解剖、免疫组织化学和幼虫和成年 果蝇 脑的安装用于视叶可视化

摘要

该协议描述了准备幼虫和成年 果蝇 视叶进行成像的三个步骤:1）脑解剖，2）免疫组织化学和3）安装。重点放在第 3 步，因为需要不同的安装方向来可视化特定的光学瓣结构。

摘要

果蝇视叶由四个神经细胞组成:叶片、髓质、小叶和小叶板，是探索产生神经多样性和驱动电路组装的发育机制的优秀模型系统。鉴于其复杂的三维组织，对视叶的分析要求人们了解其成年神经细胞和幼虫祖细胞如何相对于彼此以及中央大脑的位置。在这里，我们描述了一种用于解剖，免疫染色和幼虫和成虫脑的安装以进行视叶成像的方案。特别强调安装方向与视瓣空间组织之间的关系。我们描述了幼虫的三种安装策略（前、后和外侧）和成虫的三种安装策略（前、后和水平），每一种都为不同的视叶结构提供了理想的成像角度。

引言

果蝇视觉系统由复眼和下面的视叶组成，是研究神经回路发育和功能的优秀模型。近年来，特别是视叶已成为一个强大的系统，用于研究神经发育过程，如神经发生和电路布线 1,2,3,4,5,6,7,8。它由四个神经纤维组成:椎板、髓质、小叶和小叶板（后两者包括小叶复合体）1,2,3,4,5,6。来自眼睛的光感受器以椎板和髓质的神经元为目标，这些神经元处理视觉输入并将其中继到小叶复合体的神经细胞^1,2,3,4,5,6。小叶复合体中的投射神经元随后将视觉信息发送到中央大脑中的高阶处理中心^1,5,9。视叶的复杂组织，由于需要维持视网膜结构和处理不同类型的视觉刺激，使其成为研究复杂神经回路如何组装的有吸引力的系统。值得注意的是，髓质在组织和发育方面与神经视网膜有着惊人的相似之处，神经视网膜长期以来一直是脊椎动物神经回路发育的模型 ^3,8。

视叶发育在胚胎发生过程中开始，规格为 ~35 个外胚层细胞，形成视斑块 2,4,5,6,7,8。幼虫孵化后，视基板被细分为两个不同的原基:1）外部增殖中心（OPC），产生层和外髓质的神经元，2）内部增殖中心（IPC），产生内髓质和小叶复合体的神经元4,5,6,10 .在二龄后期幼虫中，OPC和IPC的神经上皮细胞开始转化为神经母细胞，随后通过中间神经节^{母细胞产生}神经元4,5,11,12。视叶神经母细胞由空间和时间限制的转录因子组成，这些转录因子共同作用在其后代中产生神经多样性 11,12,13,14。在蛹中，视叶神经细胞的回路通过几个过程的协调组装，包括程序性细胞死亡^11,15、神经元迁移^12,16、轴突/树突靶向^10,17、突触形成^18,19 和神经桩旋转^10,17。

在这里，我们描述了解剖幼虫和成虫大脑、免疫染色和封片以对视叶进行成像的方法。鉴于其复杂的三维组织，对视叶的分析要求人们了解其成年神经细胞和幼虫祖细胞如何相对于彼此以及中央大脑的位置。因此，我们特别强调了安装方向与光瓣结构的空间组织之间的关系。我们描述了幼虫大脑的三种安装策略（前、后和外侧）和成虫大脑的三种安装策略（前、后和水平），每一种都为特定视叶祖细胞群或神经细胞的成像提供了最佳角度。

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研究方案

1. 为共聚焦成像准备幼虫大脑

1. 夹层
   注意:在开始解剖之前，准备固定物（磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的 4% 甲醛）和 PBT（PBS 中 0.1-0.3% Triton）溶液。在解剖过程中，应将固定溶液置于冰上。尽管该协议中使用了多聚甲醛（PFA）固定剂，但已经描述了针对特定表位的替代固定策略（使用PLP²⁰ 或PEM²¹）。对于幼虫解剖，需要两对镊子（Dumont #5 或 #55s）。有关详细信息，请参阅材料表。
   1. 首先用 400 μL 1x PBS 填充解剖皿的每个孔。用一把镊子轻轻地挑选在小瓶内侧爬行的流浪的三龄幼虫。将幼虫放入填充PBS的培养皿的第一个孔中。
   2. 取一只幼虫，将其转移到中间孔中。用非惯用手将幼虫的身体压在井的底部。
   3. 用惯用的手轻轻抓住幼虫嘴钩，将幼虫嘴钩从身体上拉开。幼虫的大脑应附着在口钩和其他附属组织上，当组织被拉开时，它们会脱落。
   4. 取出辅助假想盘，将幼虫脑转移到解剖皿的第三个孔中。假想盘是幼虫大脑周围的上皮组织，它们产生成虫结构，如触角、眼睛、腿和翅膀²⁰。如果留在组织上，假想盘可能会阻碍幼虫脑的适当免疫染色。
      1. 要切除假想的椎间盘，请使用一把镊子通过腹侧神经索牢牢地夹住大脑。使用另一把镊子，轻轻地拔掉椎间盘。
      2. 小心地取下眼盘，因为它包裹在脑叶的表面。要移除眼盘，请使用一把镊子将大脑靠在培养皿底部。不要通过腹侧神经索握住大脑，而是用镊子轻轻抓住脑叶，注意不要挤压脑叶。使用另一把镊子轻轻拉开眼盘。
         注意:眼睛假想盘最终会产生视网膜的光感受器。对于那些对研究视网膜和视叶之间的神经连接感兴趣的人来说，可以将眼盘留在大脑上。但是，对于那些只对视叶结构感兴趣的人，建议移除眼盘，因为它可能会由于其位于大脑表面而影响图像质量。
   5. 重复步骤 1.1.2\u20121.1.4，直到收集了足够数量的大脑（或经过 30 分钟的解剖时间）。解剖时间不应超过 30 分钟，以确保组织的完整性不受损害。
   6. 解剖期结束后，使用 P200 移液器小心地从第三个孔中取出 PBS。确保孔中保留少量液体，以保持大脑浸入水中。
      注意:在协议的所有点上保持大脑浸入液体中至关重要。如果组织变干，则共聚焦图像中不需要的自发荧光可能会影响染色剂的质量。
   7. 将 500 μL 冷固定溶液加入第三个孔中。用一把镊子轻轻搅拌液体，让大脑在培养皿中旋转。用载玻片盖住培养皿，并将其放在冰上30分钟，以便组织固定。
   8. 取出固定液，用 400 μL PBT 洗脑，5 次。
      注意:Triton 是 PBT 中的一种洗涤剂，可防止大脑相互粘附或粘在培养皿上，并使组织为最佳抗体渗透做好准备。
2. 免疫组化
   注:发育研究杂交瘤库 （DSHB） 提供几种一抗，可用于标记特定的视叶结构或细胞类型。DE-Cadherin 标记 IPC 和 OPC 神经上皮细胞，Bruchpilot （Brp） 标记发育中的神经细胞，腊肠犬标记层和小叶神经元（以及髓质神经元的一小部分）。此外，Elav 可用于标记神经元，Prospero 可用于标记神经节母细胞，Repo 可用于识别神经胶质细胞。
   1. 通过将抗体添加到 PBT 中来制备一抗溶液，总体积可达 100 μL。封闭剂（10% 正常山羊血清）可用于防止一抗与组织之间的非特异性结合 20,22,23。该协议中使用的抗体特异性标记脑组织，无需封闭剂。
   2. 取出最后的固定后洗涤液，加入一抗溶液。在添加抗体溶液之前，请确保孔中只有少量 PBT。加入溶液后，用镊子轻轻搅拌大脑 5-10 次。用载玻片覆盖，用实验室薄膜密封，并在4°C下孵育过夜。
      1. 或者，如果有冷藏轨道振荡器，将培养皿放在振荡器上以优化过夜孵育。
         注:一抗孵育和所有后续步骤均可在 1.5 mL 微量离心管中进行。一级和二级孵育的体积可以保持 100 μL，但洗涤步骤应使用 800 μL 或更多的 PBT 进行。
   3. 孵育后，按照上一节的步骤 1.1.8 用 PBT 洗出一抗。
      注意:一抗溶液应保存并储存在4°C，因为它可以重复用于后续实验。许多一抗最多可以重复使用四次。
   4. 将 400 μL PBT 加入大脑进行最终清洗。用载玻片盖住培养皿，用实验室薄膜密封，并将其置于轨道振荡器上，以低速（100rpm）和室温（RT）~4小时。
      注意:可以在此处暂停协议。大脑可以在4°C下洗涤2-3天。
   5. 制备总体积为 100 μL 的二抗溶液。
      注意:在本协议中，所有二抗均以 1:500 的稀释度使用，不含封闭剂。
   6. 从孔中取出 PBT 洗涤液，加入二抗溶液。使用一把镊子将组织混合在溶液中。用载玻片和实验室薄膜盖住培养皿。将培养皿在室温下放在轨道振荡器上，至少孵育期为2小时。由于二抗含有光敏荧光团，因此请用铝箔覆盖培养皿。
      注意:可以在此处暂停协议。可以将脑留在4°C的二抗溶液中过夜。
   7. 按照步骤 1.2.3 中所述洗掉二抗。将 400 μL PBT 加入大脑进行最终清洗。用载玻片盖住培养皿，用实验室薄膜和箔纸密封。将大脑在室温下放在振荡器上4小时。
      注意:可以在此处暂停协议。大脑可以在4°C下洗涤2-3天。
3. 安装
   1. 取出最后的 PBT 洗涤液，用两滴荧光安全封固剂替换。将一滴安装介质滴在载玻片的中心。
   2. 使用镊子将大脑从井中转移到载玻片上的液滴上。为避免损伤视叶，大脑可以由腹侧神经索固定，同时转移到载玻片上。
   3. 按照以下的安装策略安装大脑（图1A）。
      1. 前侧朝上
         注意:对于那些对可视化延髓前部、椎板或小叶塞感兴趣的人，这种安装方向是理想的。区分前缘和后部坐骑的最佳方法是检查腹侧神经索相对于脑叶的位置。
         1. 使用前方位观察腹侧神经索在叶上伸出（图1B）。
      2. 后面朝上
         注意:对于那些对可视化 OPC （pOPC） 或 IPC ^10,11 的后尖端感兴趣的人，建议使用此方向。
         1. 使用后向，观察从脑叶下方伸出的腹侧神经索（图1C）。
      3. 侧视图
         注:横向安装方向用于在单个平面内可视化背腹轴和前后轴中的层，髓质或小叶塞神经元的新月形（图1G）。
         1. 对于侧向安装，将脑叶彼此分开，平坦地侧放，椎板和小叶塞朝上。
         2. 使用两对锋利的镊子，将腹侧神经索分成两半，从脊髓连接到肺叶的地方开始。请注意，两个叶已经彼此分开，腹侧神经索保持它们完好无损。因此，将腹侧神经索从叶之间的裂隙点向下分裂，以将它们分开。然后将每个脑叶和连接的腹侧神经索翻转在它们的两侧，使外侧表面朝上。
            注意: 对于侧视图安装，建议使用带有细尖端的钨针来定向脑叶的侧面。为了在安装时清楚地看到叶的方向和腹侧神经索的方向，可以调节显微镜的照明。如果使用鹅颈 LED 光源，鹅颈管应平行于载玻片表面放置，以获得清晰的可见性。此外，可以增加或减少照明强度，以增强大脑结构之间的对比度，并在安装时提供清晰度。
   4. 将一小滴 PBS 滴在含有大脑的封固剂的两侧。在每滴上滴上一个盖玻片，最后将一个盖玻片盖在大脑上。顶部盖玻片的左右边缘应位于另外两个盖玻片上（图1A）。
      注意:在将盖玻片放在大脑上之前，必须建造一座桥。幼虫脑的厚度约为200μm，因此，为了保持组织的完整性，会创建一个桥，该桥增加了盖玻片和载玻片表面之间的距离。
   5. 用指甲油密封牙桥的边缘，以固定安装的大脑。
   6. 使用共聚焦显微镜对大脑进行成像。

2. 为成人大脑进行共聚焦成像的准备

1. 夹层
   注意:成人脑解剖比幼虫脑更具挑战性，需要小心处理。强烈建议至少使用一对超细镊子（Dumont #55）用于协议的这一部分。
   1. 使用针头或飞垫用 CO 2 麻醉苍蝇，并将它们放在实验室擦拭物或冰上的纸巾上（以保持它们麻醉）。
   2. 将 400 μL PBS 添加到玻璃皿的所有三个孔中。用一把镊子轻轻地抓住一只成年苍蝇的翅膀，将其放入培养皿的第一个孔中。
   3. 用非惯用手握住一副镊子，将苍蝇的胸部靠在井底上。用惯用的手，轻轻地将头部从身体其他部位拉下。
   4. 将头部转移到第二个孔中。通常，头部会漂浮在 PBS 中，并且可能难以处理。用一把镊子通过长鼻将其压在井的底部。
   5. 用两把镊子撕掉眼睛之间的角质层区域。由于大脑位于角质层的正下方，因此请尽可能轻柔，以防止损坏下层组织。继续一次剥去一块角质层，直到大脑暴露在外。切除任何可能仍附着在大脑上的附属组织（即视网膜、气管、气囊）。
      注意:在以前的协议^22,24 中已经描述了视网膜的切除，但层也可以与视叶的其余部分分离。这对于那些想要研究延髓或小叶复合体的人来说很有用，因为椎板位于表面，在成像时可能会阻碍这些其他视叶神经纤毛的可视化。要去除椎板，请使用一把锋利的镊子轻轻拉动椎板和延髓神经纤毛之间的凹痕。椎板将慢慢开始从髓质上剥落。重复此动作，直到整个层被移除。在这个过程中，保持对大脑的牢牢控制是很重要的。使用另一把镊子将大脑靠在培养皿的底部，将其定位，使中枢大脑的顶部和底部完全贴合在镊子的尖端之间。牢牢握住中脑可以防止对视叶造成不必要的损伤。
   6. 将干净的大脑转移到第三口井中。重复步骤 2.1.2\u20122.1.6，直到获得足够数量的脑或经过 30 分钟的最长解剖期。
   7. 在第三个孔中取出 PBS，加入 500 μL 固定溶液。确保大脑在这里或任何洗涤步骤中都不会变干，因为这会导致共聚焦图像中的背景荧光。用载玻片盖住培养皿，让大脑在室温下固定孵育20分钟。
   8. 固定后，用 400 μL PBT 清洗大脑，5 次。
      注意:可以在此处暂停协议。可以用载玻片和实验室薄膜覆盖大脑，并在4°C下洗涤2-3天。 对于刚接触该系统的研究人员来说，在固定之前和期间将辅助组织留在大脑上可能更容易。这将使研究人员能够在给定的解剖期间最大限度地提高获得的大脑样本数量。在组织被固定和洗涤后，可以仔细清洁大脑，然后再加入一抗溶液。带有附属组织的成人大脑往往会漂浮，因此有干涸的风险。因此，建议在加入固定溶液时，使用一把镊子小心地将所有大脑汇集到培养皿的中心，并在固定后立即清洁大脑。
2. 免疫组化
   1. 按照第 1.2 节中对幼虫大脑的描述进行免疫组织化学。
   2. DSHB 的有用一抗包括第 1.2 节中幼虫免疫组织化学方案中提到的那些。有关抗体和相应稀释度的完整列表，请参阅 材料表 。
      注意:在成人大脑的洗涤步骤中必须格外小心，因为它们可能会漂浮到洗涤溶液的表面，并在去除溶液时有在孔两侧变干的风险（这将导致背景荧光）。一个好的做法是一只手握住移液器以添加或吸走液体，另一只手握住一把镊子以保持大脑浸没。
3. 安装
   1. 在安装步骤之前，使用 PBS（而不是 PBT）进行最终清洗。PBS 使大脑变得略微粘稠，这使它们在安装过程中能够保持在所需的方向。
   2. 取出最后的洗涤剂，用三滴荧光安全封固剂替换。将一滴安装介质放在显微镜载玻片的中心。
   3. 使用镊子将大脑从井中转移到载玻片上的液滴上。为避免损坏视叶并防止组织变干，请小心地通过毛细血管作用取出大脑。慢慢地将一对镊子夹在大脑周围，直到在尖端之间抽出一小体积含有大脑的液体。
      注意:将大脑转移到载玻片上时，请注意不要关闭镊子，因为这会损坏大脑。或者，可以使用P200移液器转移大脑。切掉吸头的末端以扩大开口，并用 PBT 预冲洗，以防止大脑粘在吸头内侧。
   4. 按照以下策略安装大脑（图2A）。
      1. 前侧朝上
         注意:要可视化椎板和髓质神经元，请将大脑前侧朝上定向（图2B）。这可以通过检查中央触角叶的解剖结构和曲率来实现。
         1. 用一把镊子轻轻地将大脑侧转动，以检查前侧和后侧。观察到，在前侧，大脑的曲率明显，触角叶从中心略微向外突出。
      2. 后面朝上
         1. 将大脑置于后部（平坦）面朝上，触角叶朝下（图2C）。
            注意:这将使小叶和小叶板更接近成像表面，是那些对可视化小叶复杂神经元感兴趣的人的理想选择。
      3. 水平视图
         注意:要同时可视化所有视叶神经桩，请使用水平安装策略（图2G）。在这种方向上，神经元细胞体、轴突轨迹和树突状树状化可以在同一平面上看到。
         1. 最初，将大脑前侧朝上定向。用钨针轻轻地将大脑向上倾斜 90°，使其位于背侧，触角叶朝外。检查大脑的前侧和后侧在这个方向上是否可见。
   5. 使用粘土将盖滑桥从滑梯上抬高，而不是盖滑桥。使用粘土可以在成像后重新安装大脑（在讨论部分中描述）。
      1. 在盖玻片的每个角上放一小块粘土。确保每块粘土的厚度相对相同。粘土片的厚度应在 0.5-1 毫米之间。轻轻地将盖玻片放在大脑上，并在角落处轻轻按压。盖玻片应立即接住液体并形成密封。现在，载玻片已准备好进行成像。
         注意:对于载玻片的长期存放，建议用指甲油密封盖玻片，并在4°C避光处存放。

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结果

以协议中描述的方向安装的幼虫和成虫视叶的共聚焦图像如图 1 和 图2所示。

图 1 显示了位于前、后和侧方向的幼虫大脑的示意图和具有代表性的共聚焦切片。在前安装方向，OPC上皮细胞（DE-Cadherin），髓质神经母细胞（面无表情>βgal）和层神经元（腊肠犬）以包裹大脑的细胞带的形式出现在表面（

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讨论

在该协议中，我们描述了一种对幼虫和成年果蝇大脑进行免疫染色并将它们安装在几个方向上的方法。虽然以前已经描述了对幼虫和成虫大脑进行染色的方法 22,23,24,27,28，但用于特定视叶结构的最佳可视化的安装策略受到的关注较少 ²⁸.预计这里描述?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps - #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps - #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506