聚焦激光扫描显微镜为基础的定量分析 阿斯珀吉卢斯熏蒸 孔尼迪亚分布在全山光学清除鼠肺

摘要

我们描述了对小鼠气道中 阿斯珀吉卢斯·福米加图斯 孔尼迪亚（3微米大小）分布进行定量分析的方法。该方法还可用于分析各种病理条件模型中气道中的微粒和纳米粒子聚集分布。

摘要

阿斯珀吉卢斯·福米加图斯 ·科尼迪亚是空气中的病原体，可以穿透人类的气道。免疫能力不过敏的人表现出抵抗力和免疫耐受性，而在免疫功能低下的患者中，针叶可以殖民气道并导致严重的侵入性呼吸系统疾病。不同气道舱内的各种细胞参与防止真菌入侵的免疫反应:然而，病原体消除的时空方面尚未完全了解。光学清除的全安装器官，特别是实验鼠的肺部的三维（3D）成像，允许在感染后不同时间点在气道中检测荧光标记的病原体。在本研究中，我们描述了一个实验设置，对气道中的 A.富米加图斯 针叶分布进行定量分析。利用荧光聚焦激光扫描显微镜（CLSM），我们追踪了在向小鼠应用咽喉后6小时，支气管支部和肺泡室中荧光标记的针叶的位置。此处描述的方法以前用于检测准确的病原体位置和识别免疫反应不同阶段的病原体相互作用细胞。实验设置可用于估计不同病理条件下病原体消除的动能。

引言

每天，人们吸入空气中的病原体，包括机会性真菌阿斯珀吉卢斯烟熏（A.富米加图斯针叶）孢子，可以穿透呼吸道^1。哺乳动物的呼吸道是不同代的气道系统，其特征是气道壁^2、3、4的不同结构。气管支气管壁由多种细胞类型组成，其中细胞是提供粘膜间隙⁵的细胞。在藻类中，没有细胞，渗透性藻类空间病原体不能通过粘血清除⁶来消除。此外，每个气道生成是多个免疫细胞群的利基，这些群体的子集对于某些气道隔间来说是独一无二的。因此，藻类巨噬细胞位于气管室中，而气管和导管都与腹内树突状细胞^7，8衬里。

A.富米加图斯针叶的大致大小为2-3.5μm^9。由于人类甚至小鼠小气道的直径超过3.5μm，因此建议conidia可以穿透^2、10、11的藻类空间。事实上，组织学检查显示，患有腹血病¹²的患者在骨泡中真菌生长。科尼迪亚也被发现在受感染小鼠的肺泡使用厚肺片¹³的活成像。同时，在¹⁴号小鼠支气管上皮的亮侧检测到锥形。

光学清除的全安装鼠肺的三维（3D）成像允许对气道¹⁵进行形态分析。特别是使用光学清除小鼠肺标本¹⁵对内脏胸神经分布进行定量分析。最近，Amich等人利用光学清除小鼠肺标本的光片荧光显微镜^，对针 叶在免疫功能低下的小鼠体内应用后的真菌生长进行了调查。感染后不同时间点在气道中休息的conidia的精确位置对于识别细胞群非常重要，这些细胞群可以在炎症的某些阶段提供足够的抗真菌防御。然而，由于体积相对较小，气道中 A.fumigatus 针叶分布的时空分布特征较差。

在这里，我们提出了一个实验设置，用于定量分析受感染小鼠气道中的A.fumigatus针叶分布。我们使用荧光聚焦激光扫描显微镜（CLSM），对接受荧光标记为A.fumigatusconidia的鼻咽应用的小鼠的肺部进行光学清除，我们获得3D图像并执行图像处理。使用全安装肺叶的3D成像，我们之前已经显示了A.fumigatusconidia在小鼠的导流气道分布72小时后，针叶应用^8。

研究方案

这里描述的所有实验室动物方法都已得到俄罗斯科学院舍米亚金和奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所机构动物护理和使用委员会（协议编号226/2017）的批准。

1. A. 富米加图斯·科尼迪亚申请

1. 要获得荧光标记 的A.富米加图斯 针叶，修复5×10⁸ 针叶，通过添加1mL的3%的甲醛针叶颗粒。在室温下在 50 mL 试管中孵育 2 小时。
2. 用 20 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗针叶:离心机在 1，000 x g 下 15 分钟，轻轻取出超高纳特，并在 20 mL 的体积中加入新鲜的 PBS。重复。
3. 溶解针叶在900微升0.1 M NaHCO_3。
4. 将 594 nm 荧光染料的苏奇尼米尔酯溶解在 100 微升二甲基硫化物中，并加入针叶。
5. 在室温下，在 150 rpm 的摇床上用染料将针叶孵化 1 小时。
6. 在离心机中用 20 mL 的 PBS 在离心机中用 1，000 x g 清洗针叶两次，15 分钟。
7. 将针叶稀释至 PBS 中浓度为 1 ×^{10 8} 针叶/mL，并储存在 4 °C 下。
8. 用0.5-3%的异黄酮蒸汽麻醉小鼠。把鼠标放在支架上，用光滑的钳子固定舌头，并握住内舌。采取单通道移液器，并应用50μL的针叶悬浮到鼠标咽。等待，直到暂停被吸入。

2. 标本制备

1. 准备 50 mL 试管，并充满 15 mL 的新鲜 2% 的副甲醛。将医疗器械（15 厘米齿形解剖钳、8 厘米细尖钳子和 10 厘米剪刀与钝端）放入 70% 乙醇溶液中。
2. 根据 IACUC 协议对鼠标实施安乐死。然后将鼠标放在做多处位置，用针头固定鼠标爪子。
   注:如果使用颈椎错位进行安乐死，请确保气管的完整性。
   1. 使用喷雾器用 70% 乙醇治疗小鼠。
   2. 使腹腔皮肤的中位纵向切口从后爪到前爪和下巴。
   3. 使用齿钳和闭紧的剪刀将皮肤与皮下组织分离。用针头固定皮肤的上端。
   4. 在腹壁上切开一个切口，将肝脏与隔膜分离。用闭合的剪刀小心地挑选隔膜，然后切开隔膜。
   5. 将胸腔和颈部结缔组织的内切切，直到气管可见。
3. 在气管下运行一条丝线，用两个钳子做手术结。
   注意:或者，使用牙线代替丝线。
   1. 小心地拉线，用剪刀切断结缔组织的肺。拿着垂直于桌子的剪刀。
   2. 将肺部放入50 mL试管中，含2%的副甲醛。将螺纹放在管外，将盖子紧紧，然后将管子翻过来，用副甲醛覆盖肺部。在 4 °C 下将肺部保持过夜。
4. 用手术刀将肺叶从心脏和彼此分离。
   1. 将肺叶放在24井盘中，每个叶放在一个单独的井中。在 1 mL 的 Tris 缓冲盐水 （TBS） pH 7.4 中清洗肺叶，在 150 rpm 时在摇床上分别洗涤 5 次 1 小时。
   2. 用 1 mL 的阻塞缓冲器（TBS 中的 1% Triton X 100，5% 奶粉）替换 1 mL 的 TBS，并在室温下将样品放在摇床上过夜。
   3. 在 TBS 中用 1 mL 的链球菌素-488-nm 氟铬结合稀释 1:30 代替阻塞缓冲器。在室温下将标本留在摇床（150 rpm）上至少 72 小时。"
5. 在室温下（150 转频）在 1 mL TBS 中将标本清洗 5 次，每次 1 小时。将标本转移到新井中，并在 4 °C 下过夜用 2% 的甲醛覆盖，以便固定后。

3. 鼠标肺叶光学清除

1. 将样品放入装有 3 毫升 50% 甲醇水溶液的 5 毫升玻璃瓶中，并在室温下放入样品搅拌机中 1 小时。
2. 用 3 mL 的 100% 甲醇替换 3 mL 的 50% 甲醇，并将其放入样品搅拌机 2 小时。准备总体积为 1 mL 的苯甲酸苯甲酸酯和苯甲酸苯甲酸苯甲酸酯 （BABB） 的 1:2 v/v 混合物。
3. 将标本转移到 24 井板，并盖上 1 mL 的 BABB 混合物，至少 30 分钟。不要将标本长时间留在BABB中:BABB 会损坏塑料板，使标本过于刚性。
4. 将标本放入细胞成像盖玻璃底室。样品已准备好成像。

4. 使用 CLSM 进行小鼠肺叶成像

1. 打开显微镜系统。打开显微镜软件。打开 定位 选项卡中的传输灯。选择 10 倍目标。
   注:要进行更详细的分析，请使用 20 倍的目标，但它增加了实验时间和图像文件大小。
2. 将带标本的腔室放在盖滑梯中。将支架放在 XY 舞台上，以超越目标。使用目标顶部舞台的 XY 控件将标本集中。使用传输光和目镜手动查找标本 Z 平面。
3. 将软件切换到 "获取 "选项卡。选择 CLSM +模式。打开 488 nm 和 561 nm 激光器。选择 488/561 nm 二色镜。将探测器的光谱范围更改为 490-695 nm。将激光功率调整到适当的范围（10-50 μW）。调整 探测器增益 在 750-900 范围之间。
   注意:由于噪音，较高的增益设置不可取。
4. 单击 1 个 AU 按钮，将针孔缩小到 1 个 Airy 单元。将像素分辨率设置为 512 × 512 像素。
5. 打开 Z 堆栈 模式。开始 实时成像。选择两种染料都可见的焦点平面。
   注意:如有必要，调整激光功率，使两种荧光染料的亮度正常化。使用 图库 和 单通道 模式，避免剪裁，并精确匹配荧光强度。
6. 扩展出现的 Z 堆栈窗格。使用聚焦轮，找到样品的最低平面。使用Z 堆栈窗格中的第一个按钮。向上移动焦点平面以查找标本的顶部边界，并使用"最后"按钮保存位置。检查Z 堆栈窗格中样本深度的表示。
   注:在第一个和最后一个位置选择后，Z 堆栈窗格中将显示样本深度的表示。
7. 通过查看 Z 堆栈 窗格，使用标本底部附近的聚焦轮定位目标。这距离标本底部大约 20 μm。
8. 关闭 Z 堆栈 模式并打开 磁贴扫描 模式。获取图像与适当数量的瓷砖的标本的大小。5 × 5 瓷砖是一个很好的起点。
9. 调整瓷砖的数量和标本XY位置，直到整个肺适合瓷砖图像。用样本中心新获得的 XY 位置重新检查 Z 堆栈 位置的正确性。
10. 打开 Z 堆栈 和 磁贴扫描 模式。将 Z 步骤（Z 堆栈 窗格中）设置为 5 μm。将 扫描速度 设置为 6。打开 自动保存 功能。打开 "保存单独的磁贴" 选项。命名文件。按 下开始实验 按钮。
11. 验证实验时间不超过显微镜上的分配时间:如果是这样 - 调整速度。
    注:近似文件大小大于 10 Gb:请确保硬盘上有足够的空间。

5. 光谱未混合和缝合

1. 使用该软件进行初始图像处理。对于光谱未混合，请选择 未混合 选项。选择两个与链球菌/气道和针叶对应的区域，从图像中获取光谱。单击 "开始取消混合"。
   注意:或者，使用现有的光谱为 488 和 594 nm 荧光度。
2. 打开用于图像处理的文件并选择 处理 选项卡。在 方法 部分，选择 几何 和 拼接。在 参数 部分，选择 新输出 并标记 保险丝瓷砖 选项。使用与气道荧光对应的选定通道的参考模式。单击 "应用"以应用"应用"以应用"应用"

6. 图像处理:表面渲染

1. 将图像打开为 超越 3D 视图。使用用于气道可视化的通道的选项 Surface 创建气道表面。选择 10 μm 的 平滑 参数。
   注:也选择自动阈值。
2. 目视检查表面。选择阈值以减少外围信号。移除普鲁拉和容器的表面。
3. 使用 选项"编辑 和 掩蔽所有"为气道表面创建一个掩码。选择气道通道，将 表面外的 Voxels 设置为 0.001。
4. 将带有气道掩码的文件保存为 TIFF 系列到文件夹。将文件保存与conidia通道作为 TIFF 系列到单独的文件夹。

7. 图像处理:面罩校正

1. 在开源平台中打开带有气道面罩的文件，进行生物图像分析^17， 作为 8 位图像。通过单击过程|使图像二进制 二元|使二进制。
   注:如有必要，请更正面罩:使用 Polygon 选择 和 删除 选项卡删除过多的表面。或者，使用 洪水填充工具。
2. 使用多次 Dilate （3D）绘制缺失的表面:单击 插件|过程|Dilate （3D）。通过单击过程|来填充孔 二元|填充孔。使用选择和 投资回报率管理器插值 手动填充面膜中的剩余孔。应用多个 侵蚀 （3D） 选项 （插件|过程|侵蚀 （3D）以补充面膜厚度。
   注:使用 插件|创建宏 多个 Dilate （3D） 和侵蚀 （3D） 重复的宏选项。
   确保 侵蚀 （3D） 的数量等于 Dilate （3D） 应用程序的数量。
3. 将面罩保存在新的文件夹中，作为 TIFF 系列。

8. 科尼迪亚定量分析

1. 打开编程和数字计算平台中的应用程序:https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter。
2. 按 "添加"文件 按钮。选择气道面罩文件夹和针叶文件夹。
3. 设置 0 到 1 之间的 自定义阈值 。按 下"确定" 按钮。
4. 将输出表保存到自定义.xls文件。
5. 用软件分析数据以进行统计分析。

结果

按照上述协议，获得了显示小鼠肺叶气道和A.富米加图斯针叶的3D图像（图1A）。斯特雷普塔维丁（用于气道可视化）标记支气管和支气管^15。此外，大型船只，很容易从气道的形态区分，和普鲁拉可视化在气道通道（图1A-C）。气道表面和面罩的创建允许在气道通道中移除容器和普鲁拉投影;然而，气道表面的完整性?...

讨论

全器官三维成像允许在不解剖标本的情况下获取数据，这对研究生物体中病原体解剖分布的空间方面具有重要意义。组织光学清除有几种技术和修改，有助于克服激光散射，并允许全器官成像15，16，18，19。其中一种定制组织清除方法包括甲醇组织脱水和脱皮，然后是与BABB的光学清除。这种方法是在1...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidia	ATCC	46645	The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 mice	Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)		Male. 12 - 30 week old.
Catheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber	Eppendorf	30742028	4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
FIJI image processing package	FIJI		Free software
Forcep	B. Braun Aesculap	BD557R	Toothed
Forcep	B. Braun Aesculap	BD321R	Fine-tipped
Forcep	Bochem	1727	Smooth
Glass bottle	DURAN	242101304	With ground-in lid
Graphic Editor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objective	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 to 50 μL
Powdered milk	Roth	T145.2
Sample mixer	Dynal	MXIC1
Scissors	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Silk thread	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Test tube	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)	Helicon	H-1702-0.5	Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN microscope software	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html