全小鼠心脏的介观光学成像

摘要

我们报告了一种将组织转化和染色的新进展与轴向扫描光片显微镜的开发相结合的整个小鼠心脏的介观重建方法。

摘要

遗传性和非遗传性心脏病都可能导致心脏发生严重的重塑过程。结构重塑，如胶原沉积（纤维化）和细胞错位，会影响电传导，引入机电功能障碍，最终导致心律失常。目前这些功能改变的预测模型基于非整合和低分辨率的结构信息。由于标准成像方法在大块组织中执行高分辨率成像时效率低下，因此将该框架置于不同的数量级上具有挑战性。在这项工作中，我们描述了一种方法框架，该方法框架允许以微米分辨率对整个小鼠心脏进行成像。实现这一目标需要技术努力，将组织转化和成像方法的进步结合起来。首先，我们描述了一种优化的CLARITY方案，能够将完整的心脏转化为纳米多孔，水凝胶杂交，无脂质形式，从而实现高透明度和深度染色。然后，描述了一种能够以微米级分辨率快速获取介观视场（mm尺度）图像的荧光光片显微镜。在mesoSPIM项目之后，构思的显微镜允许在单次断层扫描中以微米分辨率重建整个小鼠心脏。我们相信，这种方法框架将允许澄清细胞结构紊乱在电功能障碍中的参与，并为考虑功能和结构数据的综合模型铺平道路，从而能够统一研究导致组织重塑后电气和机械改变的结构原因。

引言

与心脏病相关的结构重塑会影响电传导并引入器官的机电功能障碍^1，2。目前用于预测功能改变的方法通常采用MRI和DT-MRI来获得纤维化沉积，血管树和心脏纤维分布的整体重建，并且它们用于模拟^跨器官的优先动作电位传播（APP）路径3^，4。这些策略可以提供心脏组织的美丽概述。然而，它们的空间分辨率不足以在细胞水平上研究结构重塑对心脏功能的影响。

将这个框架放在不同的数量级，其中单个细胞可以在动作电位传播中发挥个体作用，这是具有挑战性的。主要限制是在大块（厘米大小）组织中执行高分辨率成像（微米分辨率）的标准成像方法效率低下。事实上，由于组织不透明，以高分辨率对生物组织进行3D成像非常复杂。在整个器官中进行3D重建的最常见方法是准备薄切片。然而，精确的切片、组装和成像需要大量的精力和时间。一种不需要切割样品的替代方法是生成透明组织。在过去几年中，已经提出了几种澄清组织的方法⁵，⁶，^7，8。最近通过开发真正的组织转化方法（CLARITY⁹，SHIELD¹⁰）实现了生产大块，透明和荧光标记组织的挑战。特别是，CLARITY方法基于将完整组织转化为纳米多孔，水凝胶杂交，无脂形式，能够通过选择性去除膜脂质双层来赋予高透明度。值得注意的是，该方法在心脏制备中也被发现成功¹¹，¹²，^13，14。然而，由于心脏太脆弱而不适合主动清除，因此必须使用被动方法清除它，这需要很长时间才能赋予完全透明。

结合光片显微镜等先进的成像技术，CLARITY有可能以微米分辨率对3D大块心脏组织进行成像。在光片显微镜中，样品的照明是用限制在检测物镜焦平面上的薄片光进行的。荧光发射沿垂直于照明平面¹⁵的轴收集。该检测架构类似于宽场显微镜，使采集速度比激光扫描显微镜快得多。将样品穿过光片可以获得大样本的完整断层扫描，最大可达厘米大小的样品。然而，由于高斯光束的内在特性，只有在有限的空间扩展下，才有可能获得非常薄（几微米量级）的光片，从而极大地限制了视场（FoV）。最近，已经引入了一种新的激发方案来克服这一限制并应用于脑成像，允许以各向同性分辨率¹⁶进行3D重建。

在本文中，提出了一种被动清除方法，可以显着减少CLARITY协议所需的清除时间。这里描述的方法框架允许在单次断层扫描中以微米分辨率重建整个小鼠心脏，采集时间为几分钟。

研究方案

所有动物处理和程序均按照欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63 / EU的指导方针进行，并符合意大利卫生部的原则和法规。该实验方案已获得意大利卫生部批准（实验方案编号647/2015-PR）。所有动物均由意大利ENVIGO提供。对于这些实验，使用5只6个月大的雄性C57BL / 6J小鼠。

1. 溶液制备

1. 在化学罩中的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.6）中制备4%多聚甲醛（PFA）。将4%PFA等分试样在-20°C下储存数月。
2. 准备水凝胶溶液:在化学罩中的0.01M PBS中混合4%丙烯酰胺，0.05%双丙烯酰胺，0.25%引发剂AV-044。在整个制备过程中，将试剂和溶液保持在冰上。将水凝胶等分试样在-20°C下储存数月。
3. 准备清除溶液:在去离子水中混合200mM硼酸，4%十二烷基硫酸钠（SDS）;化学罩中的 pH 值为 8.6。将溶液储存在21-37°C之间以避免SDS沉淀。
4. 在实验当天准备新鲜的Tyrode溶液:加入10mM葡萄糖，10mM HEPES，113mM NaCl，1.2mM MgCl₂和4.7mM KCl;使用 1 M NaOH 滴定至 pH 7.4。

2. 心脏隔离

1. 在心脏隔离手术前30分钟皮下注射0.1mL的500国际单位肝素。
2. 用新鲜的Tyrode溶液填充30 mL注射器和三个6厘米培养皿。在其中一个培养皿的边界上做一个小裂缝（3-4毫米深），并将其放在立体显微镜下。
3. 将直径为1毫米的套管固定在注射器上，并将其插入培养皿的裂缝中。确保注射器中没有气泡。
4. 用 4% PFA 填充 20 mL 注射器并将其保存在化学罩中。在引擎盖下准备一个空的培养皿。
5. 用3%异氟醚/氧气以1.0L / min的流速麻醉小鼠，并根据现行动物福利规则通过颈椎脱位处死小鼠。
6. 祭祀后，去除胸前的皮毛，打开胸膛，可以完全进入心脏。
7. 分离心脏，将其浸入先前装有50mL泰罗德溶液的培养皿中。使用手术剪刀在主动脉弓附近切开主动脉，使心脏暴露在外。
8. 在立体显微镜下转移心脏并小心地进行插管。不要将套管插入主动脉太深（不超过2毫米），以避免组织损伤。
9. 使用小夹子和缝合线（尺寸 5/0）将心脏固定在套管上。
10. 用 30 mL 的 Tyrode 溶液以 10 mL/min 的恒定压力灌注心脏，以去除血管中的血液。
11. 从注射器上拆下套管，并将心脏放入装有Tyrode溶液的培养皿中。注意套管中不要有气泡;否则，请正确清除气泡。
12. 将装有冷 4% PFA 的 20 mL 注射器连接到套管上，并在相同的恒定压力下灌注心脏。
13. 将心脏在 4 °C 的 10 mL 4% PFA 中孵育过夜 （O/N）。为避免组织降解，请在尽可能短的时间内执行步骤2.6-2.13。

3. 心脏清扫

1. 第二天，在4°C下在0.01M PBS中洗涤心脏3次15分钟。
   注意:在此步骤之后，心脏可以在4°C的PBS + 0.01%叠氮化钠（NaN3）中储存数月。
2. 将心脏在30mL水凝胶溶液中在4°C下振荡（15rpm）孵育3天。
3. 使用干燥器、真空泵和将干燥器连接到泵和氮气管道的管系统在室温下对样品进行脱气。
   1. 将样品放入干燥器中并打开小瓶，保持盖子。
   2. 关闭干燥器，打开氮气管道从管中除去氧气。
   3. 打开真空泵，从干燥机中除去氧气10分钟。
   4. 关闭泵，使用干燥机的旋钮打开氮气管道。一旦压力等于大气压，小心地打开干燥器并快速关闭小瓶。
4. 将心脏保持在37°C的脱气水凝胶溶液中3小时。
5. 当水凝胶正确聚合并呈现完全凝胶状时，小心地从中取出心脏并将其放入样品架中。
6. 将带有心脏的样品架插入其中一个澄清室中并正确关闭，以避免清除溶液泄漏。
7. 打开放置澄清溶液容器的水浴和蠕动泵，开始澄清溶液的再循环。
8. 每周更换一次容器中的清关溶液，以加快澄清过程。

4. 细胞膜染色

1. 一旦心脏完全澄清，将其从样品架中取出，并在50mL预热的PBS中洗涤24小时。在50mL的PBS + 1%的Triton-X（PBS-T 1x）中再次洗涤24小时。
2. 将样品在 0.01 mg/mL 小麦胚芽凝集素 （WGA） - Alexa Fluor 633 中在 3 mL PBS-T 1x 中在室温下振荡 （50 rpm） 孵育 7 天。
3. 孵育7天后，在室温下在50mL的PBS-T 1x中振荡洗涤样品24小时。
4. 将样品在4%PFA中孵育15分钟，然后在PBS中洗涤3次，每次5分钟。
   注意:在此步骤之后，心脏可以在4°C下储存在PBS + 0.01%NaN3中数月。
5. 在0.01M PBS（20%和47%TDE / PBS）中以增加浓度的2，2′-硫代二乙醇（TDE）孵育心脏8小时，直至0.01M PBS中68%TDE的最终浓度以提供所需的折射率（RI = 1.46）。这是用于获取图像¹⁶ 的 RI 匹配介质 （RI-medium）。

5. 心脏安装和采集

注意:光学系统的所有组件均在 材料表中详细列出。

1. 用 RI 介质轻轻填充约 80% 的外部比色皿（石英、45 毫米× 45 毫米× 42.5 毫米）。
   注意:在这里，可以使用不同的非易失性解决方案来保证 RI 为 1.46。
2. 用相同的折射率介质轻轻填充内部比色皿（石英，45 毫米× 12.5 毫米× 12.5 毫米）。
3. 将样品浸入内部比色皿内。上述样品孵育允许样品在RI培养基内保持稳定，而无需保持。
4. 使用细镊子轻轻地将样品移动到比色皿的底部，并排列心脏的纵轴平行于比色皿的主轴，以尽量减少扫描过程中穿过组织的激发光路径。
5. 用两个螺钉轻轻地将定制的插头固定在内部比色皿上方。
6. 使用磁铁将样品安装到显微镜载物台上。
7. 手动平移垂直样品台，将内部比色皿浸入外部比色皿中。
8. 打开激发光源（波长为638 nm），设置低功率（量级为3 mW）。
9. 使用电动翻译器移动样品以照亮组织的内平面。
10. 打开成像软件（HCImageLive）并将相机触发设置为外部（光片）模式，以通过控制整个设置的自定义软件驱动相机的采集触发。
11. 在"扫描设置"面板中启用自动保存，并设置需要保存图像的输出文件夹。
12. 使用线性转换器手动调整XY平面中的样品位置，将样品移动到相机传感器FoV的中心。
13. 使用线性电动转换器沿 Z 轴移动样品，以识别心脏边界以进行断层扫描重建。
14. 将激光功率增加到~20 mW，为成像会话做好准备。
15. 开始断层扫描采集，单击成像软件序列面板中的"开始"按钮，同时使用电动转换器沿Z轴以6μm / s的恒定速度移动样品。

结果

开发的被动清除设置允许在大约3个月内获得清除的成年小鼠心脏（尺寸为10mm x 6 mm x 6 mm）。安装的所有组件均如图 1 所示。每个清除室之间的温度梯度可忽略不计（大约 3°C），允许所有腔室的温度保持在适当的范围内。

图 1:被动清算?...

讨论

在这项工作中，介绍了一种以高分辨率清除、染色和成像整个小鼠心脏的成功方法。首先，优化并执行组织转化方案（CLARITY），并针对其在心脏组织中的应用进行了轻微修改。事实上，为了获得整个心脏的3D有效重建，必须防止光散射现象。CLARITY方法使我们能够获得高度透明的完整心脏，但是被动进行时需要较长的潜伏时间（约5个月）。关于大脑，心脏组织不适合利用电场的主动清除。即使在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB