生产人类CRISPR工程的CAR-T细胞

摘要

在这里，我们提出了一个协议，在原人类T细胞的基因编辑使用CRISPR卡斯技术来修改CAR-T细胞。

摘要

使用心绞细胞抗原受体T细胞（CAR-T细胞）的采用细胞疗法在血液恶性肿瘤患者中已显示出显著的临床疗效，目前正在对各种实体肿瘤进行调查。CAR-T细胞通过从患者的血液中取出T细胞并设计它们来表达一种合成免疫受体来产生，该受体将T细胞重定向以识别和消除目标肿瘤细胞。CAR-T细胞的基因编辑有可能提高当前CAR-T细胞疗法的安全性，并进一步提高CAR-T细胞的功效。在这里，我们描述了人类CRISPR工程CD19定向CAR-T细胞的激活、扩展和定性方法。这包括CAR扁豆载体的转导，以及使用单导RNA（sgRNA）和Cas9内分泌酶瞄准T细胞感兴趣的基因。本协议中描述的方法可以普遍应用于除本研究所用基因以外的其他CAR结构和靶向基因。此外，本协议还讨论了gRNA设计、铅GRNA选择和靶向基因淘汰验证的策略，以可重复实现临床级人类T细胞的高效率、多重CRISPR-Cas9工程。

引言

奇美利安抗原受体（CAR）-T细胞疗法彻底改变了采用细胞疗法和癌症免疫疗法领域。CAR-T细胞是一种表达合成免疫受体的工程T细胞，它结合了抗原特异性单链抗体片段和来自TCRzeta链的信号域，以及对于T细胞激活和共同刺激^{1、2、3、4}所必需且足以进行成本激励的域.CAR-T细胞的制造首先提取患者自己的T细胞，然后对CAR模块进行前体内病毒转导，并扩大CAR-T细胞产品，磁珠作为人工抗原呈现细胞^5。扩大的CAR-T细胞被重新注入到患者，在那里他们可以移植，消除目标肿瘤细胞，甚至持续多年后输液^6，7，8。虽然CAR-T细胞治疗在B细胞恶性肿瘤中取得了显著的反应率，但固体肿瘤的临床成功受到多种因素的挑战，包括不良T细胞渗透^9、免疫抑制肿瘤微环境^10、抗原覆盖和特异性，以及CAR-T细胞功能障碍^11、12.目前CAR-T细胞治疗的另一个限制包括使用自体T细胞。经过多轮化疗和高肿瘤负担后，CAR-T细胞的质量可能较健康捐赠者的异基因CAR-T产品差，此外还有与制造自体CAR-T细胞相关的时间和费用。CRISPR/Cas9对CAR-T细胞产品的基因编辑代表了克服目前CAR-T细胞^{13、14、15、16、17}的局限性的新策略。

CRISPR/Cas9是一个两个组分系统，可用于哺乳动物细胞^18，19的靶向基因组编辑。CRISPR相关内分泌酶Cas9可以通过与目标DNA序列²⁰的碱基配对，诱导由小RNA引导的特定部位双链断裂。在没有修复模板的情况下，通过容易出错的非同位素端连接 （NHEJ） 通路修复双链断裂，导致帧移位突变或通过插入和删除突变 （INDELs） （INDELs）^19、20、21过早停止 codons。效率、易用性、成本效益和多路复用基因组编辑能力使CRISPR/Cas9成为提高自体和异基因CAR-T细胞的功效和安全性的强大工具。此方法还可用于编辑 TCR 定向 T 单元格，方法是将 CAR 结构替换为 TCR。此外，基因CAR-T细胞，有有限的潜力，导致移植与宿主疾病也可以通过基因编辑TCR，b2m和HLA细胞位点产生。

在此协议中，我们展示了如何将 T 细胞的 CRISPR 工程与 CAR-Transgene 的病毒载体介导传递相结合，以生成基因组编辑的 CAR-T 细胞产品，提高功效和安全性。图 1显示了整个过程的示意图。利用这种方法，我们已经在原人类CAR-T细胞中展示了高效基因敲除。 图 2A 详细描述了编辑和制造 T 单元的每个步骤的时间表。还讨论了指导RNA设计和淘汰验证的策略，以便将这种方法应用于各种目标基因。

研究方案

人体T细胞是通过宾夕法尼亚大学人类免疫学核心公司采购的，该核心在良好实验室实践原则下运作，符合既定的标准操作程序和/或符合MIATA和宾夕法尼亚大学道德准则的样品接收、处理、冷冻和分析协议。

1. 伦特维拉尔病媒生产

注:病毒产品通过将包装结构（Rev、gag/pol/RRE、VSVg 和转移质粒）分离成四个单独的质粒，从而使复制缺陷，大大降低了可能导致复制能力强的病毒的重组事件的可能性。

1. 在转染前一天准备 HEK293T 细胞。在 T150 培养皿中，在 30 mL 的标准培养介质（称为 R10:RPMI 1640，辅以 10% 胎儿小腿血清）中镀约 6 x 10 6 个细胞， 10 mM HEPES， 1% 笔/链球菌， 1% L-谷氨酰胺） 和孵育过夜在 37 °C. 18-24 小时后， 细胞应该是 60-70% 汇合， 看起来健康 （树突投影和均匀分布在整个烧瓶）.如果细胞看起来健康，请继续第 1.2 步。
2. 准备含有脂质试剂 （96 μL）、 pTRP gag/pol （洛特# RR13SEP19A） （18 μg）、 pTRP RSV-Rev （洛特# RR13SEP19B-） 3） （18 μg）， pTRP VSVG （洛特# RR13SEP19C） （7 μg） 包装质粒和 15 μg 表达质粒 （CD19bbz scFv 克隆在 pTRPE）.
   1. 对于每次转染反应，准备一个管包含 1 mL 的减血清最小基本介质加上步骤 1.2 中描述的四个质粒，以及一个管包含 2 mL 的减血清最小必需介质外加 90 μL 的脂化试剂。将这两种解决方案通过滴入添加 1 mL 质粒混合到 2 mL 脂化试剂混合中混合。请务必通过多次上下管道大力混合解决方案。在室温下将溶液孵育 15 分钟。
   2. 同时，从 HEK293T 细胞瓶中吸气介质，用 10 mL 的减血清最小必需介质轻轻清洗细胞，然后再次吸气。
   3. 使用 5 mL 血清移液器将转染混合物 （3 mL） 从第 1.2.1 步轻轻添加到细胞培养瓶的底角。轻轻倾斜烧瓶，均匀地将转染混合物分布在细胞培养瓶中，并在室温下孵育10分钟。请务必不要打扰单元格单层。10 分钟后孵化，加入 35 mL R10 介质，并将烧瓶返回孵化器 24 小时。
3. 24小时后，从 HEK293T 细胞培养瓶中收集超纳特，并转移到 50 mL 圆锥管中。在 HEK29T 细胞中加入新鲜的 R10，并将电池放回孵化器中再使用 24 小时。旋转超高纳特 （300 x g） 以去除细胞碎片，并通过 0.45 μm 过滤器过滤超高纳坦。
4. 通过高速超浓缩（2.5 h 或 8000 x g 隔夜 25，000 x g）将过滤物从第 1.3 步集中。将 24 h 病毒颗粒存储在 4 °C 下，同时将 48 h 病毒集中在一起。
5. 重复步骤 1.3-1.4 的 48 h 集合，并结合 24 h 和 48 h 病毒集合。来自 48 h 系列的颗粒将包含伦蒂病毒的联合收获。
6. 将病毒颗粒在大约 1 mL 的冷 R10 和 aliquot 中重新用于 100 μL 小瓶。立即用干冰将阿利库特冷冻，并储存在 -80 °C 下。
7. 通过转导固定量的 CD3/CD28 珠激活的原发性人类 T 细胞，对扁豆超高分子进行串联稀释，计算导管/mL 中的功能病毒滴答声。通过流细胞测量 72 小时后的 CAR 转导。
   1. 污渍为 CD19 定向汽车与抗 FCM63 scFv 抗体。对于其他幻想抗原受体，使用氟标签重组蛋白的污渍，这是特定于CAR scFv。通过流细胞学产生低于 20% CAR 阳性细胞的病毒稀释是最精确的稀释来计算病毒滴答声。超过 20% 的 CAR 阳性细胞，每个正细胞被转导两次的机会增加，导致对转导粒子数量的低估。计算每 mL （TU/mL） 的转导单元 = （转导 X% CAR 正细胞数量 x 稀释因子）/（mL 中的转导体积）。

2. 设计原发性人类T细胞中的sgRNA和基因破坏

1. 设计克里斯普 · 斯格纳的
   注:多个服务器和程序为目标特定 sgRNA 的设计提供了便利。在此协议中，CRISPR sgRNA 是使用 CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no）和布罗德研究所 （https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design） 的 gRNA 设计门户进行设计的。
   1. 对于每个目标基因，设计六到十个 sgRNA 序列，以目标早期编码外在序列。
      注意:sgRNA 应具有高目标功效和低目标功效。用于确定 sgRNA 功效的每个机器学习算法的工作原理略有不同。因此，建议比较多个 sgRNA 设计工具并策划一份 6 到 10 个 sgRNA 列表进行筛选。
2. 原人类T细胞中的基因中断
   1. 从健康的志愿者捐赠者那里获得自体外周血单核细胞（PBMC的）。协议的示意图时间表在 图 2A 中描述，并描述如下。
   2. 使用市售的 CD4 和 CD8 选择套件隔离 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 单元。
   3. 以 1:1 的比例将 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞组合在一起，在 R10 中以 3x10⁶细胞/mL 孵育过夜，并辅以 5 ng/mL huIL-7 和 huIL-15。建议添加IL-7和IL-15，因为它们已知促进中央记忆表型和CAR-T细胞扩大与IL-7和IL-15具有优越的抗肿瘤功效相比，IL-2扩大CAR-T细胞22，23，24。
   4. 第二天，将 T 细胞和离心机 5-10 x 10⁶ 细胞计数在 300 x g 下 5 分钟。丢弃所有的超高纳特，用减血清最小必需介质清洗细胞颗粒。根据制造商的说明（材料表），将颗粒重新沉浸在 100 μL 的核化溶液中。
   5. 在清洗细胞时，通过在室温下（RT）用 5 微克 sgRNA 孵育 10 微克的 Cas9 核糖，与 Cas9 和 gRNA 一起准备核糖核蛋白 （RNP） 复合物 10 分钟。卡斯9与sgRNA的摩尔比为1:2.4。建议使用包含 Cas9 和电极增强剂但无 sgRNA 的模拟控制。
      注:多路复用基因编辑可以在这一步骤中执行，分别为每个目标制作RNP复合物，并在下一步中描述的核感染时将其与细胞结合。选择试剂来组装 RNP 复合物是获得高 KO 效率的关键。例如，来自不同供应商的Cas9核酸酶具有不同的脱靶效应，化学改性gRNA可降低T细胞的毒性，从而提高KO效率。
   6. 将第 2.2.4 步的再悬浮细胞与第 2.2.5 步的 RNP 复合物相结合，并添加 4.2 μL 的 4 μM 电聚变增强剂（ssDNA 寡核苷酸，与人类基因组不同源）。混合好，并转移到电聚库韦茨。避免气泡，因为它们会损害电镀效率。
   7. 使用脉冲代码EH111的电电细胞。电聚后，R10 中的孵化细胞在 12 井板中辅以 5 ng/mL huIL-7 和 huIL-15，在 5x10⁶ 细胞/mL 下以 30 °C 为 48 h。48小时后，继续进行T细胞激活和扩展。

3. T细胞激活、扁豆转导和扩张

注:对于 SgRNA 的筛查，无需对 CAR 结构进行纵向转导（第 3.2 步）。

1. 计算电倾T细胞，并稀释到浓度为1 x 10⁶ 细胞/mL使用温暖的R10补充5 ng/mL huIL-7和huIL-15。通过添加抗CD3/抗CD28单克隆抗体涂层磁珠，以每活T细胞3珠的比例激活细胞。
   注:与非电化细胞相比，电聚导致大量细胞死亡，导致大约 60% ± 15% 的活细胞。使用活细胞/死细胞计数来确定适当数量的珠子。将细胞转移到37°C，并在一夜之间孵育。
2. 经过一夜刺激后，从第 1 步中用扁豆超高分子转导 CRISPR 工程的 T 细胞。根据第 1.7 步计算的病毒滴答声添加适当的体积，以实现 3 的感染 （MOI） 倍数，并在 37 °C 下孵育 72 小时的细胞。
   注:在R10中重新悬念的病毒颗粒只是根据细胞浓度、病毒滴答声和所需的MOI在细胞顶部添加。
3. 72小时后，以当前培养量 R10 的 50% 为原料电池，其中含有 10 ng/mL huIL-7 和 huIL-15，并将其返回到孵化器中再使用 48 小时。请勿打扰在 T 细胞和珠子之间形成的簇。
4. 48小时后，通过轻轻地重新吸收细胞珠混合物，然后进行磁性分离，从细胞中取出珠子。去除珠子后计数细胞，使用 R10 补充 5 ng/mL huIL-7 和 huIL-15 将浓度达到 0.8 x 10⁶细胞/mL。去珠后，细胞数应与电位前第 1 天的细胞计数相似（图 2B）。
5. 24小时后，用R10 ×5 ng/mL huIL-7和huIL-15将细胞计数并喂至浓度为1 x 10⁶ 细胞/mL。每24小时重复一次，直到生长动力学和细胞大小证明细胞已经从刺激中休息。
   注:从这一点开始，T细胞大约每24小时翻倍一次。T细胞通常经历5-7个人口翻倍，休息时细胞体积约为300±50fl。
6. 休息后，将CRISPR设计的CAR-T电池旋转，在冷冻介质（1:1 X-Vivo 和 FBS 加 10% DMSO）中重新保存，用于冷冻保存。使用的CAR-T细胞应解冻，并在37°C下休息16小时，然后进行实验。
   注意:保留约 10x10⁶个单元格，用于测量淘汰效率和 CAR 集成。图2B，2C显示，预计人口在扩张期间会翻番，体积会发生变化。此外，图 2D显示模拟和基因编辑的 CAR-T 细胞上的 CAR 表达水平。

4. CRISPR 效率

1. 基因组DNA提取和靶向基因扩扩
   1. 从每个筛选培养，旋转3-5 x 10⁶ T细胞。细胞可以冷冻成干燥的颗粒，也可以进行基因组DNA提取。在DNA提取时，根据制造商的说明，在磷酸盐缓冲盐（PBS）的200微升中重新使用颗粒，并使用标准DNA提取工具包从电聚细胞中提取基因组DNA。
      1. 简言之，用蛋白酶K将解析剂装入DNA结合柱的解剖细胞。在离心过程中，DNA 与膜结合，而污染物会通过。经过两个洗涤步骤，去除剩余的污染物和酶抑制剂，在水中提取DNA。
   2. 使用含有DNA聚合酶、配料蛋白、盐和 dNTP 的标准 PCR 混合物以及 10 μM 前向和反向引物，在预期双链断裂区域两侧放大 200-300 ng 的基因组 DNA。
      注:对于 PCR 引物设计，GRNA 切口部位侧侧的参考基因组序列（可使用 http://www.ensemble.org 找到）输入到 NCBI 引物爆炸工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）中。PCR 引数的设计应使放大器的目标尺寸为 600-700bp。此长度允许设计与 gRNA 切割部位（至少 150 bp）距离在放大器内绑定的测序引物，以确保 Cas9 诱导的 indels 周围的测序质量良好（参见 4.2.1）。每个 gRNA 都需要一个唯一的入门对，除非 gRNA 切割点非常接近。
   3. 使用 1% 的玫瑰凝胶运行整个 PCR 产品，并使用标准的玫瑰凝胶净化套件净化放大镜。
      注:确定 PCR 最佳 Tm 的过程可能需要多轮故障排除。这是因为 KO 序列具有内德尔，目标基因应准备进行测序，因为切割部位上游或下游通常没有 100 bp 的内德尔。这可能因非同源端加入产生的因德尔而大相径庭。将嵌套测序引物设计到 PCR 引物中，并提高产品排序的浓度，可以消除测序问题。
2. 测序和打磨检测
   1. 设计与凝胶粘合的测序引物纯化放大器，并发送模拟和敲除放大器用于桑格测序。测序完成后，将跟踪文件上传到桌面遗传学软件（tide.deskgen.com，桌面遗传学），以便进行 TIDE 分析。
      1. 对于测序引物设计，请将 PCR 放大器的序列输入到标准引物设计软件（NCBI、Eurofins 或其他公开可用的工具）中。设计软件将建议多个适合桑格测序的入门序列。
      2. 选择在 gRNA 切割场上游或下游至少 150 bp 的放大器内绑定的前进和反向引物，以确保在镶木周围保持良好的测序质量。测序染色图将用于 4.2 的 TIDE 分析，因此测序质量对于准确的刻度分解非常重要（参见 Hultquist 等人）。²⁵.
   2. 使用 TIDE（通过 DE 复合物跟踪 Indels）分析来检测基因组²⁶级的敲击 （KO） 效率。该算法从序列轨迹中精确重建了 Indels 的光谱，并计算了 R² 值，反映了 TIDE 软件在非负线性建模之后的拟合度。
3. 目标蛋白质检测
   1. 对于基因产物在T细胞表面表达的目标基因，将每个筛选培养物中的大约1×10⁵个细胞与特定于目标蛋白质的荧光标记抗体染色。比较模拟控制和淘汰组之间的目标蛋白质的表达水平，如图3A，3B所示。
   2. 对于基因产物在细胞内表达的目标基因，在裂解缓冲器中每筛选组大约解析约3 x^{10 600}万细胞，并遵循SDS-PAGE和西式印迹的标准协议。或者，表面或细胞内流细胞学可用于探测目标蛋白质。

5. 使用 iGUIDE 监测目标外效果 - 库准备、DNA 测序和分析

注: iGUIDE 技术允许检测 Cas9 引导的位置，并量化这些 DNA 双链断裂的分布。

1. 执行 iGUIDE 如诺布尔斯等人所述²¹。sgRNA使用 iGUIDE 技术瞄准 TRAC 点的偏离目标效应已在 Stadtmauer 等人（2020^{年 13 年}）中显示。

结果

我们在这里描述了一个基因工程T细胞的协议，可用于生成自体和异基因CAR-T细胞，以及TCR重定向T细胞。

图1详细描述了CRISPR编辑T细胞制造过程中所涉及的阶段。这个过程开始于设计对感兴趣的基因的sgRNA。一旦sgRNA被设计和合成，然后他们被用来使RNP复合物与适当的Cas蛋白。T细胞从健康的供体或患者球体中分离出来，RNP复合物通过电聚或核化来传递。编...

讨论

在这里，我们描述了使用CRISPR Cas9技术和制造产品来进一步测试功能和功效的基因编辑CAR-T细胞的方法。上述协议已优化，用于在原发性人类T细胞中执行CRIPSR基因编辑，并结合具有幻想抗原受体的工程T细胞。此协议允许高淘汰效率，以最小的供体到捐赠者的变异性。使用CRISPR进行改造，通过消除抑制T细胞功能的受体并制造异基因CAR-T细胞，可以提高CAR-T细胞的功效和安全性。

...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4D-Nucleofactor Core Unit	Lonza	AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit	Lonza	AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix	ThermoFisher	12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifuge	Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody	Biolegend	317322	Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1	Biolegend		Clone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancers	IDT	1075915
CD3/CD28 Dynabeads	ThermoFisher	40203D
CD4+ T cell isolation Kit	StemCell technologies	15062
CD8+ T cell isolation Kit	StemCell technologies	15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle	Corning	430768
Corning T150 cell culture flask	Millipore Sigma	CLS430825
DMSO	Millipore Sigma	D2650
DNAeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69504
DynaMag Magnet	ThermoFisher	12321D
Glutamax supplement	ThermoFisher	35050061
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEPES (1 M)	ThermoFisher	15630080
huIL-15	PeproTech	200-15
huIL-7	PeproTech	200-07
Lipofectamine 2000	ThermoFisher	11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanup	Takara	740609.25
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L	Lonza	V4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-Glutamine	ThermoFisher	10378016
pTRPE expression Plasmid	in house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE	CytoArt	200105
RPMI1640	ThermoFisher	12633012
sgRNA	IDT
Spy Fi Cas9	Aldevron	9214
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326823
Viral packaging mix	in house
X-Vivo-15 Media	Lonza	BE02-060F