研究屈化强化疗法

摘要

所提出的实验协议可用于对细胞培养装置中的腔活性进行实时测量，以便能够调查成功提供药物和/或其他生物效应所需的条件。

摘要

对超声波治疗应用的兴趣是显著且不断增长的，潜在的临床目标从癌症到阿尔茨海默病不等。气穴化 - 超声场内气泡的形成和随后运动 - 是支撑许多此类治疗的关键现象。然而，在空腔促进治疗效果的详细作用机制方面仍然存在相当大的不确定性，需要开发可靠的监测技术，以便临床实施。特别是，在报告的暴露参数研究成功提供治疗效果和相应的声学排放之间存在显著差异。本文的目的是提供设计指南和实验方案，使用广泛可用的组件进行气穴介导生物效应的研究，并包括实时声学监测。希望该议定书能够更广泛地将声学监测纳入治疗性超声波实验，并有助于在暴露条件及其与相关生物效应相关性的研究之间进行更简单的比较。

引言

超声波（美国）由于其安全性和非侵入性、患者床边的易于实施以及^{成本效益，}被广泛用作诊断成像技术。除了诊断和监测能力外，美国在治疗应用方面具有相当大的潜力。早期工作探索了它在血栓溶解中的使用， DNA传染和药物输送^2，3，4和治疗美国现在代表一个非常活跃的研究领域，应用包括肿瘤治疗^5，6，7，免疫疗法^8，9，血脑屏障（BBB）中断10，11，12，血栓溶解13，14，15，和细菌感染治疗16，17。支撑这些应用的一个关键现象是气穴:由于流体压力^18、19的变化，气腔的核^化、生长和振荡。

有一系列机制，通过它，空穴产生生物效应。例如，受应用的美国领域影响，气泡振荡的高度非线性可以在周围的液体中产生微流，既能增强药物对流^20，又能对气泡附近的组织施加剪切应力。当气泡在边界附近时，这种情况尤其普遍，导致气泡在非球形地振荡，并可能通过剪切诱发的渗透^{21、22、23、24}促进药物的吸收。在较高的压力下，观察到较大的振幅振荡和快速气泡崩塌，直接产生机械应力^25，并频繁产生冲击波，并由此产生大的压力梯度，可以破坏和渗透组织26，27。表面附近的气泡破裂也可能导致高速液体微喷射器^{的形成28、29、30。}这些微喷射可以穿透组织，可能产生毛孔或诱导继发应力波31，32。生物膜在组织和细胞水平上的渗透被称为声素沉着症，主要用于美国诱导的皮肤渗透性^{增强33、34}和声波化，主要用于描述细胞膜因形成膜毛孔^35、36而引起的可逆渗透。

粘液吸收在液体周围紧接着的振荡气泡可以产生实质性的加热效果^37。此外，高度非线性振荡产生的声学辐射频率高于驱动美国领域。这导致周围组织的吸收增加，并进一步加热^38。气泡破裂也可能伴随着化学效应，由于气泡核心的瞬时高温和压力，如产生高反应物种和电磁辐射，称为声发光^32。这些影响已被调查，以评估潜在的损害和/或激活相关的细胞通路交付³⁹和利用在当地激活光敏药物的方法称为声动力疗法40，41，42，43。

许多美国调解的生物效应可能仅通过控制美国场参数（压力振幅、频率、脉冲长度和重复频率以及暴露持续时间）而启动，但可靠地在生物组织中产生空腔通常需要高投入能量，因此具有较高的损伤风险。引入外源性或人工气穴核可能会大大降低产生上述广泛效果所需的输入能量，并进一步引入可能仅靠美国无法达到的其他效果。气泡核包括气泡^26、44、液滴^45、46、47和固体颗粒48、49、50，纳米级气泡核是研究的新兴领域，其优点是循环时间长、外泄改善和长期空腔活动49、51、52、53。

最常用的核是气体微泡（MBs），最初用作诊断成像中的对比剂。它们通常直径为1-2微米，包含高分子量气体的核心，周围介质中低含血性。核心周围有一个保护性脂质，蛋白质，或聚合物壳，最常见的由磷脂⁵⁴组成。当暴露在美国领域时，MBs 的可压缩性会导致它们经历体积振荡，从而产生强烈的声学散射，这是 MBs 作为对比剂的成功原因。如前所述，这些振荡还会导致上述机械、热和化学效应，可用于治疗应用。MB 涂层过程还提供了一个机制，用于在 MB 结构内封装药物，并将药物和/或目标物种连接到 MB 表面。这项技术有助于药物的触发释放，以减少全身毒性^55。最近还表明，从MB表面的材料可以转移到生物结构，通过所谓的"索诺打印^{"56，57，58}加强药物输送。

监测美国调解的空腔活动可以深入了解由此产生的体外和体内生物效应，并有可能使这些影响的调整和优化。监测气泡活动的两种应用最广泛的方法是:（一）光学，它使用超高速视频显微镜，在体内通常不可行: 二）声学，记录振荡和/或坍塌气泡产生的重新辐射声场。声学信号的振幅和频率组件都包含有关气泡行为的信息。低事故美国振幅下低浓度气泡已证明主要产生谐波排放（驾驶频率的整数倍数^）59。随着驱动压力的增加，气泡发射光谱可能还包含称为亚和声波和超谐波⁶⁰ 的分数组件，这些组件表示更强的非线性行为，以及表示惯性空腔的宽带噪声。整数谐波是气泡振荡的主要指标，但也可能是由实验系统中任何地方的非线性引起的，例如，由于非线性传播。相比之下，分数谐波和宽带噪声与气泡动力学密切相关。

气泡行为与探测声学排放的关系可能因事件美国场、核环境、探测路径⁶⁰的特性等因素而复杂化。然而，通过辨别声谱中频率和能量的趋势，可以获取有关气泡行为及其与细胞相互作用的重要信息。这些数据还可以提供有价值的信息，可用于形成临床治疗监测技术的基础。为了充分利用这些信息，需要开发强大、可翻译和可重复的实验方法。

目前，报告的系统设计协议和开展支持空腔辅助疗法开发的研究存在重大差异。就设备而言，已经采取了一系列设计方法。几个组已经利用平行板室56，61，62，63，无论是定制或商业可用（如OptiCell，瑟莫菲舍尔科学）。胡等人（2013年）开发了一个细胞室，结合美国声波模块和实时对焦成像^64，卡鲁戈等人。 （2015） 使用一个系统，包括一个市售的细胞培养盘与定制的PDMS盖，允许在美国曝光⁶⁵期间在水浴中潜水，和Pereno等人（2018年）使用一个设备，由分层的醋化共振器，允许气泡动力学和气泡细胞相互作用的同步光学和声学特征^66。自定义制造和应用特定设计的使用使美国领域和其他环境暴露条件的描述复杂化，使得交叉研究比较具有挑战性。例如，为成功实现声波化而确定的美国参数存在相当大的差异，包括 0.02 至 15 MHz 的中心频率、从 1% 到连续波的值周期以及 0.1 到 20 MPa 23、64、67、68、69、70（表 1）的罕见成量压力。光谱成分（谐波、亚谐波等）也有类似的显著变化，这些成分已被确定为与特定的生物效应有关。

因此，这项工作的目的是为空腔诱导细胞生物效应的体外研究提供一个易于重复的系统设计和实施框架，并具体纳入空腔监测能力。

研究方案

1. 系统设计原则

注:本节介绍了用于创建美国暴露和空腔监测系统的设计原则。这些原理用两个现有的声学传输系统（SAT）来说明（如 图1所示）。每个系统由一个细胞暴露舱、一个美国源和一个单一元件传感器组成，作为被动腔检测器 （PCD）工作，所有这些都集成到台面测试室中。这些设计建立在卡鲁戈等人描述的先前系统开发的基础上（2015）⁶⁵。

1. 最大限度地方便使用。
   1. 利用现有的商用细胞培养设备作为播种/生长基材，使细胞暴露舱与现有培养技术和成像系统兼容。
      1. 对于 SAT2，请使用培养皿（直径 35 毫米，其中 21 毫米直径区域可观察到，参见 材料表）。
      2. 对于 SAT3，请使用跨井插入（直径 6.5 毫米，参见 材料表）。Transwells 有一个透水膜，因此需要放置在细胞介质中，而不是水中。
2. 实现细胞暴露舱的快速加载和密封。
   1. 通过按压在培养皿上安装一个灵活的聚合物盖子（Carugo 等人 2015^65）组成 SAT2 细胞暴露室。如 图1C所示，盖子有一对直径为1.2毫米的孔，允许用18G钝针注射器填充隔间。灌装后，用短塑料棒（材料表）密封这些填充端口。
   2. 用注射器或移液器填充 SAT3 隔间，并通过按压安装橡胶塞 / 密封。
   3. 使密封的细胞暴露舱快速加载到测试室中。细胞暴露隔间的支架内置于腔盖中，其中光压合足以确保正确对齐。在 图 1中显示的系统中，当预先准备了多个细胞暴露隔间时，样品更改的时间可能短至 20 秒。
   4. 最大限度地减少室内体积，使系统便携，并最大限度地减少所需的水/介质量。这样做还可以加速从细胞暴露舱意外溢出或空腔剂泄漏中恢复。
      注:SAT2 内部音量约为 0.8 L。SAT3 内部音量约为 7.6 L - 更大，可轻松加载和更改源传感器或其配置。增加了0.3升的内部腔室，以尽量减少一次性体积，并允许使用水箱注水（如细胞培养介质）以外的生物相关液体。内部室底由30μm厚的骨髓板制成，以允许最大的声学传输。
   5. 尽可能使腔室和内部组件出光学透明材料，以便能够快速观察和纠正任何问题（如泄漏、缠入的宏泡）。
3. 最大限度地提高暴露舱的声学可传播性。
   1. 通过选择隔间墙材料和厚度，最大限度地提高可传输性。假设墙两侧的液体基本相同（例如水），正常发生压力传输系数⁷¹ 的大小为:
      ，其中λ是厚度 L的墙体的波长 ，z_L 和 z_o 分别是墙体材料和液体的特征障碍（密度和音速的产物）。T = 1 表示完美的传输。
   2. 对于空腔的广谱监测（例如，1-8 MHz），如果材料厚度小于材料波长的 1/10，大多数实验室聚合物（如 PDMS、PTFE、聚苯乙烯）将改变传输压力不超过 10%。这种情况可能难以满足高频率的标准耗材（例如，8 MHz 的#1.5 覆盖滑动），因此预测或直接校准传输频率响应是好的做法。
   3. 对于将美国源信号传输到细胞暴露舱的窄带传输，如果该层材料中大约是半波长的整数倍，则允许更厚的层。例如，SAT2 中的 PDMS 盖在厚度为 2.0 mm（+2 波长为 1MHz，c_PDMS ±1000 m/s）。
4. 通过选择源和细胞环境，最大限度地扩大暴露区域。
   1. 为了最大限度地增加暴露的细胞数量，使细胞附着的面积尽可能宽，同时保持与可用的培养和成像设备的兼容性。
   2. 使用具有最小空间变异的单元间连接区域的美国源，使用大焦源 （SAT2） 的预焦区域或主叶宽度与细胞连接区域 （SAT3） 直径相匹配的聚焦或透镜源。有关特定来源，请参阅 材料表 。
   3. 通过机械地支撑远离事件场最强部分的单元间，最大限度地降低支架的散射横截面或将吸收材料放置在支架上，最大限度地降低单元间支架引入的场复杂性。示例显示在 图 1A 和 1D中。
5. 确保可重复的暴露条件。
   1. 在固定边界中终止声学场，以消除部分填充腔室中空气-水接口可能产生的变异性。在 SAT2 和 3 中，通过在腔室盖上安装声学吸收器（见 材料表）来实现此目的，从而进一步降低边界反射可能产生的场复杂性。
   2. 在放大器输出/源输入时监控并记录源驱动电压，以便快速检测到轻微的变异性或重大故障。使用电压探头或其他安全用于驱动器电压范围的设备。使用众所周知的源（如波形发生器）定期检查电压探头的校准。
   3. 控制、监控和记录房间的温度及其内容。细胞、转导器和传播介质的反应可能都对温度敏感。在 SAT2 中，通过连接到水调节系统的一对循环端口进行监控，而 SAT3 则使用水族馆加热器（未显示）。根据需要设置水温，以模拟治疗应用的相关生理条件。
      注意:内部温度可能会因外部因素以及美国产生的传感器和介质加热而变化。
   4. 小心地去气室液体，以尽量减少意外的气泡和/或从传播路径中预先存在的气泡散射的可能性。
      注意:如果不进行脱气，例如由于对细胞的负面影响，那么气泡活动的背景水平就会提高，这是合适的。
6. 校准完全组装的系统。
   1. 包括测量暴露细胞上的压力场事件的方法，当所有系统组件都到位时，包括细胞暴露舱。在 SAT2 和 3 中，通过在腔室盖中打开一个开口，可以插入针头或光纤水听器，而不会干扰要测量的磁场。使测量尽可能靠近细胞的位置。
   2. 选择半径为敏感的水听器_（rcv）足够小，不会误报正在测量的压力场。可接受的大小是源频率（f）和半径_{（src） 以及}源和字段扫描（z_rcv）之间的距离。水听器尺寸选择的一般标准是 :，导致 :，其中c是音速^72。
   3. 确保水听器在系统特征（包括第 1.6 节中指定的温度）中使用的条件下校准。具体来说，如果水听器与扫描平面的角度保持，则水听器必须按该角度校准，因为直接影响可能与纯基于几何形状的预期效果有显著差异。水听器对温度的敏感性变化应从制造商获得。
   4. 扫描细胞可能暴露的整个区域。要捕获适当的字段详细信息级别，请使用不超过波长 1/5^的 扫描间距，以最高频率感兴趣。如果观察到意外的现场复杂性，请考虑使用短突发信号（例如，1-3 个周期），以便识别和量化直接和分散的现场贡献。
7. 纳入空腔监测功能。
   1. 确定监控传感器类型和位置，作为整个系统设计的一部分，而不是作为改造。实际上，这会导致系统在不牺牲可靠对齐关键系统组件的能力的情况下实现最大限度的紧凑。
   2. 将空腔监测设备放置在系统中，以便以最小的附加设置时间或对工作流的干扰重复定位。在 SAT2 中，通过安装在腔盖中的 PCD 的单个元素压电传感器来完成此目的，而 SAT3 使用 90° 反射器将 PCD 集成到源底座中。
   3. 根据实验目标选择 PCD 形状。在 图 2中，对未聚焦（左）和聚焦（右）设备的半振幅轮廓的计算显示了空间灵敏度在频率方面的深刻差异。非聚焦设备更适合大容量监控，在频率方面空间变化不大，而聚焦设备更适合在感兴趣的频率下进行更径向紧凑的测量。
   4. 选择 PCD 中心频率和带宽以适应实验的需要。中心频率通常选择至少是美国来源的五倍，以尽量减少对直接源排放的敏感度。带宽通常最大化，以观察广泛的气泡行为（谐波和宽带噪声）。
   5. 选择调理、记录和处理方法，以便分析下一节中描述的空腔数据。

2. 屈化监测仪器和处理

注:本节介绍了建议收集空穴监测数据的信号流组件和功能，以及导致对空穴活动进行定性和定量评估的数据处理。

1. 仪器仪表（另见图3）。
   1. 除非应用程序需要定制设备，否则从各种市售的单元素转导器中选择 PCD，通常用于对淹没目标进行无损测试。这些供应商也有电缆和配件（例如，SAT3 中的镜面反射器）。
   2. 最大限度地减少PCD对美国来源的反应。这可以通过选择 PCD（中频和带宽）以及使用缺口或高通滤清器来完成。后者可作为独立模块或信号调节设备的一部分实现。
   3. 使用动态范围大的数字化器（至少 12 位）捕获尽可能多的数据，以最小的信号剪报和最大信号与噪声比 （SNR） 的最小可能性。比较设备时，请查看信号与噪声和失真以及/或有效位数的规格，因为这些是可实现动态范围的更完整的描述。还要考虑内存缓冲器的大小是否足以满足所需的长度和数据捕获速率。
   4. 优化数字化器动态范围的使用。PCD 信号可能涵盖多个数量级，既因为长时间暴露（因为气泡被消除），也因为在美国不同的驱动水平下进行实验。因此，有必要检查信号调理链是否对所有信号进行缩放，以便正确记录这些信号。
   5. 在信号链中加入一个预放大器，以便能够充分捕获最小的预期信号。根据我们的经验，PCD 自噪声远远低于大多数数字化器，因此适度的预放大（例如，<100 倍）仍然可以改善最终结果的 SNR。
   6. 在预增之前过滤美国源频率，以避免放大器饱和。
   7. 如果使用美国脉冲器/接收器提供增益和/或过滤功能，请在脉冲器模式下使用它来确认路径长度/对齐，或检查 PCD 和细胞暴露舱之间的传播路径中是否有意外的散射器。
   8. 启用实时数据流式传输到存储。SAT2 和 SAT3 系统均采用 12 位流式 USB 示波器（参见 材料表），具有便携性和精心构建的用户界面的便利性。
   9. 确认信号链中的适当阻抗匹配，以避免增益或带宽错误。PCD 设备通常输出障碍接近 50 欧姆，因此适当的过程是用波形发生器的已知信号（50 ohm 输出阻抗）替换 PCD，并确认数字化器上显示的信号大小与预期相符，当注入的信号发生变化时，可线性地进行缩放，并且不会观察到最大兴趣信号的剪切。
2. 预处理
   1. 更正原始电压信号，以了解与处理感兴趣频率范围内的数据相关的信号路径中所有已知的增益和灵敏度。
   2. 如果数据是用直流输入耦合记录的，或者以其他方式显示 DC 偏移，则通过直接减法或高通路滤镜删除此偏移。
3. 计算每个记录信号的功率谱P。
   1. 设置 Fourier 转换长度N_英尺，以便美国源f₀的基本频率是转换箱宽度的大整数倍数:N_英尺=   nf_s/f_0，其中n是整数，f_s是数字化数据的示例频率。设置n ≥ 50 以清晰捕获光谱特征。例如，在 50 MHz 下采样 1 MHz 基本，N_英尺为 2500，箱宽为 0.02 MHz。
   2. 由于转换长度N_英尺通常小于记录信号的持续时间，因此使用功率光谱密度（PSD）估计器，如韦尔奇的方法⁷³。跨越 f1-f ₂的频段中的电源是 ，其中 dF是转换箱宽度。
   3. 要描述每次暴露期间的气泡活动，请估计 f 0 整数倍（谐波）、f_0/2（超谐波）的奇数整数倍和宽带噪声（惯性空腔）对功率光谱的贡献。
   4. 谐波和超和谐内容最简单地通过选择特定频率的功率光谱值来估计。但是，大振幅色调响应可能会扩散到少量相邻的频率箱（例如 f0 ± 2-3），因此这些响应应包含在窄频段功率计算中，并排除在宽带计算之外。
   5. 通过减去总功率谱的谐波和超谐波贡献来估计宽带频段的空腔功率。或者，这些贡献可以使用更复杂的预处理⁷⁴估计。
   6. 估计暴露期间的累积气泡信号能量，最好是根据光谱特征/气泡活动类型。
   7. 假设所有数据记录的持续时间都相等，则记录数据中的累积能量为 M表示记录数。
   8. 如果记录之间存在间隙，当曝光是连续的，并且保存的文件捕获总曝光持续时间 T_e的一小部分时可能发生的，则累积能量可以估计为
   9. 通过将频谱水平与在没有美国的情况下记录的背景噪声水平进行比较来估计测量 SNR。

3. 实验议定书

1. 周六准备
   1. 通过在 -10⁵ Pa 的压力下将填充液体（通常是过滤水）脱气至少两个小时，最大限度地降低传播路径中空穴来水的可能性。建议使用溶解氧探针确认部分氧气压力低于 10 kPa。
   2. 缓慢填充测试室，以尽量减少空气重新引入脱气液。如有必要，继续对填充的腔室进行脱气。
   3. 填充后立即清除传感器和介质容器表面的所有残余气泡，并在开始暴露实验之前再次清除。
   4. 在开始暴露实验之前，确保舱室温度及其内含物稳定下来。
   5. 允许美国源功率放大器预热（根据制造商的建议），以便收益和输出在时间上保持稳定。
2. 暴露舱准备
   1. 屈化剂暂停
      1. 稀释气穴剂时，轻轻连续搅拌，使其均匀悬架，而不会诱捕巨泡或破坏制剂（特别是如果它们是壳泡泡）。
      2. 在与 MBs 合作时，使用可用的最大仪表针缓慢地提取和分配，以尽量减少装载过程中的破坏⁷⁵。18 G 钝填充针已定期用于 SAT 系统。
3. SAT2 准备
   1. 在使用活细胞实验之前，先对 PDMS 盖进行消毒。
   2. 通过按将 PDMS 盖子安装到培养皿上，形成细胞暴露隔间。
   3. 用18G钝针准备注射器，并加满约10mL的液体（例如MB悬架或水控制）。
   4. 将针头插入其中一个 PDMS 填充孔，然后缓慢填充腔室，倾斜，使宏气泡通过开孔逸出。为了获得最佳效果，请倾斜腔室，使开孔位于填充孔上方。
   5. 填充后，通过插入短（4-5 毫米）聚合物棒关闭开孔。设置装配，使两个孔都是水平的。
   6. 在注射额外液体时取出钝填充针，以免空气被吸收。用另一根聚合物棒关闭孔。此过程完成细胞暴露隔间的密封。
   7. 目视检查隔间是否有被包裹的巨泡的证据，如果发现任何证据，请重复 3.3.3.-3.3.6。
   8. 按压将细胞暴露隔间安装在隔间支架中。将腔盖安装在房间顶部。以水平角度降低盖子会阻止大泡在水下部件（吸收器、支架）上休息。
   9. 在决定细胞暴露舱（例如漂浮气泡或下沉的纳米粒子）的方向时，考虑悬浮粒子的浮力，以及这将如何影响它们与细胞的接触。
   10. 在所有操作中，尽可能少地使用力，以尽量减少细胞生长表面的弯曲和细胞的分离。
4. SAT3 准备
   1. 向特兰斯韦尔灌满约 150 μL 的液体（例如 MB 悬浮液或水控制液）。
   2. 通过用橡胶塞小心密封透水井，用干净的纸巾或擦拭去除任何溢出液体，形成细胞暴露室。在使用活细胞实验之前，对橡胶塞进行消毒。
   3. 目视检查隔间是否有被包裹的宏泡的证据，如果发现任何证据，请取出插头，取出大泡并重复 4.4.2。
   4. 按压将细胞暴露隔间安装在隔间支架中。将腔盖安装在房间顶部。以水平角度降低盖子会阻止大泡在水下部件（吸收器、支架）上休息。
      注意:如上所述，巨泡可能会对美国暴露实验造成各种不可重复的、潜在的有害影响。最关键的是，被困在细胞暴露室中的巨泡可能导致PCD反应和局部细胞生物效应，这些反应并不代表预期的治疗。在启动美国实验之前，始终可视地检查所有系统组件，以查找和删除大泡沫。

4. 数据收集

1. 通过对充满控制液（如脱气水或细胞介质）的细胞暴露舱进行初步实验，建立背景PCD响应水平。
2. 记录 PCD 数据，而不推动美国来源建立背景电子噪声水平。
3. 在将美国源以计划驱动级别的全系列驱动级别驱动时记录 PCD 数据。此数据将指示声学响应的哪些部分与随后要测试的空腔剂无关。
   注:如果不去气，常见的实验室液体（如PBS或细胞介质）将表现出中等压力的气泡（如0.5 MPa在0.5 MHz）。
4. 在开始测量之前，给悬挂时间与室温热平衡。细针热电偶可能对此很有用。
5. 实时监控时间和频率域的实验。
   1. PCD 的时间域监控显示当前仪器设置的信号大小是否适当。具体来说，要避免信号剪报，因为它将作为多音谐波响应出现在频率域中。
   2. PCD 的时间域监测还显示，根据从美国源到 PCD 暴露舱的传播时间，是否比预期更早看到空穴信号。如果看到此类信号，这可能表示空腔剂泄漏到测试室。
   3. PCD 的频率域监测表示气泡行为的类型，可用于根据需要调整驱动级别以实现所需的细胞刺激（例如，降低谐波激发的驱动水平）。
6. 为确保不会错过第一次曝光，请在打开美国源驱动信号之前启动数据收集过程。
7. 在整个实验中监控驱动美国源（而不是波形发生器输出）的放大器输出信号，以确保暴露按预期进行。使用高压探头进行此测量，并确保示波器设置为补偿探头衰减。
8. 暴露样品后，小心地将其从测试室中取出。
   1. 拆下并清洁 PDMS 盖 （SAT2） /橡胶插头 （SAT3），为后续使用做好准备。
   2. 根据后续分析（如显微镜、荧光成像）所需的传输培养皿 （SAT2） /透水井 （SAT3）。
   3. 在少量曝光（例如，3-5）之后，重新获取基线空腔信号（在没有空腔剂的情况下）并与原始数据集进行比较以确保腔介质未受到污染是一种良好做法。

结果

图4显示了时间和频率域PCD响应的示例，说明了三种不同的空穴行为。所有数据均使用 SonoVue MBs 在 PBS 中稀释 5 倍在 SAT3 上收集，最终浓度为 ±2*10⁷ MB/ml。本节中所有示例的温度为 19 ± 1 °C。 美国源在0.5 MHz驱动2.0毫秒脉冲，达到0.20（图4A和4B）、0.30（图4C和4D）和0.70 MPa（图4E和4F）的事故峰值负压。信号记录开始于美国脉冲的 t = 0 开始前 1.4 毫秒。内置的痕迹显示信号为记录（红色），并带有 2 MHz 高通滤清器（蓝色），时间窗口集中在从源到单元暴露舱到 PCD 的飞行时间窗口。在此之前的低级别响应是由于直接接收来自源的辐射，这在 PCD 落后于美国源的配置中很常见。

在最低事件压力下，PCD 响应完全由 0.5 MHz 基本美国频率的整数谐波组成。从 0.20 增加到 0.30 MPa，除了进一步提升整数谐波外，还会导致频谱中明显的超谐波。这两种压力的时间域波形看起来相似，尽管 0.30 MPa 结果显示脉冲持续时间的变异性更大。在最大压力下，由于频谱中可见的宽带噪声明显升高，时间域波形振幅相对于较低压力的非线性增长。这种噪音通常被认为是惯性空腔的结果，在此示例中，对应于 MB 的破坏。

为了更清楚地看到这一点，PCD 响应作为时间函数显示在 图 5 中。在左面板（图 5A）中，全光谱显示在 50 秒的曝光时间内，在此期间，源每 0.20 秒发出 2.0 毫秒的脉冲。相应的总、谐波和宽带电源显示在右面板（图5B）中。美国在3 。0时开启，当时可以看到大振幅宽带响应。最初的峰值被认为与悬架中最大气泡的破坏相对应（SonoVue 是多散射），是在空壳气泡的空腔实验中，甚至与非气态介质（如 PBS）的空腔实验中常见的观察。

几秒钟后，宽带响应迅速减弱，显然是由于气泡破坏，信号主要由谐波组成。这表明释放的气体和剩余的 MB 正在稳定且非内力地振动。在 50 年代，宽带组件已降至原始背景噪音的水平。因此，当试图了解不同气泡效应对腔室细胞的作用的时间尺度时，像这样的暴露测试很重要。

气泡可能会转化为对美国暴露过程中产生的辐射力，以及 MBs 进出 PCD 视场时，可能导致监测到的气穴信号的变异性增加，尤其是在处理稀释悬浮时。因此，PCD 的敏感区域应尽可能多地跨越细胞暴露表面。图6中显示了具有相同中心频率的聚焦和非聚焦 PCD 的比较，在正常 PBS 中使用 MB 的 20:1 稀释是 SAT2。面板图6A中的时间和样本平均光谱显示，未聚焦的PCD包含更强的宽带响应，同时谐波（图6B）和超谐波功率（图6C）的样本对样本变异性降低。

重要的是要认识到，用于体外细胞工作的介质没有脱气，并可能呈现增强的气泡活动的背景水平。 图7 显示了供应商提供的形式使用的PBS的SAT2响应，在真空下两个小时的脱气后，空气饱和度从92%降低到46%，这是用光学传感器确定的（德国PreSens）。 图 7A 中的光谱在暴露时间内平均值，并重复了五个独立样本，并清楚地显示正常 PBS 中明显升高的超谐波。三种谐波（图7B）所总结的功率在每个实验输出的标准偏差范围内。相比之下， 图7C 中的超谐波总和表明，正常PBS的样本之间具有近一个数量级的较高级别和高得多的变异性。这些示例表明，常见的细胞兼容介质可能表现出可能（错误地）归因于 MB 存在的行为。由于对细胞和/或气穴剂稳定性的负面影响，去气培养介质通常不切实际，因此在任何与气穴相关的研究中执行适当的控制至关重要。

图1:两个美国暴露系统设计的插图，包括腔监测:SAT3（D-F）。（A） SAT2 注释组件，侧壁被移除，以清晰明了。（B） SAT2 侧壁完好无损。（C） SAT2细胞暴露舱，拆解。（D） SAT3 注释组件。（E） SAT3 以正常（左）和透镜（右）配置进行光束宽度不同频率的匹配。（F） SAT3细胞暴露舱，拆解。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:计算直径为12.7毫米的半振幅压力场轮廓（左）和球形聚焦（右）变流器。2、4 和 8 MHz 的频率分别显示为坐标原点的 PCD 元素（0，0）的红色、蓝色和绿色轮廓。未聚焦设备的最外侧轮廓对频率相对不敏感，但内部结构依赖于频率。球形聚焦的字段合约随着频率的增加而增加，但在轮廓内，字段变化平稳。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:用于空腔信号调理和记录（蓝色箭头）、美国源激发（红线）和数据采集触发的仪器。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:时间（左）和频率（右）域PCD响应记录与MBs稀释5倍在PBS。事件峰值负压为（A，B）0.2 MPa，（C，D）0.4 MPa，（E，F）0.7 MPa，全部为0.5 MHz。信号记录在t=0开始2.0毫秒超声脉冲之前开始1.4毫秒。（A、C、E）时间域信号（红色）显示在固定的垂直尺度上，指示响应级别如何随事件压力变化。内置的痕迹显示信号为记录（红色），并带有 2 MHz 高通滤清器（蓝色），时间窗口集中在从源到单元暴露舱到 PCD 的飞行时间窗口。（B、D、F）噪声和信号功率光谱密度分别计算为 t <0 和 t >0。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:在PBS中稀释5倍的MBs暂停50秒的频谱历史。（A） 全光谱和 （B） 总、谐波和宽带信号功率，均作为时间函数。驱动条件为 0.5 MHz，0.7 MPa 峰值负压，2.0 ms 脉冲持续时间，200 ms 脉冲重复期。 请单击此处查看此图的较大版本。

图6:在正常PBS中以20:1稀释微泡记录的PCD聚焦几何学的效果。驱动条件为:1.0 MHz、0.50 MPa峰值负压、3.0 ms脉冲持续时间、10ms脉冲重复期。（A） 暴露时间平均全光谱和三个独立样本重复。（B） 3、4 和 5 MHz 谐波的功率，以及 2.5、3.5 和 4.5 MHz 超谐波的功率。厚线是示例手段，阴影区域表示 +/- 1 标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本。

图7:PBS记录的脱气介质的影响。（A） 暴露时间平均全谱和五个独立样本重复。（B） 3、4 和 5 MHz 谐波的功率，以及 2.5、3.5 和 4.5 MHz 超谐波的功率。厚线是示例手段，阴影区域表示 +/- 1 标准偏差。驱动条件为 1.0 MHz，0.50 MPa 峰值负压，1.0 ms 脉冲持续时间，200 ms 脉冲重复期。请单击此处查看此图的较大版本。

参数	单位	最低	最大
频率	兆赫	0.02	15
压力（峰值负）	姆帕	0.1	20
脉冲长度	周期	1	连续
值班周期	%	1	连续
曝光时间	s	10	1000

表1:报告参数范围的摘要，促进 体外造影。

讨论

Apfel 于 1981⁷⁶年将任何声学测量的关键步骤封装为"了解你的液体，了解你的声音场，知道什么时候发生"。在本协议中，这些包括传感器校准和对齐以及水准备和气泡处理步骤。首先，用于校准驱动传感器的水听器和/或 PCD 本身必须通过定期外部服务或内部比较与参考标准进行精确校准。同样，驾驶传感器和 PCD 的反应需要定期进行特征，以检查输出和/或敏感性损失的任何变化。如果系统的驾驶条件和接收灵敏度未知，则无法推断暴露条件、生物效果和声学排放之间的任何有意义的关系。与此直接相关的是，需要仔细检查转导器与样品室之间的对齐，以确保腔室内的暴露条件如预期的那样，PCD 的采样量与感兴趣的区域相对应。如前所述，悬浮介质的温度和气体含量可显著影响最终结果，而一致性在这方面极为^重要。同样，对空腔剂悬架的制备、定型和处理也需要非常密切的注意，以确保样品中存在粒子的预期大小分布和浓度。例如，如果气泡浓度过高，将有效保护样本量免受事件美国字段的保护。MB 制剂特别容易受到破坏和凝聚，在 Mulvana 等地可能会找到有关其处理的进一步指导。al. （2012）^79.

检测空腔信号的一个常见问题是实现足够的 SNR。这在一定程度上是由于信号本身的性质，如所述，但也可能是由于实验设置中的电噪声来源。检查系统组件之间的连接，特别是涉及共轴电缆的连接，可能有助于消除其中一些连接。可能需要更换或修复共轴电缆。识别和拆卸实验室中可能导致电气噪音的其他设备（如泵）也可能有帮助。系统部件之间的电气阻抗匹配不良可能是信号与噪声比差的进一步原因，也可能导致设备损坏，应仔细检查。信号发生器和示波器上的触发设置同样应检查，以确认它们为实验进行了适当配置，并且尚未恢复到制造商默认设置。如果在处理过程中气泡受到重大破坏，在 SAT2 的情况下，将第二个注射器连接到出口端口并用它来轻轻地从舱中提取液体，从而在悬架中抽取液体可能会有所帮助。如果需要，这也有助于消除美国风险敞口期间的宏气泡或启用流量。

不可能完全消除样品室内的声学反射，因此事件场不会完全统一整个样品体积。如步骤 1.3.2 和 1.3.3 所述，声学窗口的可传输性将依赖于频率，因此应仔细考虑声学发射测量所需的带宽。特别是，高频组件可能有显著的多重反射。这也是为什么在完全组装的系统内校准字段对于最大限度地减少事故压力的不确定性如此重要的另一个原因。还应考虑对记录的信号进行适当的门控，以尽量减少多次反射的影响。为了方便和需要声学透明度而使用商业设备意味着必须牺牲一些光学透明度。这可能会影响后续成像的质量，例如，评估细胞生存能力或药物吸收。商业设备中使用的一些膜也是多孔的，因此，样品室和周围的水浴之间会发生不完美的隔离。如上所述，使用较小的子腔室可以减轻相应的污染风险，其内容可以定期更换。 材料表 中指出的细胞培养装置主要适用于可能不代表组织的所有美国/腔介质生物效应的细胞单层。细胞接近固体表面也会影响MB动力学，其方式可能无法反映体内的条件，例如，促进引入中描述的微流和微喷射。然而，这些限制可以通过简单的替代组织模型来解决。

提出SATs的目的是在研究美国调解的生物效应之间提供一种提高声学暴露条件和声学排放可重复性的手段，从而有望促进更好地了解基础机制，并开发治疗监测技术，以提高安全性和有效性。这些系统设计为与市售的细胞培养设备兼容，使各种生物检测能够根据兴趣的应用进行，并能够实现高吞吐量实验的性能，从而无需在运行之间耗时对齐程序。通过标准化暴露条件特征和捕获声学排放的协议，有望降低系统依赖性变异性。为特定实验应探索的参数范围将取决于应用（所需的生物效应、细胞类型、如果在体内的目标组织深度等）以及正在使用的任何气穴剂的性质。鉴于大量变量（美国频率、压力振幅、脉冲长度、脉冲重复频率等），充分探索整个参数空间不太可能是可行的。拟议协议的一个优点是，它使这个参数空间上的某些界限能够迅速建立起来。例如，它能够确定产生气穴信号的最小压力、细胞分离/死亡发生前可使用的最大压力或脉冲长度，以及产生分数谐波或宽带噪声的压力。建议将这一套范围测量作为任何研究的第一步进行。

如前所述，SAT 设计用于声学排放的实时监控，在实验之外进行生物检测。但是，修改 SAT 以便通过显微镜目标直接光学观察样品室相对简单。这反过来又可以与荧光和/或高速显微镜系统相结合，以便观察药物吸收和气泡动力学，例如。目前从电压方面呈现的PCD输出表示:i） 空腔行为的类型及其相对比例:ii） 这些空腔行为持续多久:iii） 观察到的时间累积暴露特征是否与特定的生物效应相关:和 iv） 相对水平和时间依赖行为是否与暴露系统中以前的实验一致。虽然 PCD 的接收灵敏度可以量化，但为了以绝对能量可靠地描述声学排放，还需要额外的空间信息。这可以通过用阵列探头替换 PCD 来实现，从而实现被动声学映射 （PAM）⁸⁰。然而，这将增加信号处理的复杂性以及所需的计算时间和功率。

还可以采用其他测量膜电阻或应用物理定位方法（例如磁场）的仪器。也可以在声学"软"凝胶基板上使用三维组织结构，如肿瘤球体、器官，甚至前活体组织样本，以代替细胞单层，研究美国和在更逼真的组织环境中的空腔介质效应。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorber	Precision Acoustics	APTFlex F28 panel	1.0 cm standard thickness
Amplifier (power)	E&I Ltd.	1040L	400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre)	Stanford Research Systems	SR445A	Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater	Aquael	Ultra 50W	Different models for different tank sizes.
Digitizer	TiePie Engineering	HS5-110-XM	Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone	Precision Acoustics	FOH	0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles	Bracco	SonoVue	FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3)	Olympus NDT	F-102	90 degree beam reflection
PCD transducer	Olympus NDT	V320-SU	Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable	Olympus NDT	BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid)	Corning	Sylgard 184	See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal)	Zeus	PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal)	VWR	391-2101	6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator	Agilent	33250	Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2	Ibidi	µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3	Corning	Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3)	Sonic Concepts	H107 with central hole	Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage