评估人体骨骼肌微组织骨骼肌健康的功能指标

摘要

本手稿描述了一种详细的方案，用于生成3D人骨骼肌微系统和微创下游功能原位测定阵列，包括收缩力和钙处理分析。

摘要

骨骼肌的三维（3D）体外模型是生物医学研究的宝贵进步，因为它们提供了以可扩展格式研究骨骼肌改造和功能的机会，该格式适合实验操作。3D肌肉培养系统是可取的，因为它们使科学家能够在人类细胞的背景下离体研究骨骼肌。3D体外模型密切模仿成人骨骼肌天然组织结构的各个方面。然而，它们的普遍应用受到平台可用性的限制，这些平台易于制造，成本高，用户友好，并且产生相对大量的人体骨骼肌组织。此外，由于骨骼肌在许多疾病状态下起着重要的功能作用，随着时间的推移会受损，因此当微创钙瞬时和收缩力测量可以直接在平台本身内进行微创钙瞬时和收缩力测量时，微组织研究的实验平台是最实用的。在该协议中，描述了称为"MyoTACTIC"的96孔平台的制造，以及大规模生产3D人体骨骼肌微组织（hMMTs）。此外，还报告了微创电刺激应用的方法，该方法能够随着时间的推移重复测量每个微量组织的骨骼肌力和钙处理。

引言

骨骼肌是人体最丰富的组织之一，支持关键的身体功能，如运动，热稳态和新陈代谢¹。从历史上看，动物模型和二维（2D）细胞培养系统已被用于研究生物过程和疾病发病机制，以及用于测试药物治疗骨骼肌疾病的药理化合物^2，3。虽然动物模型大大提高了我们对健康和疾病骨骼肌的了解，但它们的转化影响受到高成本，伦理考虑和种间差异^{的阻碍2，4}。在转向基于人类细胞的系统来研究骨骼肌时，2D细胞培养系统由于其简单性而具有优势。但是，存在限制。这种格式通常无法概括体内自然发生的细胞 - 细胞和细胞外基质相互作用^5，6。在过去的几年中，三维（3D）骨骼肌模型已成为整个动物模型和传统2D培养系统的强大替代品，因为它允许对离体^7，8的生理和病理学相关过程进行建模。事实上，大量研究报告了以生物人工3D培养格式¹模拟人体骨骼肌的策略。许多这些研究的一个局限性是，在从培养平台上去除肌肉组织并附着在力传感器上之后，主动力是定量的，这是破坏性的，因此，仅限于作为终点测定^{9，10，11，12，13，14，15，16，17，18 ，19，20，21}.其他人已经设计了允许非侵入性方法测量主动力的培养系统，但并非所有方法都适合高内涵分子测试应用7，8，9，10，14，18，22，23，24，25，26，27，28 ^，29.

该协议描述了在骨骼肌（Myo）微Tissue Array deviCe中制造人类肌肉微组织（hMMTs）的详细方法，以研究forCe（MyoTACTIC）平台;支持批量生产3D骨骼肌微系统的96孔板设备^30。MyoTACTIC板制造方法能够在单个铸造步骤中生成96孔聚二甲基硅氧烷（PDMS）培养板和所有相应的孔特征，因此每个孔需要相对较少的细胞来形成微组织。在MyoTACTIC中形成的微组织包含对齐，条纹和多核的肌管，这些肌管可以从设备的孔到孔重复，并且在成熟时可以对原位的化学和电刺激做出反应³⁰。本文概述并讨论了从聚氨酯（PU）复制品制造PDMS肌定向培养板装置的技术，实现永生化人肌原祖细胞以制造hMMT的优化方法，以及工程hMMT力产生和钙处理特性的功能评估。

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研究方案

1. PDMS肌定向板制造

注:PDMS肌定向板制造需要PU负模，其制造方式可如前所述^30。用于 MyoTACTIC 板设计的计算机辅助设计 （CAD） SolidWorks 文件已在 GitHub （https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file） 上提供。

1. 使用有机硅弹性体试剂盒中的组分，以1:15的比例在一次性塑料杯中以单体与固化剂的比例制备〜110g PDMS聚合物溶液。使用5 mL一次性血清移液管搅拌聚合物溶液2-3分钟，直到完全混合和均匀。
   注意:避免PDMS聚合物溶液与皮肤和眼睛接触;并避免吸入。处理液体PDMS混合物时，请始终穿着实验室外套和一次性手套，并参考安全数据表（SDS）了解特定的安全协议。
   注意:在PDMS聚合物溶液溢出的情况下，用一次性覆盖物保护设备表面（例如，秤，台面等）。
2. 通过将杯子放在与标准负载干真空泵相连的台式真空室中约30分钟，或直到所有气泡被除去，在室温下对混合物进行脱气。每5-10分钟打破真空，以帮助脱气。根据需要，使用空的50 mL注射器筒将空气浸入并吹出聚合物混合物表面上的任何剩余气泡。
   注:一块6.35 mm内径管可用于将P1250移液器吸头连接到滚筒，以提高气流的速度和精度。
3. 当PDMS聚合物溶液脱气时，用干纸巾轻轻擦拭边缘和表面，以清除粘附在PU负极模具上的任何剩余PDMS碎片。使用设施压缩空气，设置为70-100 kPag以去除剩余的细颗粒。
   注意:将PU负极模具放入可密封的塑料袋中并将其存放在实验室交通保护的抽屉中，以保护PU负极模具免受损坏和颗粒积聚。
4. 将PU模具放在用一次性覆盖物保护的化学罩中。将模具水平放置至~75°，并用均匀的脱模剂喷涂活性表面。从上到下喷涂模具，然后从左到右，同时将罐头保持在距离模具15-20厘米处，并使用流体来回扫地运动。将模具旋转180°并重复喷洒，然后让PU模具在化学罩中放置10-15分钟以干燥。
   注意:确保在化学通风橱内使用脱模剂，避免接触皮肤和眼睛，并参考安全数据表（SDS）了解特定的安全协议
   注意:薄膜需要完全覆盖活性表面，但过多的涂层可能会在下一步转移到PDMS，这反过来又会对hMMT播种产生负面影响。表面应该感觉光滑，但不是湿的。
5. 将100克PDMS均匀倒入PU模具中，并放入与旋片真空泵相连的真空室中。对PDMS填充的模具进行脱气约45分钟，在前20分钟内每5-10分钟打破真空密封以加速该过程。留在真空室中，直到PDMS混合物完全没有所有气泡。
   注:旋片真空泵用于实现较低的真空度并减少此步骤所需的时间。PDMS填充模具的脱气可以使用台式真空室和标准负荷型干式真空泵进行，但是，排空所有气泡混合物的时间会更长。至关重要的是去除PDMS聚合物溶液中的所有气泡，特别是在那些注定要成为hMMT锚杆的区域。该区域的气泡将导致锚固后断裂，培养井的损失，进而导致一小块PDMS残留在模具中。
6. 将脱气的PDMS填充PU模具转移到65°C的烘箱中，孵育过夜以固化液体橡胶。
7. 从烘箱中取出固化的PDMS正极板，并在室温下冷却板至少30分钟。
8. 使用无刃手术刀，通过在PDMS和模具壁之间运行手柄背面，轻轻地将固化的PDMS与PU模具分离。沿着上边缘开始并分离所有4个侧面，然后向下推到模具的底部并分离此部分。当手柄的背面在PDMS和PU模具的所有4壁之间平稳运行时，此步骤就完成了。
   注意:使用无刀片手术刀缓慢小心地工作，以防止PU模具破裂或撕裂PDMS。此步骤应需要15-20分钟。
9. 从一端开始，使用无刃手术刀抬起PDMS的边缘，并在固化的PDMS培养板和PU模具之间工作手指。然后，用双手将手指进一步推到板下方，慢慢剥离并离开PU模具。
   注意:慢慢操作，用双手均匀地剥离盘子。尽量减少弯曲，以减少锚后断裂的可能性。此步骤应需要5-10分钟。
10. 使用单刃剃须刀片将板切割成6±2个MyoTACTIC孔（图1）的组，用于组织接种目的。将完整的MyoTACTIC板或板部分放入仪器灭菌袋中并在120°C和100-140 kPag下高压灭菌25分钟干循环（20分钟灭菌时间和5分钟干燥时间）。

2. 永生化人成肌细胞祖细胞培养

注意:本方案中使用的永生化成肌细胞是从Myologie研究所（法国巴黎）^{获得的31。}

1. 从液氮杜瓦瓶中获得一小瓶冷冻细胞，并在37°C水浴中快速解冻小瓶（不到1分钟）。以7.5×10⁵ 个细胞的密度冷冻每1mL冷冻培养基，包括90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）。
2. 将小瓶的内容物轻轻转移到含有9 mL预热洗涤介质的15 mL锥形管中，该洗涤介质由89%DMEM 1x，10%FBS和1%Pen / Strep组成，以稀释DMSO。以400×g旋转15mL锥形管10分钟，然后吸走培养基，小心避免细胞沉淀。
3. 将沉淀重悬于1mL生长培养基中，该培养基由84%骨骼肌细胞基底培养基与骨骼肌细胞生长培养基补充剂混合物，15%FBS和1%Pen / Strep组成，然后转移到具有29mL生长培养基的50mL锥形管中。
4. 将含有约2.5 x 10⁵ 个细胞的10 mL培养基转移到100 mm x 20 mm细胞培养皿中。用剩余的20mL细胞溶液重复此步骤。然后将细胞培养皿转移到设置为37°C和5%CO₂的加湿细胞培养箱中。
5. 每隔一天刷新培养基。培养细胞，直到它们达到约70%-80%的汇合度（通常为4-5天），此时细胞准备好进行接种。1.5 x 10⁵ 个细胞来生成每个hMMT。因此，根据需要传代细胞以达到所需数量的细胞。
   注意:在将细胞接种到MyoTACTIC孔中，传代细胞或制备冷冻储备之前，永生化的肌母细胞祖细胞系不应超过80%的汇合度。由汇合度超过80%的细胞制造的hMMTs通常无法达到收缩成熟度。传代过程与下面步骤 3 中描述的方法相同。

3. 使用 MyoTACTIC 播种工程 hMMT

1. 制备用于hMMT接种的MyoTACTIC培养孔和试剂。
   注意:此协议提供了产生 6 个 hMMT 的特定详细信息。
   1. 在细胞接种前2-3小时，将6孔MyoTACTIC板部分放入10cm细胞培养皿中。通过将100μL5%Pluronic F-127溶液加入每个孔中来制备每个单独的MyoTACTIC培养孔。将盖子放在10厘米培养皿上，用石蜡密封10厘米培养皿和盖子之间的空间，然后将含有MyoTACTIC部分的10厘米板放入装有板旋转适配器的离心机中。
      注意:如果没有离心机板旋转适配器，可以使用p20移液器吸头小心地从柱子后面去除气泡，从而确保整个培养表面均匀涂覆。
   2. 以1，550×g离心1分钟，以除去培养井内的所有气泡，特别是在柱子后面。将含有含有Pluronic F-127溶液的MyoTACTIC板部分的10cm细胞培养皿储存在4°C，直到细胞准备好进行接种。
      注意:Pluronic F-127涂层可以应用短至2小时至24小时。例如，可以在一天结束时用Pluronic F-127溶液填充孔，以便在第二天使用。不要超过24小时，因为这会对hMMT重塑产生负面影响，并且无法形成达到收缩成熟的健康组织。
   3. 在培养罩内的冰上缓慢解冻一个50μL基底膜提取物等分试样和一个10μL凝血酶等分试样（100 U / mL储备溶液）。
      注意:不要重新冷冻基底膜提取物等分试样。它们是一次性使用的。凝血酶等分试样可重复使用，因此，使用后可重新冷冻多达5次。
   4. 在1.5mL微量离心管中称取〜7mg粉末状纤维蛋白原，然后转移到细胞培养罩中。在水（或盐水溶液）中加入700μL0.9%（重量/体积）NaCl溶液，以达到10mg / mL最终浓度溶液。不要涡旋纤维蛋白原溶解，而是将管置于37°C细胞培养箱中3-5分钟。
   5. 取出并轻轻拂管，然后在台式小型离心机（微型离心机）中脉冲旋转溶解的溶液并返回培养罩。使用配备0.22μm注射器过滤器的1mL注射器过滤纤维蛋白原溶液。将溶解的纤维蛋白原溶液转移到基底膜提取物和凝血酶等分试样的冰中。
   6. 最后，准备hMMT播种培养基，该培养基将在组织播种后引入培养井。该培养基含有骨骼肌细胞基础培养基，其中补充了20%FBS，1%P / S和3%6-氨基己酸（ACA;1.5mg / mL最终浓度是通过从50mg / mL储备溶液稀释来实现的;%表示为v / v）。使用前将培养基预热至37°C。
2. 制备用于hMMT接种的细胞。
   1. 从培养箱中收集细胞培养板。从每个培养板中吸出培养基，然后通过在每个培养板中加入5mL D-PBS来用D-PBS洗涤细胞一次。接下来吸出D-PBS并通过在每个培养皿中加入1mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA来分离细胞。置于细胞培养箱中3分钟。
   2. 通过向培养皿中加入3mL洗涤培养基（1x DMEM + 10%FBS + 1%Pen / Strep的89%）来停止胰蛋白酶。将细胞溶液转移到适当大小的锥形管中，然后通过以400×g离心10分钟来沉淀细胞。 吸出培养基，小心避免细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于1mL洗涤培养基中。
   3. 在明场显微镜下使用血细胞计数器和台盼蓝染料计数细胞。
      如果使用多块细胞板，这种细胞悬浮液将非常浓缩。根据需要在计数之前稀释细胞悬浮液。
   4. 由于每个组织需要将150，000个细胞重悬于15μL细胞外基质（ECM）混合物中，因此6个组织需要900，000个细胞在90μL ECM混合物中。为了解释在制备过程中由于气泡形成或移液器丢失而发生的细胞 - ECM溶液损失，准备额外的细胞 - ECM混合物（即，8个组织，或120μLECM中的1，200，000个细胞）。将含有1，200，000个细胞的细胞悬浮液的体积转移到新的锥形管中。用洗涤介质将体积增加到10 mL，并以400×g旋转10分钟。
   5. 当细胞向下旋转时，使用以下配方在1.5mL微量离心管中制备150μL ECM混合物。首先加入60μLDMEM（40%体积），然后加入60μL纤维蛋白原10mg / mL溶液（40%体积），最后加入30μL基底膜提取物（20%体积）。将ECM混合物储存在冰上直至使用。
      注意:使用含有基底膜提取物的溶液时，始终使用在-20°C下预冷的吸头。ECM混合物含有4毫克/毫升纤维蛋白原。
3. 播种氢甲基熊果糖
   1. 收集含有旋转下来的细胞的锥形管并吸出培养基，小心避免细胞沉淀。用戴着手套的手指用力轻拂管的末端以移开沉淀并继续轻拂，直到沉淀显示为细胞浆液。
      注意:重要的是要吸出尽可能多的洗涤介质，以确保细胞 ECM 悬浮液处于所需的稀释度。如果需要，请使用移液器去除剩余的洗涤介质。
   2. 将120μL的ECM溶液转移到含有细胞沉淀的管中。上下移液以完全重悬ECM内的细胞以产生单个细胞悬浮液。缓慢而小心地移液，以避免引入气泡，这将减少工作体积。然后，将细胞 ECM 溶液放在冰上直至使用。
   3. 从4°C冰箱中检索含有Pluronic F-127包被的MyoTACTIC孔的MyoTACTIC平板部分，并将含有MyoTACTIC孔的10cm培养皿放在细胞培养罩内的冰袋顶部。
   4. 从每个孔中吸出Pluronic F-127溶液。PDMS是多孔的，将吸收Pluronic F-127溶液，特别是如果用离心机旋转板。让残留的Pluronic F-127溶液释放并沉降到井底，让孔静置5分钟，然后再次吸出。
      注意:吸气Pluronic F-127溶液时，使用巴斯德移液器，末端连接p1250吸头，p200吸头覆盖p1250吸头。这将提高精度，以防止柱子结构的意外抽吸。避免用移液器刮擦孔底部的椭圆形池状细胞接种区域，因为这会破坏Pluronic F-127涂层并干扰hMMT自组织过程。正确的技术是将移液器吸头悬停在椭圆形池上，同时吸出Pluronic F-127溶液。
   5. 小心地移液细胞-ECM悬浮液，以重悬任何可能已经沉入管底的细胞。然后将105μL细胞ECM悬浮液转移到新鲜的预冷1.5mL管中。小心抓住靠近顶部的管子，以防止溶液变暖。
   6. 将0.84μL100 U / mL凝血酶储备溶液加入105μL细胞ECM悬浮液中，以达到0.2 U / mg纤维蛋白原的最终浓度。快速、小心、彻底地移液以混合，同时避免引入气泡。
      注意:凝血酶启动纤维蛋白原的快速转化为纤维蛋白凝块。因此，在添加凝血酶时播种组织的时间有限。为了避免在将细胞-ECM混合物转移到培养孔中之前过早凝血，在加入凝血酶之前将p20移液器设置为15μL。使用预冷的吸头或将移液器吸头浸入冰冷的DMEM中几秒钟，然后将15μL细胞 - ECM混合物收集并转移到每个孔中。制备细胞-ECM混合物等分试样是一种最佳实践，这样一次接种的hMMT不超过6个。
   7. 为了接种组织，向每个孔中加入15μL细胞 - ECM混合物（即150，000个细胞）。小心地将细胞 -ECM混合物添加到椭圆形池的中心，避免将移液器尖端压入孔的底部。然后，通过两个轻动作，将细胞悬浮液散布在孔中每个柱子后面。一旦表面均匀地涂覆在细胞ECM悬浮液中，然后移动到下一个孔。
      注意:有效工作，以避免在所有组织接种之前将细胞 - ECM混合物过早凝胶化在管中。在播种孔时，避免转移气泡非常重要，因为气泡会干扰hMMT的重塑，使hMMT无法使用。
   8. 将盖子放在含有接种孔的10cm培养板上，然后转移到37°C组织培养箱中约5分钟。
      注意:将含有残留细胞-ECM混合物的微量离心管放入培养箱中，以确认凝胶聚合过程。
   9. 细胞 - ECM混合物聚合后，向每个MyoTACTIC孔中加入200μL预热的hMMT接种培养基。盖上10厘米培养皿的盖子，并将10厘米培养皿内的MyoTACTIC平板部分返回培养箱。此时间点称为第 -2 天。在下一步之前不要打扰组织。
4. 区分氢甲基熊猫
   1. 孵育2天后，使用移液管小心地除去hMMT播种培养基，并用200μL含有2%马血清，1%Pen / Strep，4%ACA（即，2mg / mL终浓度从50mg / mL的储备浓度;%表示为v / v）和10μg/ mL人重组胰岛素在DMEM中替换。此时间点称为分化的第 0 天。
   2. 此后每隔一天，用新鲜的分化培养基交换一半的培养基，直到分化的第12天，培养的最后一天（图2a）。
      注意:使用原代人肌母细胞制造hMMT的协议细节已在其他地方发表³⁰。如果存在接种后细胞活力的担忧，则用钙黄素和碘化丙啶孵育hMMTs以量化活力。

4. hMMT诱导后偏转的电刺激与分析

1. 在倒置显微镜上设置透明底部玻璃或塑料载物台支架，并使用显微镜相机支架将智能手机相机连接到显微镜目镜。将使用10倍放大倍率的相差显微镜（图3a）。
   注:任何配备10倍放大镜的倒置相差显微镜都是合适的。PDMS井结构将从10厘米的培养皿中取出，直接放置在透明的底台支架上，从而向空气开放。用70%乙醇对所有表面和设备进行消毒，并最大限度地减少实验过程中该区域的交通流量。
2. 为了准备电刺激电极，切下约30厘米的锡涂层铜线。然后，从25 G常规斜面针的轮毂开始，将约10厘米的电线紧紧缠绕在上半部分，留下约20厘米的多余电线。重复第二根针，然后将轮毂从每根针上切下。
   注意:导线必须紧紧地缠绕在针周围，以确保它不会移动，并且电极的导线缠绕部分不得接触PDMS，因为这会阻碍电场的产生。
3. 将 BNC 连接到鳄鱼夹连接器电缆，连接到波形发生器上的输出通道，并设置占空比为 20%、振幅为 5 V（电场强度为 10 V/cm）的方形脉冲通道。抽搐和破伤风收缩的频率将分别在0.5 Hz和20 Hz之间变化。
   注:波形发生器设置可能需要针对具体实验进行优化
4. 将含有hmMT的MyoTACTIC板部分放在显微镜载物台上，并将每个电极斜角端轻轻地插入椭圆形池中每个柱子的正后方PDMS中。小心地将20厘米的多余导线部分用胶带粘到显微镜载物台上，以使针保持垂直，并且每根导线的约10厘米保持自由连接（图3a）。
   注意:切勿将裸露的手指放在电极的两端。确保食指上戴着顶针，以便在插入PDMS时对电极施加轻压。
5. 将显微镜的视野聚焦在两个柱子中的一个上，使得焦点在最靠近电极的柱边缘上清晰。然后，将智能手机摄像头的焦点锁定在柱子最清晰的区域。这对于下游分析非常重要，因为在记录时焦点的改变会干扰分析。
6. 通过鳄鱼钳将胶带导线的自由端连接到波形发生器（图3a）。
7. 在智能手机摄像头上开始视频录制，然后打开频道输出以启动刺激。诱导 hMMT 经历 3 次抽搐和 3 次破伤风收缩，在抽搐和破伤风刺激系列之间休息 2 分钟。
8. 关闭通道输出，从镀锡铜线上取下鳄鱼夹，从电线上取下胶带，并用70%乙醇擦拭每个电极，然后再插入后续的hMMT孔中。对所有 hMMT 重复步骤 4.5 中的步骤。
   注意:通过一次刺激不超过3个组织来限制hMMT在培养箱外花费的时间。如果MyoTACTIC板部分内的其他hMMT仍有待分析，请将板返回培养箱10分钟，以使hMMTs返回至37°C。
9. 要分析后偏转以计算 hMMT 力生成，请使用自定义脚本，该脚本已在 GitHub 上提供（https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC）。按照 README.md 中的说明设置并启动脚本，然后打开每个帖子跟踪视频以执行力分析。
10. 沿柱边选择要跟踪柱位移的感兴趣区域 （ROI）。按Enter确认 ROI，然后再次按 Enter运行脚本（补充视频 1）。
    注:大偏转会导致智能设备出现故障。如果跟踪器在收缩期间发生故障，则可以增加ROI大小以使跟踪不那么敏感，但允许跟踪大偏转。代码中提供了三种大小，可以通过调整脚本注释进行调整。
11. 该脚本以两个输入要求结束。首先，输入 y 以确认视频包含多个收缩。其次，输入 y（ 是）或 n（ 否）以将结果导出到 .CSV 文件 （补充视频 1）.
12. 确保将后偏转结果报告为每次收缩的位移（以像素为单位）。将显微镜10倍放大倍率设置的像素转换为μm值。然后，通过将值（μm）乘以2.36μN / μm的力 - 位移转换因子，将位移后数转换为绝对收缩力（μN），这对应于MyoTACTIC制造中使用的PDMS的1:15固化剂与单体之比^30。

5. 使用电刺激进行钙瞬态分析

注意:对于钙处理实验，如前面所述，用MHCK7-GCAMP6报告器稳定地转导了永生化成肌细胞^11，12。转导细胞被FACS分选为GFP以获得阳性群体，然后用于制造hMMTs。钙成像的替代方法，例如使用比例度量染料，如Fura-2 AM和Indo-1或钙指示剂的荧光寿命成像（例如，Fluo-4或Oregon Green BAPTA1）可能适合我们的系统。

1. 如前所述，设置显微镜载物台和刺激设备（电极，波形发生器等）。对于此实验，请使用 4 倍放大倍率。
   注:需要一个暗室和一台配备CCD相机的落射荧光显微镜。
2. 启动显微镜成像软件，选择 FITC滤光片通道 （蓝光），然后选择 动画录制功能。设置为曝光 500 毫秒，分辨率为 680 x 510（分档 2x2）。
   注:成像软件可能会有所不同，曝光由用户手动设置。注意避免在刺激前过度暴露于hMMT。在休息时，带有自发荧光的深色组织轮廓/阴影是正常的，而清晰的组织图像过度暴露（补充视频2）。确保实验中所有hmMT的暴露是一致的。
3. 关闭显微镜快门并保持 FITC 通道关闭，直到准备好记录钙处理情况。
4. 设置完所有设备和软件后，检索包含要分析的hmMT的MyoTACTIC板部分，并将其直接设置在显微镜载物台上。然后，插入和连接电极，如前面的步骤4所述。
5. 使用明场将视野聚焦在所选 hMMT 的中心。然后，关闭灯。
6. 打开显微镜 FITC 通道快门，确认蓝光亮起，然后在软件中选择" 短片记录 "。
7. 打开波形发生器上的输出以启动电刺激。诱导 hMMT 经历 8 次抽搐和 8 次破伤风收缩。在抽搐和破伤风刺激系列之间等待2分钟的休息，在此期间，FITC快门处于关闭位置。
   注意:在电刺激之前和之后允许10秒的自发活动，以记录最小荧光，以便进行计算和数据分析。
8. 关闭通道输出，从镀锡铜线上取下鳄鱼夹，从电线上取下胶带，并用70%乙醇擦拭每个电极，然后再插入后续的hMMT孔中。对所有hMMT重复刺激和记录程序。
9. 以TIFF文件格式保存短片，以便在ImageJ或其他成像软件中进行分析。
   注意:通过一次刺激不超过3个组织来限制hMMT在培养箱外花费的时间。如果MyoTACTIC板部分内的其他hMMT仍有待分析，请将设备返回培养箱10分钟，以使hMMTs返回至37°C。
10. 要分析钙瞬态数据，请先打开ImageJ。选择分析 ，然后选择设置测量值 ，然后选择平均灰度值并取消选择所有其他选项。完成后，打开钙（.tiff）视频（补充视频2）。
11. 使用多边形选择工具勾勒出微组织的边框，并将此区域另存为ROI（补充视频2）。在"ROI 管理器"窗口中的"更多"下，选择"多重测量"，并在每个切片一行处测量所有文件切片的荧光强度（补充视频 2）。
12. 将所有测量值（包括切片数（帧））复制到电子表格中，并使用 ΔF/F₀ = （F_即刻 - F_最小值）/F_最小值 （补充视频 2）将每个切片的荧光强度与文件中的最小自发荧光强度进行比较。
13. 通过将短片记录帧速度乘以切片数（帧）来计算每帧的时间，并绘制hMMT钙瞬态响应对刺激的ΔF / F₀与时间的关系（补充视频2）。
14. 选择6个连续收缩和平均值中每个峰值钙瞬时信号，以计算每个hMMT的相对平均峰值荧光强度变化（补充视频2）。
    注意:始终从整体分析中排除由第一次抽搐收缩引起的数据。GitHub（https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-）上提供了一个名为"钙处理模板.xlsx"的电子表格，以方便hMMT钙瞬态分析。要输入值和输入的可填充单元格以灰色突出显示。确保调整峰值选择数字，因为这只是帮助选择峰值的指南（补充视频2）。

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结果

本文描述的方法是从PU模具中铸造基于96孔PDMS的MyoTACTIC培养平台，以制造hMMT复制组织阵列，并分析培养装置内hMMT功能的两个方面 - 力生成和钙处理。图1提供了在hMMT播种前制备MyoTACTIC培养孔的示意图。PDMS是一种广泛使用的有机硅基聚合物，可以很容易地模塑成复杂的器件^32。基于PDMS的协议旨在从制造的负PU模具³⁰中铸造无限数量的96孔培养...

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讨论

本手稿描述了制造和分析3D hMMT培养模型的方法，该模型可应用于基础肌肉生物学，疾病建模或候选分子测试的研究。MyoTACTIC平台成本友好，易于制造，并且需要相对较少的细胞来产生骨骼肌微组织。在MyoTACTIC培养平台内形成的hMMTs由对齐，多核和横纹肌管组成，并通过启动触发收缩的钙瞬变来响应电刺激（图2，图3，图4）。先前?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline Solution, Sterile	House Brand	1010	10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C
25G Needle	BD, Medstore, University of Toronto	2548-CABD305127
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder	Sigma - Aldrich	A2504-100G	A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
6.35 mm ID Tubing	VWR	60985-528
AB1167 Myoblast Cell Line	Institut de Myologie (Paris, France)
Arbitrary Waveform Generator	Rigol	DG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex)	Thermo Fisher Scientific	A14132-02	Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C
Benchtop Vacuum Chamber	Sigma - Aldrich	D2672
BNC to Aligator Clip Cable			Ordered from Amazon
Culture Plastics	Sarstedt		Includes culture plates, serological pipettes, etc
Dimethyl Sulfoxide	Sigma - Aldrich	D8418-250ML
DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium	Thermo Fisher Scientific	21600069
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Fibrinogen from Bovine Plasma	Sigma - Aldrich	F8630-5G	Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size	Sarstedt	83.1826.001
Horse Serum	Gibco	16050-122
Human Recombinant Insulin	Sigma - Aldrich	91077C	Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C
Image Acquisition Software	Olympus	cellSens Dimension
Image Processing Software	National Institutes of Health	ImageJ
Isotemp Oven	Thermo Fisher Scientific	201
Microscope	Olympus	IX83
Microscope - Camera Mount	Labcam	Labcam for iPhone	Ordered from Amazon
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic Disposable Syringes, 1cc	BD	2606-309659
Plastic Disposable Syringes, 50cc	BD	2612-309653
Pluronic F-127, Powder, BioReagent	Sigma - Aldrich	P2443-250G	A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)	Dow	4019862	Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Polyurethane Negative Mold	In House
Release Agent	Mann Release Technologies	200
Rotary Vane Vacuum Pump	Edwards	A65401906
Scalpel	Almedic, Medstore, University of Toronto	2586-M36-0100
Single Edge Razor Blade	VWR	55411-050
Skeletal Muscle Cell Basal Medium	Promocell	C-23260	30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C.
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell	C-23060	42 mL aliquots are generated and stored at 4°C.
Smartphone (iPhone)	Apple	SE
Standard Duty Dry Vacuum Pump	Welch	2546B-01
Sterilization Bag	Alliance	211-SCM2
Thimble	Igege		Ordered from Amazon
Thrombin from human plasma	Sigma - Aldrich	T6884-250UN	100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C.
Tin coated copper wire	Arco	B8871K48	Ordered from Amazon
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA, 0.25%	Thermo FIsher Scientific	25200072
Vacuum Chamber 2	SP Bel-Art	F42027-0000