体内 大型动物视网膜神经节细胞及视神经功能及结构的评估方法

摘要

在这里，我们在山羊和恒河猴中进行了几次 体内 测试（闪光视觉诱发电位，模式视网膜电镜和视相干断层扫描），以了解视神经及其神经元的结构和功能。

摘要

视神经从视网膜神经节细胞收集轴突信号，并将视觉信号传递到大脑。视神经损伤的大型动物模型对于将新的治疗策略从啮齿动物模型转化为临床应用至关重要，因为它们在大小和解剖结构上与人类更相似。在这里，我们描述了一些 体内 方法来评估大型动物视网膜神经节细胞（RGC）和视神经（ON）的功能和结构，包括视觉诱发电位（VEP），模式视网膜电镜（PERG）和光学相干断层扫描（OCT）。山羊和非人类灵长类动物都参与了这项研究。通过逐步介绍这些 体内 方法，我们希望提高不同实验室之间的实验再现性，并促进视神经病变的大型动物模型的使用。

引言

视神经（ON）由来自视网膜神经节细胞（RGC）的轴突组成，将视觉信号从视网膜传递到大脑。ON疾病，如青光眼，创伤性或缺血性视神经病变，经常导致不可逆的ON / RGC变性和破坏性视力丧失。虽然目前在啮齿动物模型的ON再生和RGC保护方面有许多突破^{1，2，3，4，5，6，但}大多数ON疾病的临床治疗在过去半个世纪中基本保持不变，结果不尽如人意^7，8.为了填补基础研究和临床实践之间的空白，使用ON疾病的大型动物模型的转化研究通常是必要和有益的，因为它们与人类的解剖学相似性比啮齿动物模型更接近。

山羊和恒河猴是我们实验室中用于模拟人类ON疾病的两种大型动物物种。山羊眼球ON和相邻结构（眼眶和鼻腔，颅底等）的大小与基于颅骨CT扫描的人类相似⁹。因此，山羊模型提供了在人类使用之前评估和改进治疗装置或外科手术的机会。恒河猴作为非人类灵长类动物（NHP），具有类似人类的独特视觉系统，这在其他物种中不存在^10，11。此外，NHP对损伤和治疗的病理生理反应与人类非常相似¹²。

在 大型动物研究中，用于纵向评估ON和RGC的结构和功能的体内测试非常重要。视网膜电图（PERG）已被用于评估RGC功能。闪光视觉诱发电位（FVEP）反映了视网膜 - 基因 - 皮质通路在视觉系统中的完整性。因此，PERG与FVEP相结合可以反映ON函数^9，13，14 。视网膜视相干断层扫描（OCT）成像可以显示具有高时间和空间分辨率的视网膜结构，从而能够测量视网膜神经节复合物（GCC）的厚度^9，15。对于本研究中的电生理学检查，在测试前监测生命体征（热度，破裂率，血压）和血氧饱和度（SpO2）水平至关重要，因为这些参数对眼部血流有强大的影响，从而对视觉系统的功能有强大的影响。然而，为了简单起见，我们在进行OCT视网膜成像时没有监测生命体征。根据我们之前的研究⁹，OCT视网膜成像测量的GCC厚度相当稳定，节间变异系数接近3%。山羊和恒河猴的 体内 测试在我们之前的研究中已有详细描述⁹。在这里，我们介绍这些方法，以帮助提高实验透明度和可重复性。

研究方案

实验严格按照ARRIVE指南和美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南进行，并遵守温州医科大学（WMU）机构动物护理和使用委员会和Joinn实验室（苏州）批准的协议。雄性Saanen山羊年龄为4至6个月，体重为19-23公斤，被安置在WMU动物设施中。雄性恒河猴年龄在5至6岁之间，体重为5-7公斤，被安置在Joinn动物设施中。将所有动物保持在受控温度（21±2°C）的空调室中，在12小时的光照/ 12小时黑暗循环下随意进食。

1. 山羊闪光视觉诱发电位（FVEP）

1. 全身麻醉
   1. 用电子剃须刀剃掉胡须。
   2. 用70%酒精揉搓三次清洁皮肤，然后暴露皮下静脉，使皮肤做好准备。
   3. 静脉注射外周静脉导管（0.9 mm x 25 mm），然后注射阿托品（0.025 mg / kg）和丙泊酚（5 mg / kg）。
   4. 用6毫米气管插管给山羊插管，并将其连接到人工呼吸器。
   5. 在氧气中以 2 L/min 的恒定流速在氧气中加入 3.5% 异氟醚维持麻醉。
      注意:山羊在几分钟内从异丙酚诱导的麻醉中恢复过来，因此要快速插管山羊。
2. 心肺监测
   1. 将温度传感器放在舌头下方。
   2. 将脉搏血氧仪连接到耳朵的近端。
   3. 将血压袖带绑在大腿底部。
   4. 相应地将心电图夹在四肢上。
      注意:山羊的正常心率为68-150 bpm。由于使用气体麻醉，山羊的心率会增加。因此，我们在检查期间的心率为170±30 bpm。正常情况下山羊收缩压为110-130 mmHg，舒张压为50-60 mmHg。在吸入氧气的状态下，山羊的血氧饱和度始终可以保持在99%。山羊在麻醉下的呼吸频率与呼吸机的呼吸频率同步，即10次呼吸/分钟。由于温度是从山羊的舌头下测量的，而不是核心温度，山羊的温度一般为35±2°C。
3. 颅骨螺钉植入和电极放置
   1. 用剪刀剃掉头发。用浸泡在β-羟色胺和70%酒精中的棉球摩擦三次，对额骨中心的皮肤进行消毒。
   2. 使用无菌的螺丝和剪刀。
      注意:高压灭菌所有用于灭菌的手术器械（121°C，20分钟）。
   3. 用眼用剪刀做一个5毫米的皮肤切口，露出额骨，然后用螺丝刀在额骨中心植入一个无菌的螺丝。
   4. 剃掉头发，用β-丁和70%酒精对两只耳朵之间的枕骨中央枕骨上的皮肤进行消毒，一次接着另一次，三次。
   5. 做一个5毫米的皮肤切口，用眼科剪刀露出枕骨，然后在枕骨的中心植入一个无菌的螺钉。
      注:接地针电极皮下插入额颅螺钉下方。活性电极和参比电极分别用鳄鱼夹连接到枕部和额叶螺钉上，以降低电极阻抗¹⁶。
4. 动物制备
   1. 用防光布遮住眼睛，用眼罩固定以遮盖一只眼睛。
   2. 将局部麻醉眼药（盐酸普罗巴卡因眼药水）涂抹在双眼上。局部给予支霉菌性滴眼液加托吡卡胺 （5%）和去氧肾上腺素 （5%）可使双侧瞳孔扩张。
   3. 将山羊的头部放入Ganzfeld刺激器中，并调暗环境光。
      注意:发现山羊在麻醉下可以保持良好的眼球固定，因此不需要额外的眼球固定手术干预。
   4. 用黑色毯子盖住刺激器和山羊的头部5分钟以进行适应。
   5. 使用眼睑窥器暴露延髓结膜。折叠上环，向上拉上眼睑，然后首先将上环插入上眼睑的结膜囊，然后以类似的方式插入下眼睑。
   6. 按下 阻抗 按钮检查电极-组织接触阻抗，每个通道中都将显示阻抗值。
   7. 确保每个电极的阻抗低于10 kΩ，以避免来自同一房间内其他电气设备的电磁干扰。
      注:如果高于10 kΩ，请重新连接或更换电极。如果山羊所在的电动金属手术床被堵塞，阻抗可能会异常高。有源电极和参比电极之间的阻抗差应小于1 kΩ，以减少电气干扰¹⁷。
   8. 按下 示波器 按钮，在没有光刺激的情况下检查基线噪声。
      注:如果基线噪音较大，请拔下同一房间内的所有其他电气设备，然后关闭手机。如果基线问题仍然存在，请跳到步骤 1.3.10。以检查是否可以引发典型的FVEP波形。如果没有，请在其他时间重新安排 FVEP 测试。
   9. 在右上角的白色背景框中，分别选择 0.025、0.5 和 3.0 cd·s/^m2 的光强度，开始 FVEP 录制。然后，按 "检查 "按钮。请注意，在每种光强度下进行FVEP记录两次。
      注:如果两个波形看起来明显不同，则需要再重复一次。
   10. 用人工泪液润湿角膜，如果它在红外相机上看起来很干燥。
       注意:在录制之前，请从内置的红外摄像头监控眼睛的位置，以确保视觉注视是正确的，并且瞳孔完全暴露（以便闪光刺激的场大小为90°。麻醉山羊的眼睛位置可以通过相应地转动头部来调整。根据我们的观察，在全身麻醉下，山羊在FVEP记录（约10分钟）期间很少发生凝视徘徊⁹。因此，在录制时无需暂停并重新调整注视。
   11. 对侧眼重复上述步骤。
   12. 停止异氟醚供应，并稍微增加呼吸机上的潮气量，以帮助山羊从全身麻醉中恢复过来。
   13. 全身麻醉后，用庆大霉素（4 mg / kg，IM）和头孢噻呋钠（头孢菌素，2 mg / kg，IM）治疗山羊以防止感染。
5. FVEP测量和定量分析
   注:如图 1A所示，FVEP波形中的第一个正负峰被指定为P1和N1，第二个正峰被指定为P2。P1、N1 和 P2 的典型隐式时间分别约为 40、60 和 120 ms。P1 和 P2 幅度分别从 N1 波形的波谷到 P1 和 P2 波形的峰值进行测量。
   1. 在单眼损伤的情况下，使用振幅和内隐时间的眼间比较，以帮助减少间歇变化并提高敏感性¹⁷。

2. 恒河猴的PVEP

注意:模式VEP可以在恒河猴⁹ 中引发，并且在振幅和隐性时间¹⁷上比Flash VEP更稳定。因此，PVEP用于检测非人灵长类动物中视网膜 - 基因 - 皮质途径的完整性。

1. 动物制备
   1. 用Zoletil50诱导后，用异氟醚（1.5%-2%）麻醉猴子（4-8mg / kg IM，帕坦胺/唑拉西泮）。
   2. 将无菌接地电极定位在耳垂处。分别沿额骨和枕骨中线皮下插入灭菌的活性电极和参比电极。
   3. 应用眼睑窥器以暴露延髓结膜。
   4. 使用不透明粘性黑色胶带修补对侧眼睛。
2. 光伏录像
   1. 按下 阻抗 按钮检查电极-组织接触阻抗，每个通道中都将显示阻抗值;确保它低于10k Ω。如果没有，请重新连接或更换电极。
   2. 检查阻抗 测试窗口中的阻抗 值，确保有源电极和参比电极之间的阻抗相差小于1 kΩ，以减少电气干扰¹⁷。
   3. 按下 示波器 按钮以检查基线噪声，而不会受到刺激。
      注:如果基线噪音较大，请拔下同一房间内的所有其他电气设备，然后关闭手机。如果基线问题仍然存在，请在另一天重做 PVEP 测试。
   4. 通过在右上角的白色背景框中分别选择0.5和1.0周期/度的光强度来记录未打补丁的眼睛的PVEP响应，然后按 "检查 "按钮。
      注:对于每个记录，平均64条迹线以产生一个波形。对于每个频率，至少采集两个记录，以验证PVEP信号的再现性。
   5. 对侧眼重复该过程。
   6. 完成后，停止异氟醚供应以唤醒猴子。
   7. 全身麻醉后，用庆大霉素（4 mg / kg IM）和头孢噻呋钠（2 mg / kg IM）治疗猴子以防止感染。
3. PVEP 测量和定量分析
   1. 如图 1B所示，PVEP波形中的第一个负峰和正峰被指定为N1和P1，通常发生在50和90 ms左右。P1振幅是从N1的波谷到P1的峰值来测量的。
   2. 在单眼损伤的情况下，使用振幅和内隐时间的眼间比较，以帮助减少间歇变化并提高敏感性¹⁷。

3. 山羊的图案ERG（PERG）

注意:在之前的研究中，在山羊中没有观察到PERG信号的眼间串扰，因此可以从双眼同时记录PERG反应⁹。

1. 考试准备
   1. 使用木肼（3 mg / kg，IM）麻醉山羊，并放在检查台上。
   2. 将温度传感器放在山羊的舌头下。
   3. 将脉搏血氧仪连接到山羊耳朵的近端。
   4. 将血压袖带绑在大腿上。
   5. 相应地将心电图夹在四肢上。
   6. 要降低电极阻抗，请在额骨上放置一个无菌的颅骨螺钉，并用鳄鱼夹连接到接地电极。
   7. 将两个灭菌的针头参比电极皮下放置在两侧侧坎后方1厘米处。
   8. 使用眼睑窥器暴露延髓结膜。
   9. 局部应用人工泪液后，在双侧角膜中心放置两个消毒的ERG-Jet记录电极。
   10. 将两个 47.6 cm x 26.8 cm 的 LED 显示器放在双眼前，观看距离为 50 cm。
   11. 将每个监视器调整为与同一侧的瞳孔平面平行，并将监视器的中心与瞳孔平面对齐。
   12. 确保对比度反转棋盘（时间频率，2.4 Hz）显示在两个显示器上，并且最大纵横比为4:3，由设备设置设置设置。
   13. 确保白色和黑色方格之间的对比度保持在 96%，平均亮度为 200 cd/^m2 （坎德拉每平方米），由亮度计检查。
       注意:根据 ISCEV，人类的平均光照亮度需要 40-60 cd/^m217。在另一项使用小鼠模型的研究中，图案保持在800 cd / ^{m2的平均亮度，18}。在人体中进行标准 PERG 测试时，最窄尺寸需要至少 15° 的视场大小¹⁷。如果角膜电极不在角膜表面的中心，请调整角膜电极的位置。
2. PERG记录
   1. 调暗环境光并按下 阻抗 按钮以检查电极-组织接触阻抗。阻抗值将显示在每个通道中。
   2. 检查阻抗 测试窗口中的阻抗 值，确保阻抗低于10 kΩ。如果没有，请重新连接或更换电极。
   3. 按下 示波器 按钮，在没有光刺激的情况下检查基线噪声。
      注:注意保护易碎的ERG-Jet记录电极。PERG的基线噪声通常小于山羊的FVEP。
   4. 从两只眼睛同时以0.1，0.3，1.0，3.0和12.6周期/度的空间频率开始PERG记录。对于每个空间频率，对 64 条迹线进行平均以产生一个读数。
   5. 最后，关闭监视器以记录没有视觉刺激的PERG作为阴性对照。
      注意:PERG信号通常是稳定的，不需要重复。
   6. 取下前颅骨螺钉，通过注射艾唑嗪（1.5 mg / kg）唤醒山羊，这是一种木兰嗪拮抗剂。
   7. 全身麻醉后，用庆大霉素（4 mg / kg IM）和头孢噻呋钠（2 mg / kg IM）治疗山羊以防止感染。
3. PERG测量和定量分析
   1. 将带通滤波器设置为 1 至 75 Hz 的范围。对于 3.0 cpd PERG，带通滤波器设置为 1 至 50 Hz，以平滑迹线而不影响其幅度。
   2. 如图 1C所示，波形中的第一个正负峰被指定为P1（通常约为25 ms）和N1（通常约为55 ms）。PERG振幅从N1到P1测量。
   3. 在单眼损伤的情况下，我们使用振幅和内隐时间的眼间比较来帮助减少间歇变化并降低敏感性¹⁷。

4. 恒河猴的PERG

注意:目前尚不清楚恒河猴中是否存在PERG信号的眼间串扰，因此单独记录两只眼睛的PERG反应。

1. 考试准备
   1. 注射Zoletil50（4-8mg / kg IM，tiletamine / zolazepam）和气管插管后，用异氟醚（1.5%-2%）麻醉猴子。
   2. 将灭菌的接地电极皮下放置在额骨上。将灭菌的针头参比电极皮下插入，在同一侧的外侧悬臂后面1厘米处。
   3. 局部应用人工泪液后，将消毒的ERG-Jet记录电极放在中央角膜上。
      注意:如果角膜电极不在角膜表面的中心，请调整角膜电极的位置。
   4. 使用不透明粘性黑色胶带遮盖一只眼睛。
   5. 将显示器 （47.6 x 26.8 cm） 放置在 50 cm 的观看距离处。
   6. 确保显示器调整为与瞳孔平面平行。将监视器的中心与瞳孔平面对齐。
   7. 确保黑白棋盘以 2.4 Hz 的频率反转，并且宽高比为 4:3，这是由设备设置设置设置的。
   8. 确保白色和黑色方格之间的对比度为96%，平均亮度保持在200 cd / ^m2，这是由亮度计检查的。
2. PERG记录
   1. 调暗环境光并检查电极-组织接触阻抗。
   2. 确保阻抗低于10 kΩ。如果没有，请重新连接或更换电极。
   3. 在没有光刺激的情况下检查基线噪音。
   4. 对一只眼睛进行修补，并以 0.1、0.3、1.0、3.0 和 12.6 周期/度的空间频率从另一只眼睛开始 PERG 记录。
   5. 对侧眼重复步骤4.2.1-4.2.4。
   6. 停止异氟醚供应以唤醒猴子。
   7. 全身麻醉后，用庆大霉素（4mg / kg IM）和头孢噻呋钠（2mg / kg IM）治疗猴子以防止感染。
3. PERG测量和定量分析
   1. 如图 1D所示，波形中的第一个正负峰被指定为P1（通常约为40ms）和N1（通常约为85 ms）。PERG振幅从N1到P1测量。
   2. 在单眼损伤的情况下，我们使用振幅和内隐时间的眼间比较来帮助减少间歇变化并提高灵敏度¹⁷。

5. 山羊的OCT

1. 动物制备
   1. 使用甲苯噻嗪（3mg / kg，IM）麻醉山羊，然后插管。
   2. 通过局部给予散瞳滴眼液与托吡卡胺（5%）和去氧肾上腺素（5%）来扩张瞳孔。
   3. 使用眼睑窥器充分暴露瞳孔。
   4. 将山羊的头放在下巴托上。
      注意:虽然不进行气体麻醉，但定期插管山羊以保护气道免受下巴托压。
2. 华侨城成像
   注意:在本研究中，视网膜OCT成像是使用OCT系统在870nm波长处进行的。OCT扫描仪的光学轴向分辨率为12μm。圆周扫描模式用于以高分辨率模式扫描视神经头（ONH）。平均100帧以优化图像质量。详细的培训指南可在线获取（请参见 材料表）。
   1. 初始 OCT 扫描（基线检查）
      1. 单击 "开始" 按钮进入检测界面。等待计算机完成加载，然后按黄色的 "开始"按钮启动映像。
      2. 通过修改山羊头部位置，将山羊与红外热像仪对齐，使ONH在共聚焦扫描激光眼底镜（cSLO）图像中居中。
      3. 调整操纵杆以均匀照亮整个红外图像，以提高图像质量。
      4. 向前移动操纵杆，直到直立的屏幕上显示直立的视网膜OCT图像。
      5. 修改操纵杆，使其具有均匀致密且水平放置的视网膜OCT图像。
      6. 按下操纵杆上的按钮可自动捕捉图像，并按住操纵杆以保持实时图像屏幕上的图像质量，直到图像采集完成。然后，按 "获取"。
      7. 通过注射艾唑嗪（1.5mg / kg）唤醒山羊，这是一种木兰嗪拮抗剂。
         注意:根据我们的经验，将 ONH 在基线检查中居中有助于调整基线扫描和后续扫描。
   2. 后续 OCT 扫描
      1. 选择高质量的初始OCT图像;右键单击并选择" 设置引用"。
      2. 如上所述启动 OCT 成像。
      3. 按 "跟进 "按钮以允许将当前扫描与参考扫描自动匹配。
      4. 匹配后（圆形扫描环变为绿色），按操纵杆上的按钮以激活 自动实时跟踪。
      5. 通过注射艾唑嗪（1.5mg / kg）唤醒山羊，这是一种木肼拮抗剂。
         注意:为了便于匹配过程，（1） 通过相应地转动头部来移动实时窗口中的 ONH，或者 （2） 通过倾斜头部来旋转实时窗口中的 ONH，以使当前 cSLO 图像看起来更类似于基线图像。这种前庭眼反射在木拉嗪麻醉下效果很好¹⁹。
3. 华侨城测量
   1. 单击 测量按钮进入 测量窗口。
   2. 选择橡皮擦工具并擦除由程序自动标记的RNFL行。
   3. 选择 "线条绘制" 工具以手动勾勒出 IPL 和 INL 之间的边界（图 2）。
      注:可以在屏幕上读取六个毛细管周围区域（T、TS、TI、NS、NS、NI）的GCC厚度和ONH（G）周围的平均GCC厚度（图2）。学生检验、单因子方差分析或双向方差分析可用于在正态分布的情况下量化 OCT 数据。

6. 恒河猴的OCT

1. 使用与山羊相同的设备和程序在恒河猴中进行视网膜OCT成像。

结果

图1A 显示了山羊中FVEP的代表性结果。虽然相同闪光强度下的波形具有相对相似性，但我们仍然建议检查波形两次。电子设备产生的电磁波会干扰采集到的电信号，导致基线噪声高，波形重复性差。因此，建议在电生理检查过程中确保没有多余的电子设备插入周围环境，以避免此类干扰，建议至少重复两次测量，以确定实验结果的稳定性和可重复性。当给两只眼睛打补丁时，...

讨论

在这项研究中，我们提出了山羊和恒河猴的VEP，PERG和OCT方案。这些 体内 方法可以应用于各种视神经病变的大型动物模型，例如青光眼，缺血性或创伤性视神经病变和视神经炎⁹。

PVEP比^FVEP17更稳定和灵敏;但是，它不能在^goat9中引发。因此，FVEP在山羊中进行，PVEP在我们的实验室中在恒河猴中进行，以评估视网膜 - 基?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
47.6 x 26.8 cm monitors	DELL Inc.	E2216HV	The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube	Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd	PVC 6.0	ensure the airway
alligator clip
atropine	Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd.		reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb		moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	2300 La Chaux-De-Fonds	ERG recording
eye speculum	Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd	ZYD020	open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system	Heidelberg Engineering		OCT system
Imaging			(https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22	isoflurane anesthesia
male Saanen goats	Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China)		The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode	Roland Consult Stasche&Finger GmbH	U51-426-G-D	use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously	BD shanghai Medical Device Co., Ltd	383019	intravenous access for atropine and propofol
propofol	Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd.		induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops	SANTEN OY, Japan		5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device	Gotec Co., Ltd	GT-2008V-III	use for FVEP & PERG
xylazine	Huamu Animal Health Products Co., Ltd.		xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50	Virbac		induce Isoflurane anesthesia in monkey