流式细胞术分析鉴定鼠肺先天免疫细胞和适应性免疫细胞

摘要

在这项研究中，我们提出了一种有效且可重复的方案来分离小鼠呼吸系统的免疫群体。我们还提供了一种方法，使用基于9色的流式细胞术面板来鉴定驻留在健康小鼠肺部的所有先天性和适应性免疫细胞。

摘要

呼吸道与外部环境直接接触，需要精确调节的免疫系统来提供保护，同时抑制对环境抗原的不良反应。肺宿主着几个先天性和适应性免疫细胞群，这些免疫细胞提供免疫监视，但也介导保护性免疫反应。这些细胞保持健康的肺免疫系统平衡，也参与几种病理状况，如哮喘，感染，自身免疫性疾病和癌症。表面和细胞内蛋白质的选择性表达为肺的免疫细胞提供独特的免疫表型特性。因此，流式细胞术在稳态和病理条件下鉴定此类细胞群方面起着重要作用。本文提出了一种方案，描述了一种一致且可重复的方法，用于在稳态条件下鉴定驻留在健康小鼠肺部的免疫细胞。然而，该协议也可用于识别各种疾病模型中这些细胞群的变化，以帮助识别肺免疫景观中的疾病特异性变化。

引言

鼠呼吸道含有独特的免疫系统，负责对抗病原体和维持免疫稳态。肺免疫系统由在表型、功能、起源和位置方面具有显著异质性的细胞群体组成。常驻肺泡巨噬细胞 （AMs） 主要起源于胎儿单核细胞，位于肺泡腔¹，而骨髓来源的间质巨噬细胞 （IM） 位于肺实质²。IM可以通过CD206的表达式进一步细分。CD206⁺ IM位于支气管周围和血管周围区域，而CD206-IM位于肺泡间质³。最近提出了IM的几个子分类^3，4，^5，6。虽然IM的研究少于AM，但最近的证据表明它们在调节肺免疫系统中起着至关重要的作用⁷。此外，CD206还以替代激活的^AM8表示。

肺树突状细胞（DC）是肺免疫细胞的另一组异质性，就其功能特性，位置和起源而言。在肺中已经描述了四种DC亚类:常规CD103 ⁺ DC（也称为cDC1），常规CD11b ⁺ DC（也称为cDC2），单核细胞衍生的DC（MoDC）和浆细胞样^{DCs9，10，11，12，13}。前三个子类可以定义为主要的组织相容性复合物（MHC）II ⁺ CD11c ^{+ 9，10，14，15}。浆细胞样 DC 表达 MHC II，CD11c 中度阳性，但表达高水平的 B220 和 PDCA-19^，13，16。在幼稚的鼠肺中，CD103 DC和CD11b DC位于气道间质中，而浆细胞样DC位于肺泡间质¹⁷中。

单核细胞的两个主要群体在稳态下驻留在肺中:经典单核细胞和非经典单核细胞。经典的单核细胞是Ly6C⁺ ，对最初的炎症反应至关重要。相比之下，非经典单核细胞是Ly6C^- ，并被广泛视为抗炎细胞^3，16，18。最近，描述了另一个CD64 ⁺ CD16.2 ⁺ 单核细胞群体，其起源于Ly6C^- 单核细胞并产生CD206 ^{+ IMs3}。

嗜酸性粒细胞主要出现在蠕虫感染或过敏性疾病期间的肺部。然而，在稳定状态期间，肺实质中存在少量嗜酸性粒细胞，称为常驻嗜酸性粒细胞。与常驻嗜酸性粒细胞相反，炎症性嗜酸性粒细胞存在于肺间质和支气管肺泡灌洗 （BAL） 中。在家尘螨（HDM）小鼠模型中，炎症性嗜酸性粒细胞在抗原介导的刺激后被招募到肺部。有人提出，居民嗜酸性粒细胞可能通过抑制对^HDM19的T辅助剂2（Th2）致敏而在过敏中具有调节作用。

与其他肺髓细胞相反，中性粒细胞表达Ly6G但不表达CD68，其特征在于CD68-Ly6G ⁺免疫表亲型^{的特征16，20，21}。可视化研究表明，在稳态期间，肺在血管内隔室中保留了一池嗜中性粒细胞，并容纳了相当数量的血管外嗜中性粒细胞²²。与嗜酸性粒细胞类似，在稳定状态下的BAL中找不到嗜中性粒细胞;然而，几种形式的免疫刺激，如LPS激发，哮喘或肺炎，驱动嗜中性粒细胞进入肺泡腔，导致它们存在于^{BAL21，22，23}中。

大量肺 CD45⁺ 细胞代表自然杀伤 （NK）、T 细胞和 B 细胞，大多数骨髓标志物均为阴性²⁴。在幼稚小鼠的肺部，可以根据CD11b和MHC ^II18的表达来鉴定这三种细胞类型。大约25%的肺CD45 ⁺细胞是B细胞，而NK细胞在肺部的百分比高于其他淋巴和非淋巴组织^24，25，26。在肺T细胞中，相当一部分是^CD4-CD8-，在呼吸道感染中起重要作用²⁶。

由于肺宿主非常复杂和独特的免疫系统，因此已经开发出几种用于识别肺免疫细胞的门控策略^{并报告了16，18，20，27}。本文描述的门控策略提供了一种全面且可重复的方法，使用9种标志物鉴定多达12种不同的肺髓系和非髓系免疫群体。已使用其他标记来验证结果。此外，还提供了一种详细的方法来制备单细胞悬浮液，该单细胞悬浮液可最大限度地减少细胞死亡，并允许鉴定肺免疫细胞区室的最完整特征。应该注意的是，肺非免疫细胞的鉴定，如上皮细胞（CD45-CD326 ⁺ CD31^-），内皮细胞（CD45-CD326-CD31 ⁺）和成纤维细胞需要不同的方法^28，29。此处描述的协议和方法不包括此类人群的识别。

研究方案

该协议中描述的所有研究和实验都是根据Beth Israel Deaconess医疗中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行的。使用六到十周龄的C57BL / 6小鼠，无论男女，都用于开发该协议。

1. 手术切除和组织准备

1. 通过腹腔内注射1mL三溴乙醇（根据标准方案制备; 材料表）。
   注意:在肺部研究中应避免_CO2 窒息，因为它可能导致肺损伤并改变肺免疫细胞的特征和性质。还应避免颈椎脱位，因为它可能导致肺部机械损伤。
2. 将鼠标转移到干净且专用的区域进行外科手术。
3. 通过在四肢上使用针头或胶带来稳定小鼠背侧向下。使用70%乙醇消毒腹侧区域的皮肤。
4. 在皮肤上进行切口，从颈部到腹部。小心地从胸部区域取出皮肤。
5. 小心地取下胸骨和肋骨。
6. 使用18-21 G针头直接在右心室中注射10 mL冷PBS来冲洗肺部，直到肺部完全变白。
7. 小心地取出胸腺和心脏，不要触摸肺部。
8. 轻轻地将肺从周围组织中分离出来，并将其转移到具有冷BSA缓冲液的管中（表1）。
   注意:在进一步准备单细胞悬浮液之前，应努力从肺部去除所有相邻脂肪，因为这可能会使读数偏倚。

2. 单细胞悬浮液的制备

1. 将肺转移到空的培养皿中，并用两把细手术刀切碎。将切碎的肺的所有部分转移到新的50 mL锥形管中。使用5mL消化缓冲液洗涤板并将其加入含有切碎肺的50mL管中（表1）。
   注意:消解缓冲液应在使用前立即制备。使用5毫克/毫升胶原酶²⁸。将1或5mg胶原酶与BSA缓冲液或无蛋白PBS组合没有改善结果（补充图S1）。
2. 盖上管盖，在37°C下以150rpm的速度在轨道振荡器上消化肺30分钟。 通过加入10mL冷BSA缓冲液停止反应。
3. 消化后，使用18 G针头混合并溶解肺块。将 70 μm 过滤器放在新的 50 mL 锥形管的顶部。
   注意:使用较小的微米过滤器可能会导致主要骨髓种群的损失。
4. 将消化后的肺混合物缓慢直接转移到过滤器上。使用 10 mL 注射器柱塞的橡胶侧粉碎过滤器上剩余的肺片。用BSA缓冲液在过滤器上清洗处理过的材料。
5. 在4°C下以350× g 离心单细胞悬浮液8分钟。
6. 小心地丢弃上清液并将细胞重悬于1mL的ACK裂解缓冲液中。使用1 mL移液器充分混合，并在室温下孵育90秒。
7. 加入10mL冷BSA缓冲液以停止反应，并在4°C下以350× g 离心7分钟.小心地丢弃上清液并将沉淀重悬于染色缓冲液中以使用血细胞计数器计数细胞。
8. 以5×¹⁰⁶ 个细胞/mL的浓度重悬细胞，并用于表面染色（见第3节）。
   注意:为此目的，将细胞接种在96孔圆底板中，然后进行抗体染色和洗涤。如果没有板式离心机，请使用流动管代替板。使用该协议，可以从平均大小的6-10周龄C57BL / ⁶ 小鼠中获得每个肺约15-20×106个细胞。

3. 表面抗体染色

1. 在⁹⁶ 孔板中每孔200μL中转移1×106个细胞。在4°C下以350× g 离心板7分钟。 同时，通过在染色缓冲液中稀释抗16/32抗体（1:100）来制备Fc-block溶液（表1）。
2. 将细胞重悬于50μL预制备的Fc封闭溶液（材料表）中，并在4°C或冰上孵育15-20分钟。
3. 加入150μL染色缓冲液，并在4°C下以350× g 离心板5分钟。 同时，通过稀释表面抗体（1:100; 表 2）在染色缓冲液中。
   注:（i）用于Fc阻断的抗16/32抗体可与表面抗体在同一混合物中使用。（ii）如果使用可固定的活性染料，则以1:1，000的稀释度将其添加到表面抗体混合物中。
4. 将细胞重悬于50μL预制备的表面抗体混合物中，并在黑暗中在4°C下孵育30-40分钟。用染色缓冲液洗涤细胞两次。
   注意:如果不需要细胞内染色，请将细胞重悬于200μL染色缓冲液中，然后直接在流式细胞仪上采集数据。或者，可以将细胞固定并储存在4°C以供以后采集。我们建议在24小时内使用细胞进行流式细胞术。

4. 细胞固定和细胞内染色

1. 通过混合FoxP3 /转录因子染色缓冲液组的三份固定/透化浓缩物和1份固定/透化稀释剂来准备固定/透化缓冲液（固定/烫发缓冲液）（表1）。
2. 将细胞重悬于96孔板每孔50μL预制备的Fix / Perm缓冲液中，其中细胞按第3节所述接种，并在黑暗中在4°C下孵育20-25分钟。
3. 在纯化的去离子水中以1:10稀释10倍的透化缓冲液，制备1倍的透化缓冲液。
4. 用1x透化缓冲液洗涤细胞一次。同时，通过将细胞内抗体（1:100）稀释在1mL通透缓冲液中来制备细胞内抗体混合物。
5. 使用96孔板的每个细胞使用50μL预制备的表面抗体混合物重悬细胞，并在黑暗中在4°C下孵育40分钟。
6. 用透化缓冲液洗涤细胞一次，用染色缓冲液洗涤一次。最终洗涤后，将细胞重悬于200μL染色缓冲液中。
   注意:如果没有带读板仪的流式细胞仪可用，请将细胞转移到流式细胞术管中。
7. 在流式细胞仪上采集每个样品至少1.5×¹⁰⁶ 个细胞。
   注意:对于单色和未染色的对照样品，每个样品0.5-1×¹⁰⁶ 个细胞就足够了。建议滴定用于实现最佳染色和降低成本的单个抗体。本实验方案已使用FoxP3染色缓冲液组制备的Fix/Perm缓冲液进行了优化。由于CD68是细胞质而不是核标志物，因此其他透化解决方案（例如来自不同供应商的低浓度多聚甲醛或细胞固定/细胞蛋白试剂盒）可能就足够了。

结果

门控策略
我们的门控策略的第一步是排除碎屑和双层（图1A）。仔细排除双联对于避免假阳性人群至关重要（补充图S2）。然后，使用CD45 +鉴定免疫细胞，CD45 ⁺是造血细胞的标志物（图1B）。可以添加活死染色剂以排除死细胞。然而，该协议导致<5%的CD45 ⁺ 细胞死亡（图1C），而更多的CD45...

讨论

肺免疫细胞的鉴定可能具有挑战性，因为与驻留在其他组织中的对应物相比，肺中存在多种免疫细胞类型及其独特的免疫表型特征。在几种病理条件下，具有不同表型特征的细胞出现在肺部。例如，博来霉素诱导的肺损伤导致肺泡腔中循环单核细胞来源的巨噬细胞募集，在那里它们可以停留长达一年，甚至在博来霉素诱导的纤维化后持续存在。与组织驻留的AM相反，循环的单核细胞衍生巨噬细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co