠标，其中也有一个MPG具有类似的功能^{26，27，28。}

在神经解剖学研究中，通过解剖麻醉动物的MPG，通过与实验相适应的组织固定性进行对照，对抗原和组织结构进行最佳^保存;然而，在这个过程中，由于组织着色丢失，识别结群和神经结构更加困难。建议在灌注后尝试这种解剖之前，要熟练地识别和解剖未渗透动物的结核。同样，建议首先精通雄性解剖，因为对于年龄和体型相当的动物，MPG及其相关神经在雌性中要小得多。

为了验证所切除的组织是否确实是MPG，研究人员首先建议检查每个主神经的位置和特征。许多分离发现骨盆神经和洞穴神经最容易就地识别;低胃神经和附属神经更细腻，更难与周围组织区分。如果这些神经由于解剖过程中的问题而不再可用，或者其结构存在不确定性，建议使用常规组织学（确认神经元细胞体⁸的存在）和免疫组织化学（确定胆碱能和神经核酸神经元均存在30、31）（图3）。为了验证对主要神经的正确识别，洞穴神经很容易被其初始部分的神经元细胞体的高密度识别到MPG附近;这些神经元大多表示胆碱能、神经球神经元^{的标记32、33。}骨盆、下胃和辅助神经很少有神经元细胞体^34。

执行此解剖时有几个常见的陷阱。如果新手部门在找到任何主要神经或MPG时遇到问题，则鼓励他们回到描述关键地标的步骤。人们通常如此专注于寻找微观结构，以至于人们失去了对宏观背景的跟踪。最常见的情况是，新手在解剖部位移动得太远，或者保持过于"表面"，即离腹部腹腔开口太近，而不是检查更深的（即更背）的结构。解剖过程中的一个常见问题是解剖过程中血管损伤。如果出血开始，轻轻地将棉尖施用器放在源上，直到出血停止，然后用盐水自由冲洗区域，然后再重新开始解剖。如果被过多的血液污染，或者解剖延迟太久，等待出血停止，MPG 可能无法用于实验。另一个常见的解剖误差是前列腺胶囊受损，这严重损害了MPG的可视化和去除。这种胶囊是一个非常微妙的结构，很容易刺穿，同时从前列腺的侧壁去除脂肪，即使只使用棉尖施用器。最后，在识别每个神经，然后在去除MPG的过程中，与MPG相关的主要神经很容易受损。鼓励各部门制定一种程序，即依次按特定顺序隔离每个神经，以便在清除黑帮的最后步骤中减少混淆的机会。

这种解剖没有试图追查每个从紧神经的成分到特定的器官，或识别每个位于骨盆刚利亚和骨盆器官^之间的不同点。如果不使用特定的污渍，这些在体内很难可视化;然而，它们可以通过跟随每个神经道向器官，并利用特定的神经污渍后，确定结群位置去除。与MPG相比，这些微冈利亚虽然只占神经元群的一小部分，但可能为它们最密切的器官提供特定类型的输入。我们注意到该领域的一个局限性，即这些微甘利亚和许多小神经道都未离开MPG前往骨盆器官，但名称还被广泛接受。此外，尚未对雌性大鼠进行同样详细的微甘利亚研究。

综上所述，此处提供的协议和原理图为研究人员提供了工具，用于研究为骨盆器官提供自主神经供应的主要结构，以及来自腰腔背根的感官神经的主要外围通道通过MPG旅行到骨盆器官的坏疽。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091	Merck	C8198
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937	Invitrogen	61-7000
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443	Jackson	711-165-152
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204	Millipore	AB152
Dissecting microscope	Olympus	SZ40, SC
Dumont AA epoxy coated forceps	Fine Science Tools	11210-10
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #5/45 curved forceps	Fine Science Tools	11251-35
LED light source	Schott	KL 1600
Micro-Adson forceps	Fine Science Tools	11019-12
Student Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Surgical scissors	Fine Science Tools	14054-13