JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

增强子 RNA （eRNA） 是由活性增强子产生的非编码 RNA。研究 eRNA 功能的最佳方法是纵它们在天然染色质区域中的水平。在这里，我们通过使用 CRISPR-dCas9 融合的转录激活剂来诱导目标 eRNA 的表达，从而引入了一种强大的 eRNA 研究系统。

摘要

增强子是分散在哺乳动物基因组中的关键基因组元件，决定组织特异性基因表达程序。越来越多的证据表明，增强子不仅为转录因子 （TF） 提供 DNA 结合基序，还产生称为 eRNA 的非编码 RNA。研究表明，eRNA 转录本可以在生理学和疾病的基因调控中发挥重要作用。研究 eRNA 功能的常用方法仅限于通过敲低 eRNA 或通过化学抑制增强子转录的“功能丧失”方法。目前还没有一种可靠的方法来对 eRNA 进行“功能获得”研究，以模拟特定的疾病状况，例如人类癌症，其中 eRNA 经常过表达。在这里，我们介绍了一种通过应用 dCas9 介导的协同激活介质 （SAM） 系统来精确、稳健地激活 eRNA 以询问其功能作用的方法。我们介绍了 eRNA 激活的整个工作流程，从 eRNA 的选择、gRNA 的设计到通过 RT-qPCR 验证 eRNA 激活。该方法代表了一种研究特定 eRNA 在基因调控和疾病发展中的作用的独特方法。此外，该系统可用于无偏倚的 CRISPR 筛选，以在特定疾病的背景下识别表型驱动的 eRNA 靶标。

引言

人类基因组包含一系列调节元件 1,2,3。其中，增强子成为最关键的类别之一 4,5,6。增强子在调节发育中起着重要作用，并负责产生时空基因表达程序以确定细胞身份 5,6,7。传统上，增强子仅被视为为转录因子 （TF） 提供结合基序的 DNA 元件，然后转录因子 （TF） 控制靶基因表达 6,8。然而，一系列研究发现，许多活性增强子也转录非编码增强子 RNA（即 eRNA）4,9,10。

发现 eRNA 转录水平与增强子的活性相关 4,10。活性增强子产生更多的 eRNA 转录本，并显示更高水平的与活性转录相关的表观基因组标志物，例如 H3K27ac 和 H3K4me1 9,11,12。一些研究表明，eRNA 转录本可以在靶基因的转录激活中发挥重要作用10,12。在人类癌症13、14、15、16 中发现大量 eRNA 失调，其中许多表现出高癌症类型特异性和临床相关性。这些发现为阐明可以驱动/促进肿瘤发生的 eRNA 提供了机会，这可能为治疗干预提供新的靶标13,15。

目前研究 eRNA 功能的方法几乎完全基于使用小干扰 RNA （siRNA）、短发夹 RNA （shRNA） 或反义寡核苷酸（ASO，其中锁核酸 （LNA） 是研究中常用的类型）的敲低策略10,12,17。然而，与邻近的正常组织相比，癌症等人类疾病主要表现出 eRNA 的过表达15，因此需要工具“过表达”eRNA 以模拟其疾病相关表达模式以进行功能研究。为了实现这一点，基于质粒的异位过表达系统并不是最佳的，因为 eRNA 的确切转录开始和终止位点在很大程度上仍不清楚。此外，质粒表达系统可能会改变 eRNA 的位置，从而导致其功能的潜在伪影18。在这里，我们提供了一个详细的方案，通过在基于 CRISPR/dCas9-协同激活介质系统 （SAM） 的天然基因组位点（即原位）中强制执行它们的“过表达”来促进 eRNA 的功能表征。

SAM 系统最初是为激活黑色素瘤细胞中与 BRAF 抑制剂耐药性相关的编码基因和长基因间非编码 RNA （lincRNA） 而开发的19。与其他 CRISPR 激活 （CRISPRa） 技术不同，SAM 系统由转录激活剂组合组成，可赋予靶区稳健的转录激活。这些激活剂包括：与 VP64 融合的酶促死亡 Cas9 （dCas9）（即 dCas9-VP64）;一个包含两个 MS2 RNA 适配体和一个 MS2-p65-HSF1 融合激活蛋白的向导 RNA。gRNA 中存在的 MS2 适配体可以将 MS2-p65-HSF1 融合蛋白募集到 dCas9/gRNA 结合位点附近。其中，VP64 是单纯疱疹 VP16 转录激活因子结构域的工程化四聚体，已被证明可通过募集一般转录因子来强烈激活基因转录 20,21,22。MS2-p65-HSF1 融合蛋白由三部分组成。第一部分 MS2-N55K 是 MS2 结合蛋白的突变形式，具有更强的亲和力23;这种融合蛋白的另外两个部分是 p65 的反式激活结构域和热休克因子 1 （HSF1），这两者都是具有强反式激活结构域的转录因子，可以诱导强大的转录程序24,25。因此，SAM 系统基本上创造了一种高效的激活因子复合体，以激活指定编码基因和 lincRNA 的转录19。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

该协议的整个工作流程如图 1 所示。

1. 增强子 RNA （eRNA） 选择

  1. 通过使用染色质免疫沉淀测序 （ChIP-Seq） 数据的结合峰，即组蛋白修饰（例如，H3K4me1 和 H3K27ac）或转录共激活因子（例如，p300）的结合峰，确定推定的目标增强子区域。
  2. 通过将 ChIP-Seq 峰与 RNA-seq 信号（例如，来自总 RNA-seq 或来自新生 RNA-seq，如全局运行测序 （GRO-Seq）相交来鉴定目标 eRNA。
    注意：选择用于设计 gRNA 的区域通常应仅限于“增强子核心”区域，其中 TF 或共激活因子（例如，p300）显示出清晰的 ChIP-seq 峰（图 2A）。dCas9 及其融合共激活因子将被 gRNA 募集到该区域，以模拟共激活因子的天然结合（图 2A）。如果有特定的数据集，如基因表达帽分析 （CAGE）4 或 GRO-cap26，它们可用于精确确定“增强子核心”，即转录到相反方向的 eRNA 的两个转录起始位点之间的区域 4,10,26。

2. gRNA 设计

  1. 使用常见的 CRISPR gRNA 设计工具（如 CRISPOR27 ）选择具有低电位关闭靶向 （http://crispor.tefor.net/） 的 gRNA。
    注：Benchling28 或 CHOPCHOP29 等其他工具也可用作 gRNA 设计的附加选项。
  2. 将增强子核心 DNA 序列粘贴到 CRISPOR 网站的第 1 步列中，然后单击下拉按钮在 第 2 步 列中选择相应的基因组（例如，人类）。单击下拉按钮，在 第 3 列中将 Protospacer Adjacent Motif （PAM） 序列设置为“NGG”，然后单击“提交”按钮生成长度为 20 bp 的向导序列。
  3. 选择 CRISPOR 工具中特异性得分最高的指南，即低脱靶电位，然后分别在 5' 端添加 “CACCG”，在 3' 端添加 “C”。
    注：选择特异性评分最高的指南（最好在 CRISPOR 中为 >85）。
  4. 从商业来源订购每个正义和反义序列的寡核苷酸。
    注：有关 CRISPR/Cas9 gRNA 设计的其他说明可在其他研究30,31 中找到。步骤 2.2 中的突出端将使 gRNA 与使用 BsmBI 限制性内切酶的 SAM gRNA 骨架 （Addgene #61427） 兼容。

3. 将 gRNA 克隆到慢病毒构建体中

  1. 为了退火寡核苷酸，将 1 μL 的每种配对寡核苷酸以 100 μM 的浓度混合、1 μL 的 10x T4 连接缓冲液、0.5 μL 的 T4 DNA 连接酶（400,000 单位/mL）和 6.5 μL 的 H2O，以达到 10 μL 的总体积。在 37 °C 下孵育 30 分钟，然后在 95 °C 下孵育 5 分钟， 并以 5 °C/min 的速度下降至 25 °C。使用 H2O 稀释至 100 μL。
  2. 通过将 2 μL 10x 限制性内切酶 （RE） 缓冲液、300 ng lenti_gRNA （MS2） _zeo骨架质粒 （Addgene #61427） 混合在 1 μL、1 μL BsmBI 酶和 16 μL H2O 中来消化 gRNA 骨架，以达到 20 μL 的总体积。在 55 °C 下孵育 15 分钟。
  3. 向 25 μL 系统中加入 2.5 μL 10x T4 连接缓冲液、1 μL 稀释退火产物和 1.5 μL T4 DNA 连接酶（400,000 单位/mL），将连接组分与 20 μL 消化产物混合。在室温下孵育 30 分钟。
  4. 将步骤 3.3 中的 2 μL 连接混合物转化到 Stbl3 感受态 大肠杆菌 细胞中。将它们铺在氨苄青霉素 LB-琼脂平板上，并在 37 °C 下孵育过夜。
  5. 挑选并接种单个细菌菌落并提取质粒。将其发送进行 Sanger 测序，以确认 gRNA 序列已正确插入。
    注：引物和 gRNA 的序列可在 补充表 1 中找到。 建议在此处使用 Stbl3 化学感受态 大肠杆菌 细胞，因为它们在产生易不稳定的慢病毒质粒32 时具有更高的质粒 DNA 产量和更高的质粒稳定性。

4. gRNA 效率测试

注：虽然可能不需要每个 gRNA，但建议研究人员通过执行 Surveyor 测定（即错配切割测定）来检查 gRNA 的质量，以检测只能由优质 gRNA 有效产生的插入缺失或突变33,34。其他方法，如通过分解追踪插入缺失 （TIDE） 也可用于确定 gRNA 效率30,35。Surveyor 核酸酶是错配特异性核酸内切酶家族的成员，可以切割错配的双链 DNA（图 3A）。gRNA 的质量可以通过产生较小 DNA 种类的功效来揭示。实际上，检测基因切割效率也会受到 gRNA 和 Cas9 转染效率的影响。

  1. 使用基于脂质的转染试剂，将 gRNA 与表达 Cas9 蛋白的 pSpCas9（BB）-2A-Puro （Addgene #62988） 质粒一起转染到 293T 细胞中。在 6 孔板中，每个质粒每孔使用 1.2 μg/mL。转染后继续培养细胞 3 天。根据制造商的方案36 收获和提取基因组 DNA。
  2. 使用聚合酶链反应 （PCR） 从基因组 DNA 中扩增目标增强子区域。使用 补充表 2 中所示的 PCR 条件。使用 补充表 1 中的引物作为示例增强剂 NET1e。通过在 95 °C 下孵育 10 分钟使 PCR 产物变性，然后以 -0.3 °C/s 的速度从 95 °C 降至 25 °C 重新杂交，以使具有和没有 gRNA 诱导的插入缺失或突变的单链 DNA （ssDNA） 相互退火。
  3. 按照制造商的方案37 通过 Surveyor 核酸酶（图 3A）消化杂交的 DNA。在 50 μL 系统中混合步骤 4.2 中的 400 ng 杂交 DNA、1 μL Surveyor 核酸酶、1 μL Surveyor 增强子和 5 μL 0.15 M MgCl2。在 42 °C 孵育 60 分钟。分析琼脂糖凝胶上的 DNA。在测定和凝胶电泳中使用阴性对照，例如仅具有 Cas9 但不靶向 gRNA 的细胞（图 3B）。

5. 慢病毒生成

  1. 在 1.5 mL 聚丙烯管中，以 3 μg：1 μg：4 μg 的比例添加 psPAX2、pMD2.G 和靶质粒（例如，lenti_dCas9-VP64_Blast，Addgene #61425;或 lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro，Addgene #61426）。将它们与 500 μL Opti-MEM 混合，并在室温下孵育 5 分钟。
  2. 在单独的试管中，将 10 μL 脂质转染试剂放入 500 μL Opti-MEM 中，并在室温下孵育 5 分钟。
  3. 混合步骤 5.1 和 5.2 中的产物，并在室温下孵育 20 分钟。
  4. 转染前一天对 293T 细胞进行铺板，并在转染时让它们在 10 cm 培养皿中达到 ~30% 的汇合度。加入 4 mL 常规培养基（含 10% FBS 的 DMEM），然后将步骤 5.3 中的复合物滴加到细胞中。添加含 10% FBS 的 DMEM，使最终体积达到 6 mL。在 37 °C 和 5% CO2 的细胞培养箱中孵育过夜。
  5. 第二天，将培养基更换为 10 mL 含 10% FBS 的新 DMEM。更换培养基后 24 小时收获培养基。使用注射器过滤器（例如，0.45 μm）过滤含病毒的培养基，然后继续执行步骤 6 或将病毒储存在 -80 °C 中。
    注意：慢病毒作需要生物安全 II 级机柜。需要谨慎安全地处理与病毒相关的实验;如果任何容器与病毒培养基直接接触，则需要漂白 20 分钟以上，然后才能作为生物危害物处理。

6. 细胞培养

  1. 将细胞维持在 CO2 细胞培养箱中，在 37 °C 和 5% CO2 下。
  2. 在含 10% FBS 的 Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 培养基中培养 MCF7 和 293T 细胞。
  3. 在 10 cm 培养皿中培养细胞，汇合时以 1：3 至 1：5 的比例分流。

7. 细胞感染和选择

  1. 将靶细胞（例如 MCF7）直接接种在含有 0.5 mL lenti_dCas9-VP64_Blast （Addgene #61425） 和 0.5 mL lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro （Addgene #61426） 的病毒培养基混合物中。添加 8 μg/mL 溴化己二甲嘧啶以提高感染效率。使用未感染细胞的孔作为阴性对照，以检查抗生素选择的有效性。
    注：病毒培养基的推荐量如下：6 mL 病毒培养基用于 10 cm 培养皿，1 mL 用于 6 孔板的孔，0.5 mL 用于 12 孔板的孔。
  2. 感染后 24 小时，向细胞中加入含有杀稻瘟菌素（MCF7 细胞为 5 μg/mL）和潮霉素（MCF7 细胞为 200 μg/mL）的新鲜培养基。
  3. 将细胞保存在抗生素筛选培养基中，直到阴性对照细胞死亡。
    注：不同细胞系趋于稳定的时间可能会有所不同。对于 MCF7，未感染的细胞通常需要 5-7 天才能完全死亡。在实验之前，应使用一系列抗生素浓度测试新细胞系的杀伤曲线。在后续步骤中使用细胞混合物是可以接受的，但另一种方法是选择在两种效应蛋白表达方面均一的单细胞集落。获得的稳定系在本文中称为 SAM 效应子亲本系（例如，MCF7 SAM 效应子系）。建议使用共享的 SAM 效应亲本细胞系用于不同靶向或非靶向 gRNA 的感染，尤其是在比较它们的作用时。
  4. 使用蛋白质印迹来确定细胞是否稳定表达两种效应蛋白（示例如图 4A 所示）。使用总 RNA 的逆转录后进行定量 PCR （RT-qPCR） 作为替代方法来检查两种 mRNA 的表达水平 （dCas9-VP64 和 MS2-p65-HSF1， 图 4B）。
    注：用于检查两个 dCas9 效应子的 mRNA 水平的引物可在 补充表 1 中找到。
  5. 生成步骤 3.5 中构建的 gRNA 慢病毒，并用单个 gRNA 慢病毒感染双表达 dCas9-VP64 和 MS2-p65-HSF1 的稳定 SAM 细胞系。在 gRNA 病毒转导后 24 小时，将 Zeocin（MCF7 细胞为 100 μg/mL）添加到培养基中。在亲本 SAM 细胞系中生成表达非靶向 gRNA （NT-gRNA） 的阴性对照。
    注：确保选择药物对目标构建体具有特异性。

8. RNA 提取和定量 RT-PCR 检测 eRNA 水平

  1. 使用 RNA 提取试剂盒38 或其他基于苯酚氯仿的方法，从表达 NT-gRNA 或靶向 gRNA 的 SAM 细胞系中提取总 RNA。在 6 孔板的一个孔中使用 ~80% 汇合度的细胞进行 RNA 提取。
    注：在我们的 eRNA 检测实践中，当通过商业结合柱或苯酚氯仿试剂提取 RNA 时，未观察到显著差异。
  2. 按照制造商的方案，通过与随机六聚体进行逆转录反应，从纯化的 RNA 中制备互补 DNA （cDNA）39。 使用条件见补充表 2.
    注：由于大多数 eRNA 是非多聚腺苷酸化的 1,2,4,9,10，因此随机六聚体通常用于 cDNA 生成。
  3. 使用信誉良好的引物设计工具（例如，引物 3）设计用于 RT-qPCR 测量靶 eRNA 的引物。通过检查引物是否会线性扩增连续稀释的 cDNA 并显示预期的 qPCR 循环差异，测试引物对的扩增线性。 使用条件见补充表 2.
    注意：用于 RT-qPCR 的引物应靶向新生 RNA-seq 中的高度转录区域，引物的线性测试应包括广泛的 cDNA 稀释度，以确保测试所有可能遇到的 eRNA 水平。线性度测试的示例如图 5A 所示。
  4. 进行 RT-qPCR 并分析对照细胞（具有 NT-gRNA 的 SAM 细胞系）和具有靶向 eRNA 的 gRNA（例如， NET1e gRNA#1）的 SAM 细胞系中的 eRNA 表达水平（例如， 图 6A）。 NET1e RNA 的引物如 补充表 1 所示。 使用条件见补充表 2.  

9. dCas9 ChIP 和 qPCR

注意：此步骤是一个可选实验，用于验证特异性 gRNA 与 dCas9/SAM-gRNA 复合物与靶增强子的结合。虽然鼓励用户执行此步骤，但无需测试每个 gRNA。请参阅 图 5B 中所示的示例。请参阅 补充表 1 中列出的引物。

  1. 交联细胞
    1. 从细胞中取出培养基，加入 1% 溶解在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的甲醛。静置 10 分钟。
    2. 以 1：20 的体积加入 2.5 M 甘氨酸以淬灭交联，并用冰冷的 PBS 洗涤细胞两次。加入 700 μL 冰冷的 PBS，将细胞刮到 1.5 mL 试管中。
    3. 在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。 继续执行步骤 9.2，或快速冷冻并储存在 -80 °C。
  2. 超声处理
    1. 制备新鲜的 LB1、LB2 和 LB3 缓冲液。LB1：50 mM Hepes-KOH （pH 7.5）、140 mM NaCl、1 mM EDTA、10% 甘油、0.5% NP-40、0.25% Triton-X 100 和 1x 蛋白酶抑制剂。LB2：10 mM Tris-HCl （pH 8.0）、200 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA 和 1x 蛋白酶抑制剂。LB3：10 mM Tris-HCl （pH 8.0）、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、0.1% Na-Deoxycholate、0.5% N-月桂酰肌氨酸和 1x 蛋白酶抑制剂。实验前将 1x 蛋白酶抑制剂新鲜补充到缓冲液中。
    2. 向细胞沉淀中加入 1 mL 缓冲液 LB1，吸取大量移液，在 4 °C 下旋转 10 分钟，然后在 4 °C 下以 2,000 x g 旋转 5 分钟。 倒出上清液，加入 1 mL LB2 缓冲液，在 4 °C 下旋转 10 分钟，然后在 4 °C 下以 2,000 x g 旋转 5 分钟。 倒出上清液并除去过量的 LB2 缓冲液。加入 300 μL 缓冲液 LB3。
    3. 使用适当的超声仪系统对染色质 DNA 进行超声处理和片段化，使其平均大小为 ~200-400 bp。超声处理后，加入 30 μL 10% Triton-X 100 并充分混合。如果使用新的细胞系，请测试适当的超声处理时间。
    4. 以 14,000 x g 离心以去除沉淀。将上清液转移到新试管中，加入 630 μL LB3 和 70 μL 10% Triton X-100 至总体积为 1 mL。向上清液中加入 2 μg Cas9 抗体，并在 4 °C 下旋转过夜。
  3. 免疫复合物捕获和反向交联
    1. 准备 RIPA 缓冲液（50 mM HEPES pH 7.6、1 mM EDTA、0.7% Na-脱氧胆酸盐、1% NP-40、0.5 M LiCl）和洗脱缓冲液（1% SDS 和 0.1 M NaHCO3）。
    2. 用 1% BSA 的 PBS 溶液洗涤蛋白 G dynabeads 3 次，用 LB3 缓冲液洗涤 1 次。
    3. 向样品中加入 30 μL 蛋白 G dynabeads，并在 4 °C 下孵育 4 小时。
    4. 在 500 μL RIPA 缓冲液中洗涤 beads-immuno-complex 6 次。不要让珠子变干。
    5. 用 TE 缓冲液洗涤 beads-immuno-complex 一次;删除缓冲区。
    6. 向 beads-immuno-complex 中加入 200 μL 洗脱缓冲液并涡旋;然后将其放入温度可调的加热振荡器中，设置为 65 °C，以 600 rpm 振荡 6-16 小时以反向交联。
  4. DNA 提取
    1. 从摇床中取出试管，短暂旋转珠子并将它们放在磁力架上。将 200 μL 上清液转移到新试管中，并加入 200 μL TE 缓冲液。
    2. 向试管中加入 1 μL RNase A （1 mg/mL），并在 37 °C 下孵育 1 小时。
    3. 孵育 1 小时后，向样品中加入 2 μL 蛋白酶 K （20 mg/mL），并在 65 °C 下孵育 2 小时。
    4. 短暂离心并加入 400 μL 苯酚-氯仿-异戊醇混合物。充分混合，然后以 10,000 x g 离心 5 分钟。
    5. 将 400 μL 上层移至含有 16 μL 5 M NaCl 和 1 μL 糖原 （20 μg/μL） 的 1.7 mL 试管中，并充分混合。
    6. 加入 800 μL 100% 乙醇，并在 -20 °C 下放置过夜。
    7. 第二天早上，将试管在 4 °C 下以 14,000 x g 离心 15 分钟。
    8. 去除上清液，用 1 mL 70% 乙醇洗涤沉淀。以 14,000 x g 离心 10 分钟。
    9. 去除乙醇，风干沉淀，重悬于 50 μL TE（10 mM Tris-HCl，pH 8.0,1 mM EDTA）中。
  5. 进行 ChIP-qPCR，以检查一对增强子核心靶向引物将 SAM 复合物募集到靶向位点。使用靶向不相关区域的引物对作为阴性对照。

10. eRNA 过活化的细胞生长测定和其他功能测试

  1. 用胰蛋白酶消化表达非靶向 gRNA 或 eRNA 靶向 gRNA 的 SAM 细胞系，并在 96 孔板中每孔接种 ~3,000 个细胞。
  2. 使用活细胞成像仪或其他方法（例如，细胞计数或水溶性四唑盐-1 测定）测量细胞生长。
  3. 使用半数最大抑制浓度 （IC50） 测试细胞对 SAM15 过表达或不过表达 NET1e 的细胞中特定癌症药物的反应。
    注：乳腺癌细胞的细胞生长测定和药物敏感性试验的结果是在过表达与 NET1 基因相邻转录的 eRNA（称为 NET1e15）后呈现的。其他检测可以根据每个特定项目的需要在细胞或生物体水平进行。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

图 1 说明了该协议的整体工作流程。我们关注的重点是在乳腺癌中过表达的代表性 eRNA NET1e15，为此，SAM 系统用于激活和研究其在调节基因表达、细胞增殖和癌症药物反应中的生物学作用。对于该 NET1 增强子，标记了几个 p300 ChIP-Seq 峰，两侧是转录的 eRNA 转录本（图 2A、B）。基于强 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

根据我们的数据，我们得出结论，SAM 系统适用于研究 eRNA 在调节细胞表型中的作用，例如细胞生长或耐药性。然而，由于以下原因，需要仔细的 gRNA 设计才能实现稳健的 eRNA 激活。首先，每种特定细胞系/类型中 eRNA 的转录起始位点 （TSS） 仍然不太清楚。因此，需要利用表观基因组信息（例如，H3K27ac、转录因子或 p300 的 ChIP-Seq）、GRO-Seq 描述的转录活性（或其他 CAGE

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

内容完全由作者负责，并不一定代表德克萨斯州癌症预防和研究所的官方观点。

致谢

这项工作得到了 WL（德克萨斯州癌症预防和研究所、CPRIT RR160083 和 RP180734 的资助;NCI K22CA204468;NIGMS R21GM132778;德克萨斯大学 UT 明星奖;和韦尔奇基金会 AU-2000-20190330）和 JL 博士后奖学金（UTHealth 癌症预防创新研究培训计划博士后奖学金，CPRIT RP160015）。我们承认原始公告15 ，其中我们当前的一些数据是采用（经过修改的），遵循知识共享许可证 （https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

参考文献

  1. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  3. Kundaje, A., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  5. Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C., Glass, C. K. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 144-154 (2015).
  6. Ong, C. T., Corces, V. G. Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics. 12 (4), 283-293 (2011).
  7. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  8. Grossman, S. R., et al. Systematic dissection of genomic features determining transcription factor binding and enhancer function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1291-1300 (2017).
  9. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  10. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics. 17 (4), 207-223 (2016).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  13. Lee, J. H., Xiong, F., Li, W. Enhancer RNAs in cancer: regulation, mechanisms and therapeutic potential. RNA Biology. , 1-10 (2020).
  14. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  15. Zhang, Z., et al. Transcriptional landscape and clinical utility of enhancer RNAs for eRNA-targeted therapy in cancer. Nature Communications. 10 (1), 4562(2019).
  16. Chen, H., et al. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell. 173 (2), 386-399 (2018).
  17. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  18. Lubelsky, Y., Ulitsky, I. Sequences enriched in Alu repeats drive nuclear localization of long RNAs in human cells. Nature. 555 (7694), 107-111 (2018).
  19. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  20. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., Barbas, C. R. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14628-14633 (1995).
  21. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  22. Hirai, H., Tani, T., Kikyo, N. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA. International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1589-1596 (2010).
  23. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. Altering the RNA binding specificity of a translational repressor. Journal of Biological Chemistry. 269 (12), 9006-9010 (1994).
  24. Schmitz, M. L., Baeuerle, P. A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO Journal. 10 (12), 3805-3817 (1991).
  25. Vihervaara, A., Sistonen, L. HSF1 at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 2 261-266 (2014).
  26. Core, L. J., et al. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature Genetics. 46 (12), 1311-1320 (2014).
  27. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  28. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2020).
  29. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  30. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. , (2020).
  31. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), e57998(2018).
  32. Al-Allaf, F. A., Tolmachov, O. E., Zambetti, L. P., Tchetchelnitski, V., Mehmet, H. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3. 3 Biotech. 3 (1), 61-70 (2013).
  33. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  34. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  35. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  36. Quick-DNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_d3024_d3025_quick-dna_miniprep_kit.pdf (2020).
  37. SURVEYOR Mutation Detection Kit. IDT. , Available from: https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/user-guide-manual/surveyor-kit-for-gel-electrophoresis-user-guide.pdf?sfvrsn=a9123407_6 (2020).
  38. Quick-RNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1054_r1055_quick_rna_miniprep_kit.pdf (2020).
  39. SuperScript IV Reverse Transcriptase Product Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/SSIV_Reverse_Transcriptase_UG.pdf (2020).
  40. Ounzain, S., et al. Functional importance of cardiac enhancer associated noncoding RNAs in heart development and disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 76, 55-70 (2014).
  41. McCleland, M. L., et al. CCAT1 is an enhancer-templated RNA that predicts BET sensitivity in colorectal cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 639-652 (2016).
  42. Miao, Y., et al. Enhancer-associated long non-coding RNA LEENE regulates endothelial nitric oxide synthase and endothelial function. Nature Communications. 9 (1), 292(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

RNA ERNAs DCas9 CRISPR RT qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。