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摘要

该协议描述了非侵入性跟踪T细胞的方法，该T细胞经过基因工程改造，以使用临床可用的平台 在体内 表达嵌合抗原受体。

摘要

经过基因工程改造以表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞在B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤（MM）患者的关键临床试验中显示出前所未有的结果。然而，由于运输和浸润肿瘤部位以及体内缺乏持久性，许多障碍限制了疗效并禁止了CAR T细胞疗法的广泛使用。此外，危及生命的毒性，如细胞因子释放综合征或神经毒性，是主要问题。对CAR T细胞进行高效和灵敏的成像和跟踪，可以评估T细胞的运输，扩增和体内表征，并允许制定策略来克服CAR T细胞治疗的当前局限性。本文描述了在临床前模型中使用[18F]四氟硼酸盐 - 正电子发射断层扫描（[18F]TFB-PET）在CAR T细胞中掺入碘化钠共排（NIS）和CAR T细胞成像的方法。除了用于本研究的方法外，该协议中描述的方法还可以应用于其他CAR构建体和靶基因。

引言

嵌合抗原受体 T （CAR T） 细胞疗法是血液系统恶性肿瘤中一种迅速出现且具有潜在治愈意义的方法1，2，3，4，5，6。在CD19指导的CAR T（CART19）或B细胞成熟抗原（BCMA）CAR T细胞治疗后报告了非凡的临床结果2。这导致美国食品和药物管理局（FDA）批准CART19细胞用于侵袭性B细胞淋巴瘤（axicabtagene ciloleucel（Axi-Cel）4，tisagenlecleucel（Tisa-Cel）3和lisocabtagene maraleucel）7，急性淋巴细胞白血病（Tisa-Cel）5，8，套细胞淋巴瘤（brexucabtagene autoleuce）9和滤泡性淋巴瘤（Axi-Cel）10.最近，FDA批准了BCMA指导的CAR T细胞疗法用于多发性骨髓瘤（MM）（idecabtagene vicleucel）患者11。此外，用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）的CAR T细胞疗法正处于后期临床开发阶段，预计将在未来三年内获得FDA批准1。

尽管CAR T细胞疗法取得了前所未有的成果，但其广泛使用受到以下因素的限制:1） 体内 CAR T细胞扩增不足或向肿瘤部位的运输不良，导致持久反应率降低12，13和2）危及生命的不良事件的发展，包括细胞因子释放综合征（CRS）14，15.CRS的标志不仅包括导致炎症细胞因子/趋化因子水平升高的免疫激活，还包括CAR T细胞输注后的大量T细胞增殖15，16。因此，开发一种经过验证的临床级策略 来对体内 CAR T细胞进行成像将允许1） 体内 实时CAR T细胞跟踪，以监测它们向肿瘤部位的运输并揭示潜在的耐药机制，以及2）监测CAR T细胞扩增并可能预测其毒性，例如CRS的发展。

轻度CRS的临床特征是高烧、疲劳、头痛、皮疹、腹泻、关节痛、肌痛和不适。在更严重的CRS中，患者可能出现心动过速/低血压，毛细血管渗漏，心功能不全，肾/肝衰竭和弥散性血管内凝血17，18。一般而言，细胞因子（包括干扰素-γ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素 （IL）-10 和 IL-6）的升高程度已被证明与临床症状的严重程度相关17，19。然而，由于成本高且可用性有限，广泛应用"实时"血清细胞因子监测来预测CRS是困难的。为了利用CAR T细胞疗法的有益特性，可以潜在地利用过继T细胞的非侵入性成像来预测CAR T细胞输注后的疗效，毒性和复发。

一些研究人员已经开发出使用基于放射性核素的成像与正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射计算机断层扫描（SPECT）的策略，其提供高分辨率和高灵敏度20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30CAR T细胞转运的体内可视化和监测。在这些基于放射性核素的成像策略中，碘化钠共排量（NIS）已被开发为使用PET扫描对细胞和病毒进行成像的灵敏方式31，32。使用 [18F]TFB-PET 进行 NIS+CAR T 细胞成像是一种灵敏、高效且方便的技术，可用于评估和诊断 CAR T 细胞扩增、转运和毒性30。该协议描述了1）通过具有高效率的双重转导开发NIS + CAR T细胞和2）用[18F]TFB-PET扫描对NIS + CAR T细胞进行成像的方法。然而，这些方法可以应用于任何其他CAR T细胞疗法。

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研究方案

该协议遵循Mayo Clinic机构审查委员会，机构生物安全委员会和Mayo Clinic机构动物护理和使用委员会的指导方针。

1. NIS+ BCMA-CAR-T细胞生产

注意:本议定书遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB 17-008762）和机构生物安全委员会（IBC Bios00000006.04）的指导方针。

  1. 生产BCMA-CAR，NIS和荧光素酶 - 绿色荧光蛋白（GFP）编码慢病毒。
    注:从头合成第二代BCMA-CAR构建体（见材料表），并在伸长因子-1α（EF-1α）启动子的控制下克隆成第三代慢病毒载体。BCMA-CAR构建体（C11D5.3-41BBz）包括4-1BB共刺激和来自抗人BCMA抗体克隆C11D5.333，34的单链可变片段（scFv）。NIS在EF-1α启动子的控制下，并通过自切割肽（P2A）与嘌呤霉素抗性基因结合。编码荧光素酶-GFP的慢病毒载体（见材料表）用于转导肿瘤细胞，然后表达GFP和荧光素酶。
    1. 制备慢病毒载体质粒:pLV-EF1α-BCMA-CAR（15μg），pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro（15μg）和pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro（15μg）。
      注:pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro和pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro含有嘌呤霉素耐药基因。因此，NIS-或荧光素酶-GFP转导的细胞可以选择1μg/mL或2μg/mL的嘌呤霉素二盐酸盐，如前所述14，35。
    2. 将20×106个293T细胞中的106 个放入T175烧瓶中，并在37°C下孵育24小时，其中5%CO 2。通过在显微镜下直接可视化，确认293T细胞以70-90%汇合均匀分布在烧瓶上。
    3. 准备15μg表达载体（例如CAR，NIS或荧光素酶-GFP线性DNA），7μg包膜载体（VSV-G）和18μg包装载体（gag，pol，rev和tat）的预混液。将DNA预混液稀释在4.5mL转染培养基中，然后加入111μL预络合试剂（混合物A）。
    4. 准备一个新的试管，并将129μL脂质体转染试剂稀释在4.5mL转染培养基（混合物B）中。
    5. 将混合物A和B混合，轻拂管子以混合内容物。在室温（RT）下孵育30分钟。
    6. 孵育后，只需吸出细胞上清液而不分离细胞，并加入16mL含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺的生长培养基。然后，将混合物A和B的混合物滴加在293T细胞上。最后，将转染的细胞在37°C，5%CO 2 下孵育24小时。
    7. 在转染后的第1天和第2天，收获293T的上清液，以900× g 旋转10分钟，然后通过0.45μm尼龙过滤器过滤。通过以112，700× g 超速离心2小时，在24和48小时浓缩滤液，并在-80°C下冷冻。
  2. 离体 T细胞分离（图1）
    注意:使用无菌技术和个人防护设备在层流柜中执行所有细胞培养工作。外周血单核细胞（PBMC）是从血液分离过程中收集的健康志愿者献血者血液中收获的36。对本研究中使用的人类细胞进行病原体筛选。
    1. 使用标准密度梯度技术隔离 PBMC。
      1. 将15mL密度梯度培养基（密度为1.077g / mL）（含有α-D-吡喃葡萄糖苷，β-D-果糖呋喃糖基均聚物和3-（乙酰氨基）-5-（乙酰基甲基氨基）-2，4，6-三碘苯甲酸单钠盐）轻轻加入50mL密度梯度分离管中，而不会产生气泡（见 材料表）。
      2. 为避免细胞潴留，用含有2%FBS的磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.2g / L氯化钾，0.2g / L磷酸钾，8g / L氯化钠和1.15g / L磷酸钠二碱）以1:1的体积比稀释血液样品。轻轻地将稀释的血液转移到密度梯度培养基的顶部，而不会破坏两者之间的界面。在室温下以1，200× g 旋转10分钟。
        注意:50 mL密度梯度分离管可用于分离4-17 mL血液样品。本方案中使用的50 mL密度梯度分离管（见 材料表）在离心过程中不需要"制动器关闭"。但是，当使用标准的50 mL管时，制动器需要关闭，并且需要30分钟的离心。
      3. 将上清液转移到新的50 mL锥形管中，用PBS + 2%FBS填充至50 mL洗涤，然后在室温下以300× g 旋转8分钟。
      4. 吸出上清液，并将沉淀的细胞重悬于50mL PBS + 2%FBS中。计数细胞数量，然后在室温下以300× g 离心8分钟。
    2. 吸出上清液，并将沉淀细胞重悬至50×106 个细胞/ mL的浓度，PBS + 2%FBS。
    3. 使用负选磁珠试剂盒从 PBMC 中分离 T 细胞。
      注意:理想的阴性选择试剂盒包括附着在T细胞以外的细胞上表达的抗原抗体上的磁珠。常用的试剂盒包含与磁珠偶联的抗体，可对抗CD15、CD14、CD34、CD36、CD56、CD123、CD235a、CD19和CD16（ 材料表）。
      1. 将 PBMC 转移到 14 mL 聚苯乙烯圆底管中。然后，将PBMCs和阴性选择抗体混合物放入全自动细胞分离器中，并根据制造商的协议进行T细胞分离。
  3. T细胞刺激和T细胞扩增（图1）
    1. 为了培养分离的T细胞，用补充有10%人血清白蛋白和1%青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺的无血清造血细胞培养基（TCM）制备T细胞扩增培养基（TCM）14。T细胞分离后，计数细胞并以2×106 个细胞/ mL的浓度与中医培养。
    2. 在用T细胞培养之前，用中药洗涤抗CD3 / CD28珠三次。
      1. 通过旋转混合含有珠子的小瓶。然后，将所需体积的微珠（3:1微珠:细胞）（例如，当刺激1.0×106 个T细胞时，使用3.0×106 个抗CD3 / CD28微球）移液到无菌微量离心管（1.5mL）中，并在1mL中药中重悬。
    3. 将带有微珠的微量离心管放在磁铁上1分钟，然后吸出上清液。从磁铁中取出管子，并将洗涤的珠子重悬于1 mL中药中。重复前两个步骤，总共洗涤3次。
    4. 将磁珠重悬于1mL中药中，并将其转移到T细胞中。然后，用中药将T细胞稀释至终浓度为1.0×106 个细胞/ mL。将T细胞/微珠悬浮液转移到组织培养处理的6孔板中，并将其置于培养箱（37°C，5%CO 2）中。
  4. 慢病毒滴定（图2）
    1. 准备用于滴定测定的T细胞。确保大约1.0 x 106 个细胞可用于滴定一种类型的病毒。
    2. 刺激T细胞，如1.3.2节所述。
    3. 板1.0×96孔板（滴度板）中105 个受刺激的T细胞，并在37°C，5%CO 2 下孵育24小时（图2A）。分离和刺激T细胞，如第1.2节所述。
    4. 通过将100μL中药加入指定柱的孔和未转导的对照孔中来制备稀释板（96孔板）（图2B）。
    5. 在冰上解冻一小瓶慢病毒颗粒，然后轻轻地上下移液以充分混合。将50μL病毒上清液转移到96孔板（稀释3）的柱6孔中（图2B）。上下移液以充分混合。
    6. 进行连续稀释（2倍连续稀释）:将50μL从孔A6转移到孔B6，然后从孔B6转移到孔C6的50μL;重复上述步骤，直到 G6。然后，将50μL稀释的病毒加入滴度板（图2B）。
    7. 将滴度板在37°C，5%CO 2 下孵育48小时，并通过流式细胞术测定CAR-，NIS-或GFP阳性细胞的百分比（图2C）。
      1. 通过在4°C下以650× g 旋转滴度板两次3分钟来洗涤孔。
      2. 按照步骤1.5.3至1.5.9所述染色转导的T细胞。
      3. 使用式（1）根据CAR，NIS或GFP阳性细胞的百分比确定滴度:
        滴度 = 在转导×比稀释/体积×BCMA-CAR+ 或NIS+ T细胞计数的百分比 （1）
  5. 慢病毒和新近分泌素的转导+BCMA-CAR-T 细胞扩增
    1. T细胞刺激后24~48小时，对刺激的T细胞进行慢病毒转导（T细胞应形成簇）。
      1. 在4°C下解冻编码CAR或NIS的冷冻慢病毒。
      2. 将受刺激的T细胞充分混合以分解簇，只需以5.0的多重感染（MOI）加入新鲜解冻的病毒（当转导1.0×106 个T细胞时，使用5.0×106 个慢病毒）。将转导的细胞在37°C，5%CO 2下孵育。
      3. 在第3天、第4天和第5天，使用血细胞计数器37或全自动细胞计数器38计数转导的T细胞，并通过加入新鲜的预热中药将细胞浓度调节至1.0×106 个细胞/mL。对于携带嘌呤霉素耐药基因的NIS转导T细胞，在第3天，第4天和第5天用1μg/ mL盐酸嘌呤霉素处理细胞。
    2. 在第6天，通过充分混合以分解T细胞簇并将其置于磁铁中1分钟，从转导的T细胞（从步骤1.3.4中）中取出抗CD3 / CD28微珠。然后，只需将收集的转导T细胞以1.0×106 个细胞/ mL的浓度重新培养物中。从T细胞中除去磁珠后，通过流式细胞术评估CAR和NIS的表达。
      注意:由于BCMA-CAR的单链可变片段来自小鼠，因此可以用与Alexa Fluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG（H + L）染色。NIS可以使用抗人ETNL[对应于aa625-643（SWTPCVGHDGGRDQQETNL）的合成肽]进行检测。该抗体可识别 NIS 的胞质 C 末端。因此，在与抗人NIS抗体孵育之前，必须对T细胞进行通透。
    3. 使用山羊抗小鼠IgG（H + L）进行BCMA-CAR的表面染色。
      1. 取等分试样培养物（例如，50，000个T细胞）并用流动缓冲液（PBS，1%FBS和1%叠氮化钠）洗涤。接下来，用50μL流动缓冲液重悬细胞，并用1μL山羊抗小鼠抗体检测CAR表达和0.3μL活死水染色细胞以排除死细胞。
      2. 在室温下在黑暗中孵育15分钟，通过加入150μL流动缓冲液洗涤细胞，并在4°C下以650× g 离心细胞3分钟。
    4. 表面CAR染色后，通过加入100μL固定培养基（PBS与4.21%甲醛）固定并渗透细胞，并在4°C下孵育20分钟。 用含有细胞透化剂如皂苷（650× g 在4°C下3分钟）的100μL缓冲液洗涤细胞两次。
    5. 将固定/透化细胞重悬于50μL通透缓冲液中。然后，在50μL流动缓冲液中加入0.3ng抗人ETNL NIS抗体，并在4°C下孵育1小时。
    6. 加入150μL流动缓冲液，并在4°C下以650× g 离心细胞3分钟。 将细胞与2.5μL抗二抗在50μL流动缓冲液中孵育细胞，在4°C下30分钟，通过加入150μL流动缓冲液洗涤细胞，并在4°C下以650× g 离心3分钟。
    7. 最后，重悬于200μL流缓冲液中并进行流式细胞术以确定转导效率（图3A，B）。
    8. 在第8天，计数并在4°C下以300× g 旋转T细胞8分钟。 将T细胞与冷冻培养基（90%FBS + 10%二甲基亚砜[DMSO]）以10×106 / mL的浓度重悬，然后将每个1mL转移到标记的冷冻管中。
    9. 将小瓶置于-80°C冰箱中48小时。48小时后（到第10天），将T细胞转移到液氮中。
      注:有关NIS+ CAR T电池生产的概述，请参见图1。图3D代表了来自三种不同供体的离体T细胞扩增的例子。

2. NIS+ BCMA-CAR-T 细胞成像与 [ 18F]TFB-PET 扫描

注意:本协议遵循梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC A00001767-16），IRB和IBC（Bios00000006.04）的指导方针。OPM-2是BCMA + MM细胞系，通常用作BCMA-CAR T细胞的靶细胞系39，40。

  1. 建立荧光素酶+ BCMA + OPM-2细胞。
    1. 在组织培养处理的24孔板中接种500，000个OPM-2细胞。在4°C下解冻编码荧光素酶-GFP的慢病毒。
    2. 将MOI为3.0的新鲜解冻的病毒加入OPM-2细胞中，并通过移液充分混合。将板放入培养箱（37°C，5%CO 2）。。
    3. 转导后48小时，加入2μg/mL嘌呤霉素以选择转导的细胞。转导后四天，通过流式细胞术评估GFP阳性细胞（荧光素酶阳性）（图3E）。
  2. 建立BCMA + OPM-2异种移植小鼠模型（图4）。
    1. 计数荧光素酶+ OPM-2细胞并使其旋转两次以除去所有细胞培养基。用PBS以10×106 个细胞/ mL的浓度重悬OPM-2细胞。
    2. 在第-21天，将100μL（1.0×106个细胞）的荧光素酶+ OPM-2细胞注射到8至12周龄免疫功能低下的NOD-scid IL2rγnull（NSG）小鼠的尾部（图4）。
    3. 在OPM-2细胞注射后的第20天（CAR T细胞注射的第-1天），通过生物发光成像（BLI）检查肿瘤负荷（图4）。
      注意:OPM-2细胞形成生长缓慢的肿瘤，通常需要2-3周才能植入。
    4. 通过腹膜内（IP）注射向OPM-2异种移植小鼠施用10μL / g D-荧光素。10分钟后，在2%异氟醚气体下对小鼠进行BLI（图5A）。确认肿瘤移植后，根据肿瘤负荷随机分配小鼠。
    5. 在CAR T细胞注射的第-1天，解冻NIS + BCMA-CAR T细胞，并通过离心（300× g，8分钟，4°C）除去冷冻培养基。然后，将中药细胞以2.0×106 个细胞/ mL重悬并孵育过夜（37°C，5%CO 2）。
    6. 在第0天，计数并离心NIS + BCMA-CAR T细胞（300×g，8分钟，4°C）。用PBS以50×106个细胞/mL重悬NIS+ BCMA-CAR T细胞。
    7. 通过尾静脉注射向OPM-2异种移植小鼠施用100μL（5.0×106 个细胞）的NIS + BCMA-CAR T细胞。在第7天和第15天，使用PET扫描对小鼠进行成像。
  3. NIS + BCMA-CAR T细胞体内 成像使用BCMA + OPM-2异种移植小鼠模型。
    1. 在成像前称量小鼠，并取下任何金属耳标以消除与金属相关的伪影。
    2. 如前所述准备 [18F]TFB41。
      注:[18F]TFB必须在使用当天生产。放射化学纯度应为>99%，摩尔活性>5 GBq/mmol。
    3. 通过尾静脉注射静脉注射9.25 MBq [18F]TFB。允许约40分钟的摄取期，使放射性示踪剂分布在体内并清除血液。
    4. 使用异氟醚吸入麻醉小鼠（2%）。
      注意:异氟醚是首选的吸入麻醉剂，因为它具有快速可靠的起效和恢复。
    5. 在麻醉小鼠之前，用消毒剂清洁剂清洁麻醉机的所有表面。
    6. 将鼠标放在感应室内。将汽化器转盘转至2%，等待鼠标在1-2分钟内卧起且无响应。
    7. 监测小鼠以避免麻醉不足或呼吸功能过度抑制。简而言之，捏住脚趾以确认麻醉不足。
      注意:正常呼吸频率高达 180/min，可接受的下降率为 50%。
    8. 使用眼科软膏以避免角膜干燥和创伤。
    9. 注射后45分钟，用麻醉小鼠在微型PET/CT成像工作站中获取PET / CT图像（见 材料表）。接下来，采集静态PET图像15分钟，然后采集5分钟CT图像，360°旋转，在500μA，80 keV和200 ms曝光下进行180次投影。
  4. 分析采集的成像数据
    1. 使用PET图像处理软件分析图像（图5B 和 补充视频S1）。
    2. 定义感兴趣的量 （VOI）。
    3. 使用公式（2）计算标准化摄取值（SUV）。
      VOI中的SUV = VOI中的活性浓度（MBq / mL）×体重（g）/给药剂量（MBq）（2）
  5. 使用流式细胞术确认NIS + BCMA-CAR T细胞运输到肿瘤部位
    1. [18F]TFB-PET 成像后，将鼠标放回笼中。停止麻醉后，监测动物，直到它们能够有目的地移动，并确保它们能够获得食物和水。
    2. 监测小鼠直到注射的[18F]TFB的腐烂。一旦放射性同位素无法检测到，就用CO2对小鼠实施安乐死。
    3. 要实施安乐死，将小鼠放入笼子中（每个笼子不超过5只小鼠）。
    4. 将小鼠暴露于CO2 中，直到大约5-10分钟内完全停止呼吸。
      注意:这种安乐死方法必须符合AVMA动物安乐死指南（2020年版）。
    5. 为了确保小鼠的死亡，通过抓住动物的后脑勺和尾巴的底部，然后彼此分开/远离双手来进行颈椎脱位。
    6. 采集骨髓以确认NIS + BCMA-CAR T细胞有效地运输到肿瘤部位。
    7. 将收获的股骨和胫骨转移到含有5mL细胞培养基的6孔板中。从股骨和胫骨上取下肌肉和肌腱，只需切开股骨和胫骨的两端（关节上方）。
    8. 用细胞培养基填充胰岛素注射器，并将骨髓冲洗到6孔板上。对于股骨，使用22 G针头和5 mL注射器，因为股骨直径大于胫骨直径。
    9. 使用柱塞的平端研磨骨髓。将70μm细胞过滤器放在无菌的50mL锥形管上，并过滤研磨的骨髓。然后，用流动缓冲液填充管，并在4°C下以300× g 离心管8分钟。
    10. 吸出上清液，并用5 mL流动缓冲液重悬骨髓。将200μL骨髓转移到96孔板中。在4°C下以300× g 离心板3分钟。 倾析上清液，并用50μL流动缓冲液重悬细胞。
    11. 用针对0.25μg小鼠CD45，0.03μg人CD45，0.06μg人CD3，0.24μg人BCMA和0.3μL活/死水的流动抗体染色骨髓。在黑暗中在室温下孵育平板15分钟。
    12. 在4°C下以300× g 离心板3分钟。 然后，加入200μL流缓冲液，并在流式细胞仪上运行（图5C）。

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结果

图1 表示生成NIS + BCMA-CAR T细胞的步骤。在第0天，分离PBMC，然后通过阴性选择分离T细胞。然后，用抗CD3 / CD28珠刺激T细胞。在第1天，用NIS和BCMA-CAR慢病毒转导T细胞。在第3天、第4天和第5天，计数T细胞并用培养基进料，将浓度调整为1.0×106 / mL。对于NIS转导的T细胞，加入1μg/ mL嘌呤霉素以选择NIS + 细胞。在第6天，通过将细胞放入磁铁中一分钟来去除珠?...

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讨论

本文描述了一种将NIS掺入CAR T细胞并通过[18F]TFB-PET在体内对注入的CAR T细胞进行成像的方法。作为概念验证，NIS + BCMA-CAR T细胞通过双转导产生。我们最近报道说，将NIS掺入CAR T细胞不会损害CAR T细胞在体内的功能和功效，并允许CAR T细胞运输和扩增30。随着CAR T细胞疗法继续从目前的B细胞恶性肿瘤扩展到CLL中的应用，对允许非侵入性体内成像和?...

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披露声明

SSK是CAR免疫疗法专利的发明人，该专利授权给诺华（通过Mayo Clinic，宾夕法尼亚大学和诺华公司之间的协议）和Mettaforge（通过Mayo Clinic）。RS，MJC和SSK是CAR免疫疗法领域专利的发明者，这些专利已授权给Humanigen。SSK获得了Kite，Gilead，Juno，Celgene，Novartis，Humanigen，MorphoSys，Tolero，Sunesis，Leahlabs和Lentigen的研究经费。数字是用 BioRender.com 创建的。

致谢

这项工作得到了Mayo Clinic K2R管道（SSK），Mayo Clinic Center for Personalized Medicine（SSK）和Predolin Foundation（RS）的部分支持。图 1、2 和图 4 是使用 BioRender.com 创建的。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
22 Gauge needleCovidien8881250206
28 gauge insulin syringeBD329461
96 well plateCorning3595
Anti-human (ETNL) NISImanisREA009ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow antibody
Anti-rabbit IgGR&DF0110Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generationIDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution KitBD554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652flow cytometer
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok TipsBD309646
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serumMillipore SigmaF8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scannerSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging SystemPerkinElmerCLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer 124262
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitationInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), LiquidGibco10378-016
PMOD softwarePMODPBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma DerivedInnovative ResearchIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.0210055210
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 flaskCorning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-418Q

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