用于研究髓磷脂中央微管蛋白依赖性缺陷的无标记非线性光学器件

摘要

在本文中，我们提出了一种协议，通过简单，创新的二次谐波产生显微镜方法检测微管负载的少突胶质细胞在微管疾病模型中。

摘要

大脑中细胞骨架成分的令人满意的可视化具有挑战性。微管、微丝和中间丝网络在所有神经组织中的普遍分布，以及荧光蛋白融合策略结果的可变性以及它们对作为发色载体的抗体和药物的动态研究的有限适用性，使得经典的光学方法不如其他蛋白质有效。当需要研究微管蛋白时，由于分子的非中心对称组织，二次谐波的无标记产生是非常合适的选择。当与显微镜结合时，该技术可以定性地描述生物样品中平行微管束的体积分布，具有处理未固定和未透化的新鲜组织的额外优势。这项工作描述了如何使用商业的二次谐波生成显微镜设置对微管蛋白进行成像，以突出显示少突胶质细胞富含微管蛋白的结构中的微管，如髓鞘功能减退伴基底神经节萎缩和小脑（H-ABC）微管蛋白病，一种最近描述的髓鞘疾病。

引言

组织和器官制剂中细胞骨架结构的光学成像并非易事。细胞骨架丝无处不在，因此，如果对上皮样品中的α-微管蛋白或β-肌动蛋白或潜在的角蛋白进行通用染色，则信号可能会在整个样品中均匀分布。为了将染色限制在更有意义的细胞成分亚群中，可以使用靶向表达¹的转基因小鼠或计划使用亚型特异性抗体。虽然后者很少在市场上（^{而且很少存在}2，^3，4），但转基因动物模型可能是可用的。但是，它需要由实验室购买并妥善安置，以及该过程所涉及的所有费用。某些抗体或化学物质，例如荧光团偶联药物，如鬼笔环肽或紫杉醇，可能部分或完全与活细胞或组织的使用不相容，因此将其适用性限制在仅研究固定样品。

在微管蛋白的情况下，必须考虑另一个方面，即聚合物对固定的敏感性。众所周知，用甲醛进行常规化学固定不足以最佳地保持微管的完整性⁵。此外，最近的一份报告证实，甲醛交联诱导微管超微结构的细微变化，类似于某些药物或生理分子（如GTP⁶）结合时发生的情况。

因此，在未染色、未固定的样品中直接观察微管通常是可取的。为了实现这一目标，一种技术解决方案是二次谐波产生（SHG）显微镜⁷，它基于平行微管束作为干扰团并在用强烈的脉冲红外激光正确照射时发射倍频光的能力。虽然胶原蛋白和肌球蛋白可以产生更强，更稳定的二次谐波信号，这是已知唯一能够倍频的另外两种生物材料，但迄今为止，来自微管蛋白的信号主要用于研究有丝分裂纺锤体重排⁸，⁹，¹⁰和轴突微管形态¹¹，^12，13。

在这项工作中，我们介绍了SHG显微镜作为诊断工具的新用途，以区分受微管蛋白β4A（TUBB4A）微管蛋白病影响的中枢神经系统（CNS）组织与健康对应物¹⁴。在这种主要由神经性微管蛋白亚型引起的一些突变中发生的突变，如导致基底神经节和小脑（H-ABC）髓鞘减退和萎缩的突变，诱导少突胶质细胞中的微管过度充盈^15，16;反过来，细胞骨架改变与髓鞘形成等下游效应有关，运动和感觉通路严重受损¹⁶，¹⁷，^18，19。这项工作中使用的taiep小鼠模型在少突胶质细胞中显示出异常的微管含量，并概括了H-ABC患者的大多数感觉运动症状¹⁷。该协议解释了如何将结构成像为胼胝体和小脑，它们通常是高度髓鞘的，并且在人类患者以及taiep rat¹⁹中受到严重影响，以突出健康和突变组织之间SH信号的差异。

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研究方案

所描述的所有程序均符合墨西哥政府《关于健康研究的一般卫生法条例》（NOM-062-ZOO-1999）第七章中批准的法律和法规，并符合《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》的建议，并经瓜纳华托大学和贝内梅里塔自治大学生物伦理学研究机构委员会批准 普埃布拉。

1. 显微镜设置

1. 打开显微镜系统。
2. 打开脉冲激光器，以确保在样品提取和制备后，它能够以最佳和稳定的功率水平进行激光化。
3. 将激光调谐到 810 nm。为了研究乳腺微管，使用10%-20%的可用激光功率，在所述系统中，这对应于在物镜后焦平面处测量的13-26mW。
4. 确保显微镜是科勒对准的（补充文件1），物镜将用于SHG成像。
   注意:这一点很重要，因为在这项工作中使用的商业设置中，检测是在传输模式下通过聚光镜进行的。
5. 从光学检测路径中移除不需要的滤光片（图1A）。
6. 确保聚光镜光圈完全打开，以确保在此水平上不会不必要地停止光线。
7. 准备一个25x/0.8数值孔径（NA）油浸物镜，在镜头中加入一小滴浸油。
   注意:此物镜用于最好地匹配冷凝器数值孔径，即0.55（理想情况下，数值孔_径≥数值孔径_obj）。

2. 显微镜初步控制

注意:除非修改了设置，否则执行一次初步显微镜控制。

1. 使用SHG参数对夹在载玻片之间的干玉米淀粉进行成像，以生成揭示激光偏振方向的SHG图像。按照 补充文件 2 中报告的步骤进行操作，但激光功率除外，玉米淀粉的激光功率小于 5%。
2. 拍摄一张稀疏玉米淀粉粒的图像，并在x-y平面上标记SHG小叶的方向。该方向对应于激光方向（图2A）。
3. 作为对照，拍摄同一样品的另一张图像，将半波板插入光路（ 如图1A所示的位置）以改变激光的振荡方向。生成的图像显示旋转的SHG信号小叶（图2B，C）。
4. 如果对SHG使用不同类型的带通滤光片，请通过沿线扫描逐像素比较图像（图2D，E）和信号强度（图2F），确保其具有最佳的传输特性。

3. 组织提取

注意:始终使用干净的工具进行外科手术。

1. 使用6-12个月大的 taiep 大鼠和年龄匹配的Sprague-Dawley对照（WT）。
2. 用腹膜内注射在0.9%无菌NaCl溶液中稀释的氯胺酮 - 甲苯噻嗪（0.125mg / Kg和5mg / Kg）混合物麻醉动物。
   1. 检查疼痛反射，只有在它们不存在时才继续。
3. 通过斩首 献 祭动物。
4. 一旦头部被隔离，沿着中线小心地打开颅穹窿的骨骼，从顶部的最尾部开始朝向鼻子，从眶腔到中线，然后从最尾部到大脑和小脑下方。
   注意:切骨器和Rongeurs可以在不损坏大脑结构的情况下正确去除头骨。
5. 从骨骼中释放大脑和小脑。两个半球可以分开。如果半球被分割，则使用一半进行SHG成像，并将另一半固定在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的3.7%多聚甲醛中20分钟，用于随后的切片和染色。

4. 振动切片

1. 准备一个装有温热（37°C）汉克平衡盐溶液（HBSS）的振动切片机缓冲托盘。
2. 使用氰基丙烯酸酯胶通过一块遮蔽胶 将 大脑固定在标本板上。最尾部/区域接触胶水，以便可以切割来自相反的喙部的可用冠状部分。
   1. 让胶水聚合~10秒，以获得样品的有效附着。
      注意:当大脑定向时，最佳结果是使刀片"从上到下"而不是"从一侧到另一侧"切割时获得的（图1B）。
3. 将试样板转移到缓冲托盘内的磁性支架上。
4. 开始切割300-500μm切片，直到产生的切片覆盖大脑的整个表面。
5. 此时，将切片的厚度减小到160μm。
6. 一旦在胼胝体水平处切割完整的160μm切片，就用带有大火焰孔的改良玻璃巴斯德移液管将其恢复（图1C）。
7. 用新的温HBSS将其转移到干净的培养皿中，或直接转移到玻璃支架上进行显微镜检查（盖玻片或玻璃底培养皿）。
   注意:对于所描述的实验条件，在样品上方添加盖玻片不利于成像。

5. 转移到显微镜

1. 如果显微镜在不同的房间，请准备一个带有加热凝胶包的绝缘盒，以转移组织切片，同时保持温度。该盒子还用于保持切片温暖，直到它们被成像。
2. 将样品放在显微镜下，并通过透射光目镜直接观察，确保其正确定位在物镜下方。
   注意:目标是将预测的发射结构与激光的振荡方向对齐，以最大化发射（因此检测到）的SHG信号。
3. 去除多余的HBSS，使薄的液膜覆盖整个样品。每隔几分钟目视检查一次液膜，以避免样品过度蒸发和干燥。
   注意:在所述条件下，使用部分不超过20分钟。样品干燥会造成剧烈的人工影响（补充图1A）。如果需要更长的成像时间，建议定期将切片浸泡在温暖、新鲜的培养基中，而不是添加更多的 HBSS。在进行较长时间的实验时，还建议使用灌注室和胶水或低熔点琼脂糖来固定组织。
4. 准备显微镜载物台以进行非去扫描成像，这可能包括关闭深色培养室的所有门或用黑色尼龙聚氨酯涂层织物覆盖培养室。

6. 成像

1. 沿传输路径选择"非去扫描"成像模式。这样，微管蛋白微弱SH信号的捕获将得到优化。
2. 选择 LCI 计划-新氟 25x/0.8 数值孔径物镜。
3. 将激光功率设置在 13 mW 和 26 mW 之间，像素停留时间为 12.6 μs。拍摄不超过 512 像素 x 512 像素的图像，速度为 5，平均速度为 2，平均采集时间约为 15 秒。
   注意:使用更高的激光功率和/或更长的停留时间可能会损坏样品（补充图1B）。
4. 首先使用 485 nm 短通滤光片 （SP485） 拍摄图像，然后在第二步中添加清晰的 405 nm 带通滤光片 （BP405; 图3）。按照 补充文件 2 中报告的步骤进行操作。
   注意:伪明场图像可以通过同一探测器使用可见线的残余激光（405 nm或488 nm激光器效果最佳）拍摄。

7. 小脑的处理

1. 首先，用手术刀将小脑切成两个半球，然后通过中间部分（切割后获得的扁平部分）将它们粘在振动切片机支架上。
2. 以与大脑描述相同的方式对小脑进行切片和成像（160μm切片，相同的振动切片机设置，相同的刀片，相同的显微镜设置等）。
   注意:由于小脑的解剖结构，它在切片时的方向并不重要;在远离表面生成的大多数切片中，叶子会很好地切入白质中。

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结果

由于生物组织中存在的异构载体数量非常有限，因此使用该方法获得的图像具有固有的低背景水平，这是该方法的显着优势之一。

当对胼胝体的纤维进行成像时，可以在太极脑中一致地找到纤维状的短结构和圆形元素（图3B），而对照脑的胼胝体在整个大脑区域显示出更加异质和各向同性的信号（图3A）。差分信号的起源具?...

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讨论

SHG显微镜是一组非线性光学技术的一部分，其中包括双光子激发显微镜，三次谐波产生显微镜和相干反斯托克斯拉曼散射显微镜，这些技术有助于将传统光学显微镜的应用范围扩展到生命科学²⁰。

具体来说，SHG显微镜的主要优点和缺点与相同的条件有关:信号发生器是非中心对称的²¹。这种特殊的建筑条件通常存在于无机和有机晶体领域，但...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter	Semrock	FF01-405/10-25	32 mm diameter, with housing ring
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric	Thorlabs	BK5	5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick
Blades for vibratome	any commercial; e.g. Wilkinson Sword		Classic stainless steel double edge razor blades
Cell culture dishes, 35 mm	any commercial; e.g. Falcon	351008
Confocal microscope	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Cooler	any commercial		Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C
Corn stach	e.g. Maizena		From the supermarket
Coverslips #1.5	any commercial		Rectangular
Cyanoacrylate glue	e.g. Loctite		To glue the brain to the masking tape
Fine forceps	fine science tools	11412-11	To manipulate tissue sections by handling from the meninges
Fine scissors	fine science tools	14370-22	To cut the skin
Fine scissors curved tip	fine science tools	14061-09	To cut along the midline
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	252549	To dilute 1:10 in PBS
Friedman Rongeur	fine science tools	16000-14	To cut the bone
Gel packs	any commercial		Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler
Glass Pasteur pipette, modified	any commercial		To transfer the tissue section
Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS)	Gibco	14025-076	Could be prepared from powders
Kelly hemostats	fine science tools	13018-14	To separate the bone
Masking tape	any commercial		To protect th surface of the specimen plate
NDD module, type C	Zeiss	000000-1410-101	To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485
Offset bone nippers	fine science tools	16101-10	To cut the bone
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-031	Could be prepared from powders or tabs
Pulsed laser	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm tunable laser
Scalpel	any commercial		Straight blade with sharp point
Standard pattern forceps	fine science tools	11000-18
Vannas spring scissors	fine science tools	15018-10	To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate.
Vibratome	any commercial; e.g. Leica	VT1200