在穆林模型中缺血再灌注损伤后干细胞的心肌内传递延迟

摘要

干细胞作为心肌损伤患者的潜在治疗方法不断被研究，然而，干细胞在损伤组织中生存能力的降低和保留会影响其长期疗效。在这份手稿中，我们描述了一种替代干细胞传递方法，该模型采用缺血再灌注损伤的穆林模型。

摘要

人们对于使用干细胞（SCs）恢复心肌损伤个体的心脏功能有着浓厚的兴趣。最常见的是，心脏干细胞治疗是通过将SC同时与心肌损伤诱导同时提供来研究。然而，这种方法存在两个显著限制:早期敌对的亲炎缺血环境可能会影响移植的SC的生存，并且它并不代表可能使用SC的亚急性梗塞情景。在这里，我们描述了一个两部分的手术程序系列，用于诱导缺血-再灌注损伤和传递中质干细胞（MSCs）。这种干细胞管理方法可以通过规避最初的免疫反应，使受损组织周围的生存能力和保留时间更长。在小鼠中诱导了缺血再灌注损伤的模型，并伴之以间质干细胞（3.0 x 10^{5），稳定}地表达着记者基因萤火虫荧光酶在构成表达CMV促进剂下，7天后在心内。通过超声波和生物发光成像分别对动物进行成像，以确认损伤和细胞注射。重要的是，在执行此两程序方法进行 SC 交付时，没有增加的并发症率。这种干细胞施用方法，与利用最先进的报告基因一起，可能允许在临床上常见的慢性缺血情况下，在体内研究移植的SC的生存能力和保留，同时规避最初的亲炎反应。总之，我们建立了一个协议，延迟将干细胞传递到心肌，这可以用来作为促进受损组织再生的潜在新方法。

引言

心血管疾病仍然是全世界发病率和死亡率的最常见原因。心脏缺血事件被发现有害于心肌和周围细胞^{1的整体功能}。只有̴0.45-1.0%的心肌细胞在心肌损伤发生后每年再生^。尽管不断增长的需求和固有的重点开发治疗，治疗帮助受伤组织再生已经很难建立，仍然需要进一步优化^{3，4，5。,4,5}干细胞疗法已被引入，作为在缺血事件后恢复受损组织活力的替代途径;然而，这些疗法的进步已经受到有限的生存和保留细胞到受伤区域^6的挑战。

缺血事件后心脏的微环境可以定性为缺氧、亲氧化和亲炎，为治疗干细胞适应^{生存7，8的}敌对^条件。由于免疫反应在受伤后触发，天真的淋巴细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和乳腺细胞试图通过去除垂死的细胞和调节组织重塑^{9，10，119,}的过程^{来修复损伤}。在缺血后的第一个3天内，炎症处于高峰期，在^10，12区释放大量嗜中性粒细胞和单核细胞^{的亲炎细胞因子}。7天后，大部分炎症已经消退，向修复细胞的过渡开始，一直持续到重塑级联完成，大约14天在小鼠^13。我们的手术方法是将生物制剂引入心肌中，以绕过缺血再灌注损伤后的峰值先天免疫反应的一种潜在替代方法。同时，它将允许研究任何治疗在亚急性/慢性缺血的情况，其中可能有不同的变量要考虑相比，急性心肌梗死。

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研究方案

实验对雌性C57BL/6小鼠进行，年龄为10-12周，体重为20-25克。所有动物程序均符合《实验室动物护理和使用指南》（美国国家科学院实验室动物资源研究所、美国医学博士所贝塞斯达）中规定的标准，并经梅奥诊所医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 准备和插管

1. 手术前将所有手术器械都去处理。如果要在一次手术中进行多次手术，请在每个动物之后清洁仪器，并使用热珠消毒器重新消毒。
2. 在感应室中，用 1 L/min O₂ 的 3.5-4% 异氟兰麻醉小鼠。
3. 在皮下管理丁丙诺啡SR 1毫克/千克（镇痛），称量动物，然后将重量输入呼吸机。
4. 将胸部左侧从胸骨剃到肩部水平，并涂抹脱毛霜以去除多余的毛皮。
5. 对于缺血再灌注程序，在 2 cmH₂O 下保持呼吸机上的正端呼出压力 （PEEP）。对于延迟注射细胞的程序将 PEEP 更改为 3 cmH₂O，以防止肺衰竭。
6. 使用20G气管对动物进行插管，转移到受控加热垫上，以保持35-37°C的体温。
7. 将鼠标放在呼吸机上，在横向的直拨处，在左侧的颅端和右侧的颅端。
8. 在手术的剩余时间里，在1升/分钟O2时保持_2-2.5% 的麻醉。
9. 在波维酮-碘和酒精拭子之间交替擦洗手术区域三次，将眼科软膏涂抹到两只眼睛上。

2. 缺血再灌注损伤

1. 使用#10刀在视野中最左侧的奶嘴右侧进行垂直切口 2.5 mm。
2. 使用剪刀切开表面肌肉层，直到肉间肌肉和肋骨可见。
3. 提起肋骨和周围组织时，切开第 4 排骨和 5 根肋骨之间的间空间，然后将眼睑缩回器插入开放空间。
4. 使用弯曲钳子收回肺，将肺向上移动并离开视野。
5. 可视化LAD动脉，并使用9-0尼龙缝合线，通过动脉下方的肌钙2.5毫米，到左牙，并绑一个松散的方结。
6. 切割 1 厘米的聚乙烯管，并放在松动的结中。
7. 将缝合线固定在管子周围，确认缺血，35分钟后释放。
   注:通过心律失常和心室心律失常确认缺血。
8. 松开连接并取出管子后，等待 5 分钟以确认心肌的再灌注。
9. 将一个 24 G I.V. 导管管放入胸腔，一个开口右侧的间腔空间。
10. 以简单的中断图案，用 6-0 可吸收的缝合线关闭成本间切口。
11. 以连续缝合图案用 6-0 可吸收缝合关闭肌肉层。
12. 关闭表面肌肉层后，使用 1 mL 结核素注射器从胸腔中抽出空气时，取出胸管。
13. 以连续水平床垫图案的 6-0 可吸收缝合关闭皮肤切口
    注:尼龙缝合线和不连续缝合图案也可用于皮肤层。
14. 以皮下管理1.5 mL的暖盐水，并在切口部位涂抹三联抗生素软膏，防止感染。
15. 关闭异氟，让动物通过呼吸机在100%O₂ 上呼吸，直到它可以在没有辅助的情况下连续呼吸。
16. 将鼠标转移到无床上用品的笼子或带盖被铺（纸巾或窗帘）的笼子，放在温度为 35-37 °C 的温垫上，直到完全恢复。

3. 小鼠细胞质干细胞输送

注:用于手术的小鼠菌株是近亲繁殖的线，被认为在基因上相同。从同一菌株的动物身上获得中质干细胞，根据方案设计，免疫抑制没有诱导^1。

1. 完成第一个过程之前所做的准备和插管步骤。
2. 用剪刀和钳子从皮肤层上取下缝合线。
3. 用#10手术，在和上一个手术相同的位置做切口。
4. 继续使用手术刀切穿疤痕组织，直到肌肉层缝合可见
5. 使用剪刀和钳子取出缝合线，将肌肉层切开。
6. 可视化并去除将肋骨放在一起的缝合线，然后继续从上一个切口中切开成本间肌肉。
   注:肺可能粘附在胸壁上，如果发生这种情况，使用钝或弯曲钳小心分离并释放它们。
7. 将眼睑缩回器放入成本间空间，并找到上一个结扎区域。
8. 将悬浮在20μL PBS中的中分质干细胞（3.0 x 10^5）加载到30G胰岛素注射器中，根据需要稍微弯曲针头以进行适当的注射。
   注:从4-6周大的C56BL/6小鼠的脂肪组织中分离出月体干细胞（MSCs）。早期通过细胞（p3）被转导，在CMV启动子下用表达萤火虫荧光酶基因的载体进行传化，以允许体内细胞活力监测。脂肪衍生小鼠MSC的特点是流动细胞学，细胞对CD44、CD29、CD90和CD105呈阳性，但造血标记^{CD4514为阴性}。在注射之前，MSC被培养至少一个通道，以避免从解冻过程中细胞损失。
9. 从顶点向心脏底部移动，将注射器插入近外侧区域，直到针头开口完全在心肌内。
10. 一旦进入慢慢注入细胞到心肌，等待3s，然后取出针。
11. 仔细观察心脏3分钟，确保对细胞没有异常反应，如心室颤动。
12. 将一个 24 G IV 导管管放入胸腔，在开口右侧放置一个间腔空间。
13. 关闭科胸间、肌肉和皮肤层，并采用与第一次手术相同的方法取出胸管。
14. 以皮下管理1.5 mL的暖盐水，并在切口部位涂抹三联抗生素软膏，防止感染。
15. 关闭异氟，让动物通过呼吸机在100%O₂ 上呼吸，直到它能够连续呼吸没有援助。
16. 将鼠标转移到无床上用品的笼子或带盖被铺（纸巾或窗帘）的笼子，放在温度为 35-37 °C 的温垫上，直到完全恢复。

4. 遵循这两种程序进行术后护理

1. 持续观察动物，直到自发呼吸、胸围和正常运动建立。
2. 每15-30分钟继续观察，手术当天至少3小时。
3. 每天检查小鼠伤口脱皮或异常疼痛5天，然后每周2-3次。
4. 如果动物在手术后72小时出现疼痛迹象（即弓背、最小运动、脸色或毛茸茸），请额外服用布丙诺啡SR镇痛剂。

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结果

第0天，小鼠诱发缺血再灌注损伤，在干细胞植入前一天进行术后超声心动图和心电图。超声波和心电图分析证实梗死和心室收缩功能下降（图1A-D）。进一步检查数据显示，接受缺血性损伤的小鼠的弹射分数和分数缩短率降低，而末体舒张和收缩量增加（表1）。与正常小鼠心脏（图2A）相比，马森三色染色心肌组织7天后受伤（...

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讨论

全世界有8500多万人患有^{心血管疾病}。这些缺血事件的高流行率值得进一步发展和扩大替代疗法，以促进受损组织的再生。传统方法利用缺血再灌注程序在急性环境中，随后给予治疗^1。炎症反应处于3-4天之间的高峰期，在心脏缺血事件后，与嗜中性粒细胞，巨噬细胞，和增加细胞因子信号^10，12,的^渗透。在这一段死细?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl Irrigation, USP	Baxter	0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" IV catheter tube	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringe	BD	305500	Injection of analgesic
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe	Ulticare	08222.0933.56	Injection of stem cells
6-0 S-29, 12" Vicryl suture	Ethicon	J556G	Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure
9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture	Ethicon	2829G	Ligation of the LAD artery
Absorbent underpad	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	For underneath the animal
Alcohol prep pads, 2 ply, medium	Coviden	6818
Anti-fog face mask	Halyard	49235
Bonn Strabismus scissors, curved, blunt	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity).
Castroviejo needle holders, curved	Fine Science Tools	12061-01
Curity sterile gauze sponges	Coviden	397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bent	Fine Science Tools	11063-07
Electric Razor	Wahl		Fur removal
Isoflurane 100 ml	Cardinal Health	PI23238	Anesthetic
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringe	Coviden	8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)	Fine Science Tools	11370-31
Moria speculum retractor	Fine Science Tools	17370-53
Mouse endotracheal intubation kit	Kent Scientific
Nair depilatory cream	Johnson & Johnson		Fur removal
Optixcare eye lube plus	Aventix		Sterile ocular lubricant
Physiosuite ventilator	Kent Scientific
PolyE Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	72-0191	Temporary compression of LAD artery
Povidone-iodine swabs	PDI	S41125
Scalpel, 10-blade	Bard-Parker	371610
Sterile 3" cotton tipped applicators	Cardinal Health	C15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicators	Puritan	25-826-5WC
Sterile gloves	Cardinal Health	N8830
Sterilization pouches	Medline	MPP100525GS
Surgery cap
Surgical Microscope	Leica	M125
Suture tying forceps, straight (x2)	Fine Science Tools	10825-10
Transpore surgical tape	3M	1527-1
Triple antibiotic ointment	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	Topical application to prevent infection
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo vaporizer	Kent Scientific