mirMachine:植物miRNA注释的一站式商店

摘要

在这里，我们提出了一种新的全自动miRNA管道mirMachine，它1）可以更准确地识别已知和新型的miRNA，2）是全自动且免费提供的。用户现在可以执行一个简短的提交脚本来运行全自动的 mirMachine 管道。

摘要

在不同类型的非编码RNA中，microRNA（miRNA）可以说在过去十年中一直备受关注。作为基因表达的转录后调节因子，miRNA在各种细胞途径中起着关键作用，包括发育和对a/生物胁迫（如干旱和疾病）的反应。拥有高质量的参考基因组序列能够在几种植物物种中鉴定和注释miRNA，其中miRNA序列高度保守。由于计算miRNA鉴定和注释过程大多是容易出错的过程，因此基于同源的预测提高了预测的准确性。在过去的十年中，我们开发并改进了miRNA注释管道SUmir，从那时起，该管道已被用于多个植物基因组。

本研究提出了一种完全自动化的新型miRNA管道mirMachine（miRNA Machine），方法是（i）在二级结构预测上增加额外的过滤步骤，（ii）使其完全自动化，以及（iii）引入新的选项来预测基于同源性的已知miRNA或使用以前的管道基于小RNA测序读数的新型miRNA。新的miRNA管道mirMachine使用拟南芥信息资源TAIR10， 拟南芥 基因组的发布和国际小麦基因组测序联盟（IWGSC）小麦参考基因组v2进行了测试。

引言

下一代测序技术的进步拓宽了对RNA结构和调控元件的理解，揭示了功能上重要的非编码RNA（ncRNA）。在不同类型的ncRNA中，microRNA（miRNA）构成了植物中长度在19至24个核苷酸之间的小RNA的基本调节类别1^，2。自从在线虫秀丽隐杆线虫3中发现第一个miRNA以来，miRNA的存在和功能已经在动植物基因组以及4，^5，6中得到了广泛的研究。miRNA通过靶向mRNA进行切割或翻译抑制来发挥作用⁷。越来越多的证据还表明，miRNA参与植物的各种生物过程，包括生长和发育⁸，自我生物发生⁹以及几种生物和非生物胁迫反应¹⁰。

在植物中，miRNA最初是从称为pri-miRNA¹¹的长初级转录本加工而来的。这些由细胞核内的RNA聚合酶II产生的pri-miRNA是长转录物，形成不完美的折返结构¹²。pri-miRNA后来经历切割过程，产生miRNA的内源性单链（ss）发夹前体，称为pre-miRNA¹¹。前miRNA形成发夹状结构，其中单链折叠成双链结构以切除miRNA双链（miRNA/miRNA*）¹³。Dicer样蛋白切割miRNA/miRNA*双链的两条链，留下2-核苷酸3'-突出部^14，15。miRNA 双链体在细胞核内甲基化，保护 miRNA 的 3'-末端免受降解和尿苷化活性^16，17。解旋酶在输出后解开甲基化的miRNA双链体，并将成熟的miRNA暴露于细胞质中RNA诱导的沉默复合物（RISC）¹⁸。双链的一条链是成熟的miRNA并入RISC，而另一条链miRNA*被降解。miRNA-RISC复合物与靶序列结合，导致mRNA在完全互补的情况下降解，或在部分互补的情况下导致翻译抑制¹³。

基于表达和生物发生特征，已经描述了miRNA注释的指南^15，19。根据定义的指南，Lucas和Budak开发了SUmir管道，以在植物⁹中进行基于同源的计算机miRNA鉴定。SUmir 管道由两个脚本组成:SUmirFind 和 SUmirFold。SUmirFind 通过国家生物技术信息中心 （NCBI） 基本局部比对搜索工具 （BLAST） 筛选对已知的 miRNA 数据集进行相似性搜索，并使用修改后的参数来包括只有 2 个或更少不匹配的命中，并避免偏向较短的命中（blastn-short -unapped -punishment -1 -reward 1）。SUmirFold使用^{UNAfold 21}评估BLAST²⁰结果中推定miRNA序列的二级结构。SUmirFold通过鉴定发夹结构的特征来区分miRNA与小干扰RNA。此外，它通过参数、最小折叠能量指数> 0.67 和 GC 含量 24-71% 来区分 miRNA 与其他 ssRNA（如 tRNA 和 rRNA）。该管道最近进行了更新，增加了两个额外的步骤，以（i）提高灵敏度，（ii）提高注释准确性，以及（iii）提供预测miRNA基因的基因组分布²²。鉴于植物miRNA序列²³的高度保守性，该管道最初设计用于基于同源的miRNA预测。然而，这种生物信息学分析无法准确鉴定新型miRNA，因为它严重依赖于密切相关物种之间miRNA的序列保守。

本文提出了一种新的全自动miRNA管道mirMachine，它1）可以更准确地识别已知和新型miRNA（例如，该管道现在使用基于sRNA-seq的新型miRNA预测以及基于同源的miRNA鉴定）和2）完全自动化且免费提供。输出还包括预测miRNA的基因组分布。mirMachine在小麦和 拟南芥 基因组中测试了基于同源性和基于sRNA-seq的预测。虽然最初作为自由软件发布，但UNAfold在过去十年中成为商业软件。通过这次升级，二级结构预测工具从UNAfold切换到RNAfold，以便可以免费使用mirMachine。用户现在可以执行一个简短的提交脚本来运行全自动的 mirMachine 管道（ 示例在 https://github.com/hbusra/mirMachine.git 中提供）。

研究方案

1. 软件依赖和安装

1. 从其主站点或使用 conda 安装软件依赖项。
   1. 下载并安装 Perl，如果尚未安装，请从其主站点 （https://www.perl.org/get.html）。
      注意:表示的结果是使用 Perl v5.32.0 预测的。
   2. 从其主站点（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/）下载Blast+，一个对齐程序，作为可执行文件和源代码。
      注意:表示的结果是使用 BLAST 2.6.0+ 预测的。
   3. 从 https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/ 安装RNAfold的预编译包。
   4. 或者，使用以下 conda 安装这些软件:i） conda install -c bioconda blast;ii） 康达安装-c Bioconda Viennarna。

2. 幻影机的设置和测试

1. 从 GitHub， https://github.com/hbusra/mirMachine.git 下载最新版本的 mirMachine 脚本和 mirMachine 提交脚本，然后将脚本路径设置为 PATH。
2. 使用 GitHub 上提供的测试数据来确保 mirMachine 及其所有依赖项已正确下载。
3. 在下面显示的测试数据上运行 mirMachine。
   bash mirMachine_submit.sh -f iwgsc_v2_chr5A.fasta -i mature_high_conf_v22_1.fa.filtered.fasta -n 10
   注意:将 -n 选项设置为 10，因为测试数据仅包含小麦基因组的一个染色体。缺省情况下， -n 选项设置为 20。
4. 控制预测的成熟miRNA的 hairpins.tbl.out.tbl 输出文件，其预测的前体及其在染色体上的位置。
5. 检查日志文件中的程序输出和警告。

3. 基于同源性的miRNA鉴定

1. 使用如下所示的 bash 脚本运行 mirMachine:
   bash mirMachine_submit.sh -f $genome_file -i $input_file -m $mismatches -n $number_of_hits
2. 检查预测的miRNA。查找名为 $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl 的输出文件，用于预测的 miRNA。查找名为 $input_file.results.tbl.hairpins.fsa 的输出文件，用于前 miRNA FASTA 序列。查找名为 $input_file.results.tbl.hairpins.log 的输出文件作为发夹日志文件。

4. 新型miRNA鉴定

1. 将sRNA-seq FASTQ文件预处理为正确的FASTA格式。如果需要，修剪适配器。不要修剪低质量的阅读;相反，请删除它们。删除包含 N 的读取。将 FASTQ 文件转换为 FASTA 文件 （$input_file）。
2. 使用如下所示的 bash 脚本运行 mirMachine。
   bash mirMachine_submit.sh -f $genome_file -i $input_file -n $number_of_hits -sRNAseq -lmax $lmax -lmin $lmin -rpm $rpm
   注意: 对于 基于 sRNA-seq 的预测，$mismatches设置为 0。
3. 检查预测的miRNA。查找名为 $input_file.results.tbl.hairpins.tbl.out.tbl 的输出文件，用于预测的 miRNA。查找名为 $input_file.results.tbl.hairpins.fsa 的输出文件，用于前 miRNA FASTA 序列。查找名为 $input_file.results.tbl.hairpins.log 的输出文件作为发夹日志文件。

5. 高级参数

注意:为除基因组文件和输入 miRNA 文件之外的所有参数定义默认值。

1. 将 -db 选项设置为爆炸数据库以跳过管道中的建筑参考数据库。
2. 将 -m 选项设置为允许的不匹配数。
   注意:默认情况下， -m 选项设置为1，对于基于同源的预测，设置为0，用于基于sRNA-seq的预测。
3. 将 -n 设置为对齐后要消除的命中数（默认为 20）。根据物种进行更改。
4. 使用 -long 评估可疑列表的辅助结构。
5. 使用 - s 激活基于 sRNA-seq 数据的新型 miRNA 预测。
6. 将 -lmax 选项设置为要包含在筛选中的 sRNA-seq 读取的最大长度。
7. 将 -lmax 选项设置为要包含在筛选中的 sRNA-seq 读数的最小长度。
8. 使用 -rpm 选项设置每百万读取数 （RPM） 阈值。
   注意:对于高级参数，如pri-miRNA/pre-miRNA的长度，鼓励有经验的用户修改他们感兴趣的研究脚本。此外，如果用户打算跳过某些步骤或更喜欢使用修改后的输出，只需在行首添加 # 即可跳过这些行来修改提交脚本。

结果

将上述miRNA管道mirMachine应用于测试数据，以快速评估管道的性能。仅对沉积在miRBase v22.1的高置信度植物miRNA进行了针对IWGSC小麦RefSeq基因组v2²⁴的染色体5A进行筛选。mirMachine_find为189个高置信度miRNA的非冗余列表返回了312次命中，最多允许1次错配（表1）。mirMachine_fold根据二级结构评估将其中49种归类为推定的miRNA。代表性最高的miRNA组是miR9666，共鉴定出18个miRNA（

讨论

我们的miRNA管线SUmir在过去十年中一直用于鉴定许多植物miRNA。在这里，我们开发了一种新的、全自动的、免费提供的miRNA鉴定和注释管道mirMachine。此外，许多miRNA鉴定管道，包括但不限于以前的管道，都依赖于UNAfold软件²¹，该软件随着时间的推移成为商业软件，尽管曾经免费提供。这种新的全自动 mirMachine 不再依赖于 UNAfold;相反，来自ViennaRNA包²⁷ 的免费RNAfold用?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK279671/			Blast+
https://github.com/hbusra/mirMachine.git			mirMachine submission script
https://www.perl.org/get.html			Perl
https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/			RNAfold
Arabidopsis TAIR10
Triticum aestivum (wheat, IWGSC RefSeq v2)