分析阿拉伯恐惧症中渗透应激信号的磷蛋白分析策略

摘要

这里介绍的是一种磷蛋白法，即停止和去提取基于磷蛋白的尖端，它提供了高通量和深度覆盖 的阿拉比多普西 磷蛋白。这种方法概述了阿拉伯语中渗透应激信号 的概述。

摘要

蛋白质磷化对于控制渗透条件下的酶活性和基因表达至关重要。基于质谱（MS）的磷蛋白经济学改变了研究植物信号转导的方法。然而，需要大量的起始材料和更长的MS测量时间来达到覆盖深度，一直是全球植物磷蛋白变化高通量研究的限制因素。为了提高植物磷蛋白的灵敏度和通量，我们开发了一种停止和去提取（阶段）尖端的磷蛋白经济学方法，并结合Tandem质量标签（TMT）标签，对植物磷酸化扰动进行快速、全面的分析，以应对渗透应激。利用阶段尖端技术的简单性和高通量，整个过程大约需要一个小时，使用两个提示完成磷肽的浓缩、分馏和样品清洁步骤，表明该方法易于使用且效率高。这种方法不仅提供了深入的植物磷蛋白学分析（+11，000 磷肽识别），而且还显示了相邻分数之间的卓越分离效率（+lt; 5%重叠）。此外，还利用TMT标签实现了多路复用，以量化野生型和 snrk2 脱钩突变植物的磷蛋白变化。这种方法已成功地用于揭示拉夫样激酶的磷化事件，以回应渗透应激，这揭示了对陆地植物早期渗透信号的理解。

引言

高盐度、低温和干旱引起渗透应力，这是影响植物生产力的主要环境因素^。蛋白质磷化是植物对渗透应激^3、4、5的反应中最重要的转化后修饰之一。SNF1相关的蛋白激酶2s（SnRK2s）参与渗透应激信号^6。SnRK2家族的10名成员中有9人因对渗透性压力^7、8表现出显著的激活作用。snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10突变（snrk2-dec）突变在所有 10 SnRK2 显示对渗透应激的超敏性。在snrk2-dec突变体中，渗透应激引起的不溶胶1，4，5-三磷酸盐（IP_3）、苦酸（ABA）生物合成和基因表达的积累被强烈减少，突出了SnRK2s在渗透应激反应中的重要作用^。然而，目前还不清楚SnRK2s激酶是如何调节这些生物过程的。分析针对渗透应激的磷蛋白变化是弥合这一差距和描绘植物中渗透应激触发防御机制的有效方法。

质谱学（MS）是测绘植物磷蛋白9^的一项强有力的技术。然而，由于植物蛋白质组的动态范围和植物草酸盐⁴的复杂性，植物磷蛋白的定性仍然是一个挑战。为了克服这些挑战，我们开发了一种通用的植物磷蛋白工作流程，它消除了光合作用颜料和次要代谢物等不必要的干扰，并实现了植物磷蛋白¹⁰的深度覆盖。在MS分析^{11、12、13、14、15、16}之前，已经开发出几种磷肽浓缩方法^，如固定金属离子亲和度色谱（IMAC）和金属氧化物色谱（MOC）。酸性非磷肽与磷肽共同净化是磷肽检测的主要干扰物。此前，我们标准化了 IMAC 装载缓冲区的 pH 值和有机酸浓度，以消除非磷肽的结合，获得 90% 以上的浓缩特异性，绕过了分馏前步骤^11。

磷肽富集和分馏多步骤过程中的样品流失妨碍了磷肽鉴定的敏感性和磷蛋白覆盖深度。停止和去提取技巧（阶段提示）是移液器提示，包含小磁盘，以盖住尖端的末端，它可以与色谱相结合的肽分馏和清洁^17。避免样品在管子之间转移，可以最大限度地减少阶段提示过程中的样品损失。我们已经成功地在Ga^3+-IMAC和Fe^3+-IMAC中实现了阶段提示，将低丰富的多磷酸肽与单磷酸肽分离出来，从而提高了人类磷蛋白¹⁵的深度。此外，与强 cation 交换 （SCX） 和强阴离子交换 （SAX） 色谱¹⁸相比，高 pH 反相 （Hp-RP） 阶段尖端的使用表明人类膜蛋白质组的覆盖范围更广。因此，集成 IMAC 和 Hp-RP 阶段尖端技术可以提高植物磷蛋白的覆盖率，具有简单性、高特异性和高吞吐量。我们已经证明，这一战略从 阿拉比多普西 斯幼苗中确定了2万多个磷化位点，代表了植物磷蛋白体¹⁹的深度。

在这里，我们报告了阿拉伯磷蛋白分析阶段基于尖端的磷蛋白化方案 。 此工作流程用于研究野生型和 snrk2-dec 突变幼苗的磷蛋白扰动，以应对渗透应激。磷蛋白分析显示，磷化位点与激酶活化和早期渗透应激信号有关。对野生型和 snrk2-dec 突变磷蛋白组数据的比较分析，发现了一种类似Raf的激酶（RAF）-SnRK2激酶级联，在高植物的奥斯莫尔应激信号中起着关键作用。

研究方案

1. 样品准备

1. 在铝箔中收获控制和应力处理的幼苗（1克），并闪过在液氮中冷冻样品。
   注意:通常从两周大的幼苗中观察到比成熟植物高的蛋白质浓度。一克幼苗产生大约10毫克的蛋白质解析，这足以进行MS分析。所有离心步骤在第 1 步中均在 16，000 x g 下进行。
2. 用砂浆和充满液氮的害虫将冷冻幼苗磨成细粉。
3. 添加1 mL的裂解缓冲区（（6 M瓜尼丁-HCl在100 mM特里斯-HCl， pH 8.5） 与 10 mM 三叶草 （2-碳甲基） 盐酸磷化物 （TCEP）， 40 mM 2-氯乙酰胺 （CAA）， 蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒） 到砂浆和混合与害虫的帮助.
4. 将植物裂解到 1.5 mL 管中，在 95 °C 下加热 5 分钟。
5. 将管子放在冰上10分钟。在冰上松下管子10s，暂停10s，重复三次。
6. 将管子离心 20 分钟，将 150μL 的植物解压成 1.5 mL 管。
7. 将 600 μL 的 100% 甲醇加入管中。漩涡和旋转管。
8. 在管子中加入 150 μL 的 100% 氯仿。漩涡和旋转管。
9. 将 450μL 的 ddH₂O 添加到管中。涡流和离心管3分钟。
10. 丢弃上一层。将 600 μL 的 100% 甲醇加入管中。将管子离心3分钟，然后丢弃溶液。
11. 用 600 μL 的 100% 甲醇清洗蛋白质颗粒。丢弃溶液，使蛋白质颗粒干燥。
12. 将蛋白质颗粒重新悬生到 600μL 的消化缓冲区（12 mM 脱氧糖酸钠 （SDC）/12 mM 酸酸钠 （SLS）， 在 100 m Tris-HCl， pH 8.5） 中。将管子声波化，直到悬架均匀化。
13. 使用 BCA 套件测量蛋白质浓度，并使用消化缓冲器将浓度调整到 4 μg/μL。将 100 μL 的利酸盐（400μg 蛋白质）转移到新管中。
14. 在管子中加入 292 μL 的 50 m m 三乙酸氢铵 （TEAB） 和 8 μL 的 Lys-C （2.5 单位/mL）。在37°C下孵育管子3小时。
15. 在管子中加入 100μL 的 50 mm TEAB 和 8μg 试管。在37°C下孵育管12小时。
16. 在管子中加入 25 μL 的 10% 三氟乙酸 （TFA）。涡流和离心管在4°C下20分钟。
17. 将超盐剂转移到有条件的脱盐柱中进行脱盐。使用真空离心机集中器干燥流体。
    注:用1 mL甲醇激活树脂，然后在80%丙烯酸酯（ACN）中激活1 mL的0.1%TFA。在 5% ACN 中用至少 3 mL 的 0.1% TFA 洗掉有机溶剂。将第 1.16 步准备的酸化肽样品装入柱中，然后用至少 3 mL 的 0.1% TFA 在 5% ACN 中清洗柱子。高盐浓度样品可能需要更多洗涤。在 80% ACN 中，用 1 mL 的 0.1% TFA 排出磷肽。

2. 串联质量标签 （TMT） 标签

1. 将干燥的肽重新悬生成 100 μL 的 200 mM 4-（2-羟基）-1-管道氨酸（HEPES），pH 8.5。
2. 在 40 μL 的无水性 ACN 中溶解每个通道的 TMT 试剂 （0.8 毫克）。涡流TMT试剂管5分钟，并旋转下来。
3. 将 40 μL TMT 转移到样品管中，并在室温下孵育 1 小时。
   注:在此实验中，通道 126 到 128 被标记为三种未经曼尼托处理的植物的生物复制品，而通道 129 到 131 则标有三种未经曼尼托处理的植物的生物复制品。
4. 加入8 μL的5%羟基胺，孵育15分钟。
5. 在 5 mL 管中混合 6 个样本，并添加 14 μL 的 10% TFA。
6. 在管子中添加 3，876 μL 的 0.1% TFA。漩涡和旋转下来。
7. 将溶液转移到有条件的脱盐柱中进行脱盐。使用蒸发器干燥蒸发器。

3. 准备 IMAC 舞台提示

1. 使用 16 G 钝端针穿透聚丙烯褶皱盘。
   注意:将切割机垂直于磁盘表面，并滚动切割机几次，以确保磁盘完全切除。将磁盘放入培养皿中存储。将针头放入 200 μL 移液器尖端，然后使用柱塞将毛刺推入尖端。
2. 使用柱塞将褶皱轻轻压入尖端，以盖住尖端。
   1. 将炸盘放在具有相同压力的提示中，从而提供更好的可重复性。舞台尖端生产的可重复性对于恒定的背压非常重要，这会影响离心步骤的时机和技术复制之间的可重复性。
   2. 如果舞台提示在调理步骤中显示高压，则丢弃提示以避免在加载样品时潜在的提示堵塞。可能是磁盘被压得太紧了。
3. 倒置 Ni-NTA 旋转柱，放在 1.5 mL 管上。
4. 使用柱塞轻轻按下 Ni-NTA 珠子的褶皱，并将珠子推入管子中。
   注意:请确保轻轻推动碎屑，以避免旋转柱上潜在的珠子丢失或吸附。

4. Hp-RP 阶段提示的准备

1. 使用 C8 磁盘为 IMAC 舞台提示准备 Hp-RP 阶段提示。
   注意:不要在磁盘上施加大力，因为它可能导致密集包装的褶皱，并增加舞台尖端的后压。所有离心步骤在第 4 步中以 1，000 x g 的速度进行 5 分钟。
2. 在 100 μL 100% 甲醇中暂停 1 毫克 C18 珠，并通过尖端传递珠子溶液。
3. 将 20 μL 的缓冲区 8 （80% ACN/20% 200 mM NH₄HCO_2，pH 10.0） 添加到舞台尖端，并通过离心通过尖端通过缓冲器 8。
4. 在舞台尖端添加 20 μL 的缓冲区 A （200 mM NH₄HCO_2），并通过离心通过尖端传递缓冲 A 。
   注意:在使用过程中平衡离心机，并确保 Hp-RP 阶段尖端不会完全干燥。

5. 旋转适配器的准备

1. 使用锋利的末端钳子刺穿 1.5 mL 管盖中央的孔。
2. 将 IMAC 舞台提示或 Hp-RP 舞台提示插入自旋适配器的孔中。
   注意:确保舞台提示不靠近自旋适配器的底部。

6. 使用 IMAC 阶段提示富集磷肽

1. 暂停 10 毫克 Ni-NTA 珠子与 400μL 的加载缓冲区 （6% 醋酸 （AA）， pH 3.0）， 并将所有珠子溶液加载到每个尖端。通过离心将解决方案通过尖端传递。
   注:除步骤6.8外，所有离心步骤均在200 x g 下进行，第6步为3分钟。
2. 装载 100 μL 的 50 mm 乙烯二胺三乙酸 （EDTA）， 从 IMAC 阶段尖端剥离镍离子，并通过离心将溶液通过尖端传递。
3. 将 100 μL 的装载缓冲器加载到舞台尖端，并通过离心将解决方案通过尖端传递。
4. 将 50 mM FeCl₃ 中的 100 μL（6%） 加载到舞台尖端，并通过离心将解决方案传递给尖端。Fe³⁺ 离子将串起到 IMAC 舞台提示。
5. 加载 100 μL 的装载缓冲器，以调节阶段尖端，并通过离心将解决方案通过尖端传递。
6. 加载 100 μL 的装载缓冲区，并准备了第 2.7 步的样品肽到阶段尖端，并通过离心将解决方案通过尖端传递。
   注意:以新管子作为自旋适配器，收集样品的流经，并将流经储存在冰柜中，供将来分析。
7. 将 100 μL 的洗涤缓冲器（4.5% AA 和 25% ACN）加载到舞台尖端，并通过离心将解决方案通过尖端传递。
8. 用加载缓冲器执行第二次清洗。将 100 μL 的装载缓冲器加载到舞台尖端，然后使用 1000 × g 离心机将解决方案传递至端端 3 分钟。
   注意:确保洗涤缓冲区被舞台尖端的加载缓冲器所取代，以消除排洗步骤期间磷肽的损失。在磷肽排出之前平衡 IMAC 阶段尖端，以确保 ACN 浓度低于 5%。
9. 用剪刀修剪 IMAC 舞台尖端，并将修剪过的 IMAC 舞台提示放在 Hp-RP 尖端内。确保两层舞台提示不接触离心机的盖子。

7. 磷肽分馏使用 Hp-RP C18 阶段提示

1. 将 100 μL 的叶芽缓冲液（200 mM 磷酸铵 （NH₄H₂PO_4）添加到修剪过的 IMAC 阶段端，并通过离心的两层阶段提示传递解决方案。
   注意:如果解决方案没有通过阶段提示，则加快旋转速度。所有离心步骤在第 7 步中以 1，000 x g 的速度进行 5 分钟。所有 Hp-RP 缓冲区都列在 表 1中。
2. 使用钳子丢弃 IMAC 舞台提示，并将 20 μL 的缓冲区 A 添加到 Hp-RP 舞台提示中，并通过离心通过尖端通过缓冲区。
   注意:在丢弃之前，确保所有自助缓冲区通过 IMAC 阶段提示。
3. 添加缓冲区 1 的 20 μL 以分馏第 1 部分，并通过离心在新管中收集流出。用缓冲区 2、3、4、5、6、7 和 8 重复该过程，以在新管中收集每个分数。使用真空集中器干燥每个分数的最后一个 eluate。
   注意:准备新的分馏缓冲区。以 8 根新管子作为每个分数的自旋适配器。在不同的自旋适配器中收集每个分数的分量。磷肽在基本条件下不稳定，因此由集中器干燥，或立即酸化10%TFA。

8. LC-MS/MS 分析和数据分析

1. 加入 5 μL 的 0.1% 的氨酸 （FA），并通过质谱仪分析样品。
2. 运行一个90分钟的梯度，每个分数有6-30%的缓冲B（80%ACN和0.1%FA）。
3. 使用高碰撞能量分离 （HCD） 将前 10 种标记的肽碎片。完成数据库搜索以识别磷化站点。
4. 将原始文件加载到 MaxQuant 软件中，命名实验，并设置分数和 PTM。
   注:MaxQuant 软件的教程可在 https://www.maxquant.org/ 找到。
5. 选择记者离子 MS2 在 LC-MS/MS 运行类型和 6 倍 TMT 作为同位素标签。通过 PIF 功能启用过滤器，并将最小 PIF 设置为 0.75。
6. 选择乙酰（蛋白质N术语）、氧化（M）和磷（STY）到可变修改面板。选择卡巴米多美乙基 （C） 作为固定修改。
7. 将消化模式设置为特定，选择 Trypsin / P 作为消化酶，以及两个错过的。
8. 将 PSM 错误发现率 （FDR） 和蛋白质 FDR 设置为 0.01。将改性肽的最低分数设置为 40。
9. 将 阿拉伯塔利亚纳 数据库添加到快速文件面板中，并运行数据库搜索。
10. 完成搜索后，将磷（STY）网站的txt文件加载到波斯软件。
    注:Perseus 软件的详细教程可在 https://www.maxquant.org/perseus/ 找到。
11. 过滤掉反向磷化位点。使用本地化概率 75% 作为截止点过滤掉未本地化磷化站点。
12. 使用磷化位点的强度进行统计分析。

结果

为了演示此工作流程的性能，我们利用 IMAC 阶段提示加上 Hp-RP 阶段尖端分馏来测量野生型和 snrk2-dec 突变幼苗中具有或无需曼尼托治疗的磷蛋白变化 30 分钟。每个样本都是在生物三元体中进行的，实验工作流程以 图1表示。每个样品的消化肽（400微克）被标记为一个TMT-6plex通道，汇总和脱盐。磷肽使用 IMAC 阶段尖端进一步丰富，随后 Hp-RP 阶段尖端将纯化磷肽分成八个...

讨论

植物蛋白质组和磷蛋白质组的动态范围和复杂性仍然是磷蛋白分析深度的限制因素。尽管单运行LC-MS/MS分析能够识别10，000个磷化位点^21，22，但整个植物磷蛋白的覆盖率仍然有限。因此，在分析植物信号网络应对环境压力的全球视图时，需要提供高灵敏度和卓越分离效率的磷蛋白工作流。商用高压液体色谱（HPLC）柱基色谱是MS分析^23、24

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	eppendorf	22431081	Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes
200 µL pipet tip	Gilson	F1739311
2-chloroacetamide	Sigma-Aldrich	C0267
acetic acid	Sigma-Aldrich	5438080100
acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004
ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
ammonium phosphate monbasic	Sigma-Aldrich	216003
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
blunt-ended needle	Hamilton	90516	Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16
C18-AQ beads	Dr. Maisch	ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm
C8 Empore disk	3 M	2214	47 mm
Centrifuge	eppendorf	22620444
chloroform	Sigma-Aldrich	CX1058
data analysis software		Perseus 1.6.2.1	https://maxquant.net/perseus/
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich
formic acid	Sigma-Aldrich	5330020050
Frits	Agilent	12131024	Frits for SPE Cartridges
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933
H2O	Sigma-Aldrich	1153334000
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Iron (III) chloride	Sigma-Aldrich	157740
LTQ-orbitrap	Thermo Fisher Scientific	Velos Pro
mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	LTQ-Orbitrap Velos Pro
methanol	Sigma-Aldrich	34860
nano LC	Thermo Fisher Scientific	Easy-nLC 1000
Ni-NTA spin column	Qiagen	31014
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L9150
plunger	Hamilton	1122-01	Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl)
search engine software		MaxQuant 1.5.4.1	https://www.maxquant.org
SEP-PAK Cartridge 50 mg	Waters	WAT054960
sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
SpeedVac	Thermo Fisher Scientific	SPD121P
TMT 6-plex	Thermo Fisher Scientific	90061
Triethylammonium bicarbonate buffer	Sigma-Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	91707
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C4706
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253