近植入阶段人类胚胎中特罗福细胞的单细胞集合

摘要

在这里，我们描述了一种加热玻璃化人类胚胎的方法，通过体外植入期培养它们，将其消化成单细胞，并收集早期成体细胞，以作进一步研究。

摘要

人类植入，对子宫表面上皮的定位和附着力，以及随后对母体十分细胞的侵扰，是一个关键但神秘的生物事件，由于技术和伦理上的限制，在历史上一直难以研究。植入是由早期三磷细胞的营养细胞发育和随后分化为不同的成吉龙体亚系而启动的。畸变早期成体分化可能导致植入失败、胎盘病理、胎儿异常和流产。最近，人们已经开发出一些方法，允许人类胚胎在没有母体组织的情况下生长到体外受精后的第13天，这一时期包括人类植入期。这给了研究人员机会，研究人类植入和重述在这个关键时期，不混淆母体影响和避免内在的障碍，研究早期胚胎分化事件在体内的动态。为了描述植入过程中不同的成虫细胞亚系，我们采用了现有的二维（2D）扩展培养方法，并开发了一种酶消化和分离不同类型的成吉本细胞进行下游测定的程序。在二维条件下培养的胚胎具有相对扁平的形态，在体内三维（3D）胚胎结构建模方面可能不理想。然而，在扩展培养过程中，预期形态和基因表达变化表明，成图细胞分化的影响较小。不同的成虫细胞亚系，包括细胞萎缩细胞、同步性细胞和迁徙成虫细胞，可以按大小、位置和时间出现来分离，并用于进一步表征或实验。研究这些早期成体细胞可能有助于理解人类植入，治疗常见的胎盘病理，并减轻妊娠损失的发生率。

引言

人类植入和早期胎盘的出现在历史上很难调查，而且在很大程度上仍然未知，因为当怀孕在临床上无法察觉时，人体组织在这个阶段是无法接近的。动物模型不足，因为与其他动物哺乳动物相比，人类的放置有其独特的特征。例如，人类胎盘侵入到十分深，一些细胞细胞至少达到子宫肌膜的内三分之一，而其他细胞则重塑子宫螺旋动脉。即使是我们最亲密的进化祖先，非人类灵长类动物，也表现出与母体十^,化组织^1、2、3的胎儿形态^和成骨^{细胞相互作用的差异}。直到20世纪80年代，临床人类体外受精（IVF）开始作为治疗不孕症^的常规做法，才有可能在体外获得人类胚胎。现在，人类胚胎可以在体外生长，以便选择更可行的胚胎进行移植，并实现安全的基因测试。胚胎培养技术的改进，以及试管婴儿的使用日益增多，产生了许多多余的胚胎，这些胚胎在患者的治疗周期完成后仍然存在。经患者同意、IRB 批准以及某些限制，这些囊肿可用于研究。它们已成为用于获得人类胚胎干细胞^{5的宝贵资源，了解内}细胞质量^{向胚胎干细胞6、7,的过渡}，最近，它们被成功培养，直到第（D）天（D）13，重塑^{人类植入8、9。,9}通过利用最近开发的单细胞组理方法，获得这些植入阶段人类胚胎组织提供了独特的机会来描述调节这种高度动态细胞分化过程的分子机制，这些机制以前是不可能探索^{的10、11、12、13。,11,12,13}

在这里，我们描述了我们最近的出版物中使用的方法，这些方法描述了人类植入12期间成体细胞^{分化的动态}。该协议包括维他化胚胎的升温，将胚胎培养扩展到D12后IVF，将胚胎酶消化成单细胞，以及细胞收集用于下游测定（图1）。这种扩展的培养系统支持近植入阶段人类胚胎发育，无需母体输入，并重述了与^,多年前^{14、15、16、17等组织,15}学标本的观察^{16结果一致的成骨细胞分化}。在植入过程中，成粒细胞群体由至少两种细胞类型组成:单核祖细胞细胞（CTB）和端膜分化的多核同步细胞（STB）。在三辛消化时，CTB是小而圆的细胞，在形态上与其他细胞系系无法区分（图2A，左面板）。CTB与其他细胞系系（如表膜细胞和原始内端膜）的分离可以通过单细胞RNA测序揭示的不同转录特征实现。同步细胞很容易被识别为不规则形状的结构，明显大于其他细胞类型，主要位于胚胎的外围（图2A，中间面板;图 2B，左面板）。移殖成细胞（MTB）是在胚胎扩展培养过程中发现的另一种成吉本细胞亚系，可以识别为似乎远离胚胎主体（图2A，右面板，图2B，右面板）。移栖成虫虽然表达许多与额外小虫细胞相同的标记，但不应称为EVT，因为胎盘中的双生结构尚未在发育的早期阶段出现。

在实验中，我们能够收集到小CTB和大型STB，这些在胚胎被消化成D8、D10和D12的单细胞后很容易区分（图2A，B）。迁移性成虫在胚胎发育的后期产生，可以在D12收集，然后对整个胚胎进行酶消化（图2A，B）。通过表型分离这三个三个三个三个三个三族细胞子系在单细胞分析之前，我们可以识别特定的转录标记，并定义每种细胞类型的生物学作用。细胞萎缩细胞是高度增殖的，在提供STB和MTB分化血统^{10，11，12，13,11,12时充当祖细胞}。同步性细胞参与生产胎盘激素来维持妊娠，并可能负责胚胎钻进内膜10，11，12，13。^10,11,12,13迁徙的龙骨细胞具有更强烈的侵入性，迁移表型的特点，并可能导致子宫子宫^,内膜^{10，11，12，13,11,12}的更深入和^{更广泛的殖民}化。在定义每种细胞类型的转录特征后，聚类分析还发现另外两个细胞子集，这些细胞在形态上与CTB无法区分，并且具有STB和MTB特征的转录组，^{分别是12。}这些中间阶段细胞很可能在从CTB到MTB或STB子系的区分过程中，如果胚胎被盲目消化，细胞被转录组单独分离，就会被忽视。

此处描述的协议使用二维 （2D） 培养系统，可能不理想支持三维 （3D） 结构开发，正如最近一份描述新开发的 3D 文化系统^{13 的出版物所建议的那样}。然而，在这个2D系统中，早期成体细胞的分化似乎与^{体内标本14、15、16、17,15,16的观察结果一致}。此协议也可以很容易地适应到最近描述的 3D 培养系统^{13 中的}使用，变化最小。所有步骤都使用手持式微操作移液器进行，该移液器配有市售的一次性吸管或从连接到橡胶管、过滤器和喉舌的细拉玻璃移液器中移液器中移液器。

研究方案

所有人类胚胎都经同意捐赠用于研究。扩大人类胚胎培养议定书已获西方机构审查委员会批准（研究第1179872号），并遵循国际准则。使用人类胚胎的任何用途必须由与使用本协议的研究机构相关的相关道德和理事机构进行审查。

1. 准备

1. 在胚胎加热前一天，在无菌层流罩中准备介质和恢复板。
   1. 用 10% v/v 血清蛋白替代品 （SPS） 准备 2 mL 的风细胞培养基 （BM）。
      注:爆炸性培养基可能含有或不包含添加的蛋白质。在这里，我们使用的介质，必须补充10%的显示白蛋白。检查制造商指南，以有关此补充中的变异。在平衡之前，应使用连接到无菌注射器的无菌 0.22 μM 过滤器过滤所有介质。
   2. 用 10% v/v SPS 填充两个中心井器官培养皿洗碗，用 500 μL 的胚胎培养等级油覆盖。
   3. 在60毫米组织培养皿中，8 mL层胚胎培养油，然后用10%v/v SPS将20μL的BM滴锚到培养板的底部。使每个胚胎加热1滴。
      注:根据需要，可制作更多介质、水滴和洗碗。在油分层之前，也可以将滴滴添加到盘子中。在油下锚定滴将有助于减少蒸发和随后的渗透性变化。
   4. 在 37 °C、6% CO 2、5% O₂的培养箱中，用 10% v/v SPS 洗涤盘和恢复板平衡_BM，至少 4 小时。
   5. 在 4 °C 或长椅上解冻扩展培养基 （IVC1） 的第一步。
   6. 准备一个 500 μL 的 IVC1 洗碗盘，没有油覆盖。将大约 4 mL 的 IVC1 放入 5 mL 卡扣管中。
   7. 在 37 °C、6% CO₂ 和大气 O₂ 中平衡 IVC1 洗碗盘和 IVC1 的小扣管至少 4 小时。
2. 在胚胎加热前一天，在无菌层流罩中准备扩展培养板。
   1. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中从人血清中稀释纤维素至30μg/mL。每个胚胎需要 250 μL 30 μg/mL 纤维素来涂覆腔室。
   2. 打开发动机罩下的 8 个井室盖玻片包，同时注意不要触摸井。将移液器 250 μL 的 30 μg/mL 纤维素放入每个井中。
   3. 将盖子返回室盖玻片，并放在 4 °C 中 20-24 小时。
3. 在胚胎变暖的早晨准备扩展培养板。
   1. 用纤维素取回室盖玻片，并放在层流罩中。用 1 mL 移液器去除纤维素混合物，然后丢弃到废物容器中。
   2. 从小型 5 mL 卡扣管中检索加热、平衡的 IVC1 介质。
   3. 移液器 300 μL 的均衡 IVC1 进入每个井。小心不要让任何液体接触盖子，因为这会增加污染的风险。
   4. 使用 IVC1 返回带室的盖玻片，在 37 °C、6% CO_{2 和} 大气 O_{2 中孵} 育，直到步骤 4 中去除 zona pellucida。

2. 加热玻璃化D5人类胚胎

注:根据他们自己的玻璃化技术，其他制造商的协议可能略有不同。请参阅制造商的使用说明（如果适用）。

1. 将 3.0 mL 解冻溶液 （TS） 加热至 35 mm 盘至 37 °C。 将 300 μL 稀释溶液 （DS） 和两口 300 μL 洗涤溶液 （WS） 带到 6 孔板中，带到室温。
2. 使用钳子，小心地取出低温装置套筒，同时确保玻璃化胚胎始终留在液氮下。
3. 快速将低温装置从液氮中移出，并在 TS 中以 37°C 将低温装置的尖端倾斜。 将计时器设置为 1 分钟，并保持低温装置浸入，直到胚胎分离到 TS 中。
   注:一次一个温暖的胚胎，以跟踪胚胎身份，因为它们可能与下游分析中的患者人口信息有关。
4. 在 TS 中的 1 分钟孵育过程中，小心地取出低温装置，轻轻拾起胚胎并移动到 TS 培养皿的对面。
   注:如果培养多个胚胎，请努力保持胚胎分离，以确保保持正确的身份。
5. 1分钟后，用少量 TS 轻轻拾取胚胎，约 2 μL。将胚胎移动到300μL DS的底部，同时将胚胎覆盖在从移液器的薄层 TS 中。将计时器设置为 3 分钟，并在室温下将 6 井板放在工作台顶部。
6. 3分钟后，用少量DS（约2μL）拾起胚胎，将胚胎移动到下一个含有300μLWS的井的底部。再次，轻轻地将少量 DS 从移液器层对胚胎。设置计时器 5 分钟，然后返回台面。
7. 5分钟后，用最小体积的WS拾起胚胎，并移动到300μL WS的最终井的顶部。胚胎会慢慢落下，通过WS洗到底部。将任何保留的 WS 从移液器中排出到空井中。
8. 以最小的体积拾取胚胎，并返回到相同的300μL井的WS的顶部。胚胎将再次落到井底。将计时器设置为 1 分钟，然后将 6 井板返回到工作台顶部。

3. 加热胚胎的恢复

1. 一次一个，将加热的胚胎移动到含有500μL平衡BM的中井器官组织盘中，在500μL的均衡胚胎培养品位油下，用10%v/v SPS。
2. 洗涤胚胎，拿起每个胚胎，并移动到几个区域在菜，同时吹出旧介质之间的移动。拿起胚胎，并移动到一个单独的20μL培养下降平衡BM与10%v/v SPS下油。
3. 让加热的胚胎在37°C的培养箱中恢复2小时，6%CO_{2，5%O 2。}

4. 佐纳去除

1. 2小时恢复后，评估胚胎的再膨胀，并拍摄每个胚胎的照片。
2. 在用酸性Tyrode溶液进行治疗之前，用5%（v/v）胎儿小牛血清（FCS）将胚胎单独移出500μL的3-（N-Morpholino）-丙烷松酸（MOPS）缓冲处理介质。
3. 通过300μL的加热酸性泰洛德溶液快速移动一个胚胎，同时通过显微镜积极观察。佐纳佩普鲁西达将视觉上开始溶解。这大约需要 5 s。
4. 立即将溶解的佐纳胚胎移入300μL的加热的MS缓冲介质中，以淬火酸泰洛德的溶液。
5. 将最小体积的 MOPS 缓冲介质的胚胎移动到含有 500 μL 平衡 BM 的中心井器官组织盘中，在 500 μL 的均衡胚胎培养品位油下用 10% v/v SPS 清洗。
6. 将胚胎从步骤 3.2 返回 20 μL 恢复下降。
   注:在摘除佐纳后进行目视检查时，任何具有保留的佐纳佩图西达的胚胎，如有必要，可通过重复步骤4.2-4.6，进一步用酸性Tyrode溶液进行进一步处理。需要尽量减少对泰洛德解决方案的接触。

5. 爆炸性扩展文化

1. 将胚胎分别移动到从步骤 1.1.6 的均衡 IVC1 介质的洗碗盘。小心地将一个胚胎移动到室盖玻片的一个井上，并平衡 IVC1 并保持胚胎识别。
   注:此步骤需要尽快完成，以尽量减少介质蒸发。
2. 将腔盖玻片返回到培养箱中，温度为 37 °C，CO_{2 为 6%，} 大气 O₂ 为 2 天。
   注:请务必在 37 °C、6% CO_2、 大气 O₂ 中提前 4 小时解冻和平衡介质。
3. 在生长 D2（受精后 D7）时，仔细检查胚胎在显微镜下的附着，并进行介质交换。
   1. 在交换介质之前，请注意哪个胚胎附着在培养皿上。轻轻敲击板，检查胚胎是否在显微镜下牢固地连接到板上。
   2. 取下盖子，小心地取出150μL的VC1，并在不干扰所附胚胎的情况下丢弃。如果胚胎尚未附着在板上，请勿更换介质，因为 IVC1 中的血清将有助于胚胎附着。
   3. 移液器 150 μL 的均衡扩展培养基，IVC2，慢慢进入每个井，并返回盖子到室盖玻片。
      注:确保从室盖板上取下盖子最小化，以避免中等蒸发。
4. 小心地将室盖玻片返回到培养箱，而不会溅到盖子上的任何介质。每天重复培养的培养的介质交换和附件检查，直到胚胎准备好固定或单细胞消化。

6. 可选的已用介质集合

1. 可选地，在 D7 之后或之后的任何一天在文化媒体的交流中收集使用的媒体。在步骤 5.3.2 中，不要将去除的 IVC1 的 150 μL 介质卡扣冻结丢弃到无菌低结合 0.5 mL 管中，以用于将来的分析。

7. 免疫荧光的可选固定

1. 使用 200 μL 移液器用 1~2 个 PBS 介质交换洗涤胚胎，然后固定以清除任何细胞外碎屑。清除多余的碎屑和蛋白质将有助于优化清晰度，减少通过免疫荧光获得的图像的背景。
2. 去除所有介质，在 PBS 中缓慢添加 200 μL 的 4% 甲状甲醛 （PFA）。胚胎会想要粘在液体的表面。在去除所有液体之前，用4%PFA洗涤多个150μL有助于最大限度地减少对胚胎的任何损害。
3. 在4%PFA中孵育胚胎20分钟进行固定。
4. 在新鲜PBS中，用200μL的0.1%v/v多糖酸20洗涤胚胎3x，每次洗涤10分钟。
5. 在继续免疫荧光方案之前，在4°C的PBS中储存0.1%v/v多糖酸20中的固定胚胎。

8. 单细胞消化与三辛

注:新鲜（不是固定的）胚胎用于单细胞消化。

1. 用200μL的PBS清洗胚胎一次，并在每个井中加入200μL的三辛解。将室盖玻片返回孵化器 5 分钟。
2. 从培养箱中取出室盖玻片，并在立体镜下检查胚胎。胚胎外围的细胞将开始缩回，MTB仍应附着在它们与胚胎远程位于的板上。
3. 在分解整个胚胎之前，使用小移液器或细拉嘴移液器拾取单个 MTB。跳过步骤 9.1 以保存 MTB，并在步骤 9.3 之后返回到步骤 8.4。
4. 使用手持式微操作移液器或口腔移液器通过上下吸气轻轻地分离胚胎。
5. 细胞将开始脱离整个胚胎。继续用直径较小的移液器尖端或嘴移液器轻轻地反复吸气胚胎，直到胚胎在三辛中总共孵育10分钟。

9. 单细胞选择和样本收集

1. 使用最小的三辛辛，在胚胎培养油下通过三滴 20 μL PBS = 0.1% 聚氯酰酮 （PVP） 移动分离细胞，注意不要丢失任何细胞。
2. 清洗细胞后，使用细拉玻璃移液器选择一个细胞。小心地将单个细胞移液到无菌的 0.2 mL 低结合管中，最小 PBS±0.1% PVP 的体积。
3. 将单个细胞冷冻在液氮（LN_2）中，并储存在-80°C中供将来使用。

结果

健康胚胎在扩展培养过程中持续增殖（图2B）。异常胚胎开始从外缘缩回并解体（图2C）。根据我们的经验，大约75%的胚胎在48小时时附着在纤维素涂层盘的底部，在培养中，附着在72小时时增加到约90%。胚胎附件的成功可能在很大程度上受到胚胎的初始质量的影响。72小时未附着的胚胎很可能无法存活。

在D8受精后（扩展培养的D3）...

讨论

通过植入培养人类胚胎的协议的制定，使科学家能够探索一个以前未知的发育^时间。,9在这里，我们使用一个扩展的培养系统来培养人类胚胎，并在小胎盘形成之前研究早期成肌细胞分化。此处介绍的方法允许我们收集不同的 TB 子线，用于下游单细胞分析。这项工作使科学界有机会了解人类发展的这一关键和神秘的时期，并可能为流产或其他性腺病理?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NORM JECT Luer Lock sterile syringe	VWR	53548-019	Pack of 100
3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish	VWR	62406-038	Case of 500
5 mL snap cap tube	VWR	60819-295	Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish	VWR	25382-687	Case of 200
6-well dish	Agtech Inc.	D18	Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution	Millipore Sigma	T1788	100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips	VWR	76322-156	Pack of 960
Blast, blastocyst culture media	Origio	83060010	10 mL
Dilution Solution	Kitazato	VT802	1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Thermo Fisher Scientific	1367820D	5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Millipore Sigma	D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil	Vitrolife	10029	100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL	VWR	47730-598	Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL	VWR	89130-980	Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution	Millipore Sigma	F0895	1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media	Vitrolife	10129	125 mL
Handling media	Origio	83100060	60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip	Ibidi	80826	15 slides per box
IVC1/IVC2	Cell Guidance Systems	M11-25/ M12-25	5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate	Cooper Surgical	23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane	Fisher Scientific	SLGVR33RS	Pack of 50
Mouth pieces	IVF Store	MP-001-Y	100 pieces
Oosafe center well dish	Oosafe	OOPW-CW05-1	Case of 500
Quinn's Advantage SPS	Origio	ART-3010	12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces	IVF Store	IVFS-NRL-B-5	5 ft.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270
Stripper tips	Cooper Surgical	MXL3-275	20/pk 275 µm
Thawing Solution	Kitazato	VT802	2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter	Cooper Surgical	MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	1 x 100 mL
Tween20	Millipore Sigma	P1379-25ML	25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips	VWR	76322-134	Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips	VWR	89174-526	Pack of 960
Washing Solution	Kitazato	VT802	1 x 4 mL