通过非侵入性经鼻途径在免疫功能正常的小鼠大脑中移植人诱导的多能干细胞衍生小胶质细胞

摘要

这里介绍的方案允许在免疫功能正常的小鼠中通过经鼻途径将诱导多能干细胞衍生的人小胶质细胞（iPSMG）移植到大脑中。图中显示了用于制备和经鼻移植细胞以及施用细胞因子混合物以维持iPSMG的方法。

摘要

小胶质细胞是大脑巨噬细胞样细胞的特殊群体。它们在生理和病理大脑功能中起着至关重要的作用。我们目前对小胶质细胞的大部分理解都是基于在小鼠中进行的实验。人类小胶质细胞与小鼠小胶质细胞不同，因此小鼠小胶质细胞的反应和特征可能并不总是代表人类小胶质细胞的反应和特征。此外，由于伦理和技术上的困难，对人小胶质细胞的研究仅限于 体外 培养系统，其 在体内 不屈服于小胶质细胞的特征。为了克服这些问题，开发了一种简化的方法，通过使用集落刺激因子1受体（CSF1R）拮抗剂，通过经鼻途径与内源性小胶质细胞的药理学消耗相结合，将诱导的多能干细胞衍生的人小胶质细胞（iPSMG）移植到免疫功能正常的小鼠大脑中。该协议提供了一种非侵入性地将细胞移植到小鼠大脑中的方法，因此对于评估人类小胶质细胞在生理和病理脑功能中的 体内 作用可能是有价值的。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中巨噬细胞样细胞的特化群体，在控制各种大脑功能（如神经回路发育，调节神经传递和维持大脑稳态）方面起着至关重要的作用^1，2，3。虽然小鼠小胶质细胞与人类小胶质细胞具有许多功能，但它们显示出物种特异性差异。因此，小鼠小胶质细胞对各种刺激的反应可能并不总是代表人类小胶质细胞^4，5，6。虽然许多研究已经分析了人类小胶质细胞，但这些实验仅限于体外研究。体外培养的人小胶质细胞显示出与体内非常不同的形态特征和基因表达。因此，体外实验可能并不总是屈服于人小胶质细胞的体内特征。因此，需要一个实验系统来研究体内的人类小胶质细胞。

最近，为了研究人小胶质细胞的体内特性，体外生成的诱导多能干细胞（iPSCs）或胚胎干细胞衍生的人小胶质细胞被手术移植到小鼠大脑^7、8、^{9、10、11、12、13、14}中。使用这种方法，已经表征了人类小胶质细胞的各种体内特征。但是，由于两个原因，这种方法的广泛使用受到限制。首先是对免疫缺陷小鼠的需求。因此，为了研究人类小胶质细胞在各种神经退行性疾病中的作用，携带疾病突变的小鼠必须杂交成免疫缺陷小鼠，这需要大量的时间和精力。此外，在各种神经系统疾病中，外周免疫细胞，如T细胞，可以调节小胶质细胞功能^15，16，17。因此，在免疫缺陷小鼠中进行的实验可能无法代表人小胶质细胞在体内的真正特征。其次，移植小胶质细胞的侵入性手术需要额外的设备和培训。此外，侵入性移植期间的脑损伤可能会改变小胶质细胞表型。

在该协议中，描述了iPSMG的非侵入性经鼻移植（Tsn）到免疫功能正常的野生型小鼠^中的18。结合CSF1R拮抗剂PLX5622的药理学ON / OFF，其消耗内源性小鼠小胶质细胞¹⁹ 和Tsn，iPSMG可以无创地移植到小鼠大脑中。此外，随着外源性人细胞因子的应用，移植的iPSMG在没有任何免疫抑制剂的情况下以区域特异性方式保持存活60天。

研究方案

本研究中使用的所有动物都是根据日本生理学会²⁰出版的"生理学科学领域动物护理和使用指导原则"以及山梨大学动物护理委员会的先前批准获得的，饲养，护理和使用。 日本）。

1.细胞培养基、移植培养基、麻醉混合物的制备

1. 通过在DMEM中加入10%胎牛血清和0.1%青霉素/链霉素来制备细胞培养基。
2. 通过在细胞培养基中加入hCSF1（250ng / mL）和hTGF-β1（100 ng / mL）来制备移植培养基。
3. 通过将0.45mL盐酸美托咪定，1.2mL咪达唑仑和1.5mL酒石酸丁呥酚与11.8mL生理盐水中混合，制备腹膜内注射的麻醉混合物。

2. iPSMG的制备

注意:冷冻的iPSMG（材料表）保持在-80°C直至使用。

1. 在37°C水浴中快速解冻冷冻的细胞。旋转样品，直到所有可见的冰都融化。
2. 将解冻的iPSMG加入加热至37°C的培养基中。 向10mL培养基中加入1mL含有培养基（1×10⁶ 个细胞）的解冻细胞。
3. 将细胞以300× g 离心5分钟以获得细胞沉淀。
4. 离心后，除去所有上清液而不干扰细胞沉淀。完全去除上清液是可取的，以减少移植培养基中细胞因子浓度的稀释。
5. 加入移植培养基以获得1 x 10⁵ 个细胞/ μL的细胞浓度。
6. 将iPSMG放在冰上，然后立即进行移植。
   注意:用于移植的iPSMG的制备是在干净的工作台上进行的，以避免污染。

3. 小鼠经鼻移植的制备（Tsn）

1. 用含有PLX5622的饮食喂养野生型雄性小鼠（C57BL / 6J，8周龄）7天。
2. ^在第7天结束时，停止PLX饮食，并以正常饮食喂养小鼠，直到研究结束。
   注意:含PLX5622的日粮是在1公斤AIN-93G（材料表）中加入1.2克PLX5622来制备的。

4. 细胞经鼻移植

1. 停止PLX喂养后24小时，称量小鼠并使用腹膜内注射麻醉混合物（0.2mL / 20g）麻醉它们。
2. 在通过对踏板戒断反射无反应（坚实的脚趾夹）评估小鼠完全麻醉后，在iPSMG的Tsn到每个鼻孔之前1小时在PBS（100 U / mL）中施用2.5μL透明质酸酶，以使用10μL移液器尖端两次以增加鼻粘膜的通透性。
3. 施用透明质酸酶后，将小鼠置于仰卧位。
4. 在iPSMG经鼻移植前10分钟重复步骤4.2。
5. 使用10μL移液器吸头将2.5μL细胞悬浮液施用于小鼠的一个鼻孔。
6. 将小鼠置于仰卧位5分钟，然后将细胞悬浮液施用于另一个鼻孔。
7. 重复步骤4.5和4.6四次，每只动物的总体积为20μL。
8. 将小鼠置于37°C热垫上的仰卧位，直到从麻醉中恢复。
9. 在停止PLX喂养后48小时，再次在同一只小鼠上重复步骤4.1-4.7。
   注意:应该注意的是，iPSMG在移植过程中被放置在冰上。

5. 细胞因子的应用

1. 通过腹膜内注射麻醉混合物（0.2mL / 20g）麻醉小鼠。
2. 使用10μL移液器尖端将2.5μL移植培养基施加到小鼠的一个鼻孔中。
3. 将小鼠置于仰卧位5分钟，然后将移植培养基施用于另一个鼻孔。
4. 重复步骤5.2和5.3四次，每只动物的总体积为20μL。
   注意:应该注意的是，移植培养基（人细胞因子）的经鼻给药需要每12小时一次，以使移植的iPSMG的活力直到研究结束。

结果

该技术允许研究人员将iPSMG非侵入性地移植到海马体和小脑中，但不能移植到小鼠大脑的皮层中。完成研究后，麻醉小鼠接受冰冷PBS（−）的经心灌注，然后在PBS中进行冰冷的4%（w / v）多聚甲醛。分离大脑，在4%（w / v）多聚甲醛中后固定过夜，并在含有30%（w / v）蔗糖的PBS中冷冻保护。此外，将大脑冷冻在包埋化合物中并在低温恒温器上切片（20μm厚的冠状切片）。在PBS（−）中洗涤切片3次（每段10分钟），并在10%正常山羊血清中用0.5%（v / v）Triton X-100渗透和阻断1小时。然后将切片与抗人特异性细胞质标记物STEM121（1:100）和抗Iba1（1:1000）一起孵育5天。接下来，用PBS（−）洗涤三次，每次10分钟，并与二抗一起孵育:Alexa Fluor 488-或546结合小鼠或兔IgG（1:1000）在室温下孵育2小时。用PBS（-）洗涤三次后，使用防褪色安装介质将切片安装在载玻片上。配备40倍物镜的共聚焦显微镜用于采集荧光图像。iPSMG在移植后2个月在海马体和皮层中的存活率如图 1所示。移植细胞的数量可以通过计数对人类特异性抗体和全小胶质细胞/单核细胞标志物均呈阳性的细胞来确定，而内源性小鼠小胶质细胞仅对泛小胶质细胞/单核细胞标志物呈阳性，如前所述¹⁸。移植的iPSMG取代小鼠小胶质细胞，在海马体中显示分支形态，并且在皮层¹⁸中未检测到。

图1:tsn后2个月iPSMG在皮层和海马体中的活力。 左图显示了泛小胶质细胞/单核细胞标志物Iba1（绿色）的免疫染色。中间的面板显示了具有人类特异性细胞质标记物STEM121（红色）的免疫染色。右图显示了Iba1和STEM121免疫染色的合并图像。（A）在对照小鼠中，在皮质和海马体中仅检测到小鼠小胶质细胞（Iba1 + / STEM121-）。（B）在iPSMG移植小鼠中，在皮层中仅检测到小鼠小胶质细胞（Iba1 ⁺ / STEM121^-），而在海马体中检测到iPSMG（Iba1 ⁺ / STEM121 ⁺）。图像中的箭头显示小鼠小胶质细胞，而箭头显示iPSMG。配备40倍物镜的共聚焦显微镜用于荧光图像采集。最大图像大小:1024 x 1024 像素。缩放系数: 2. 比例尺 = 50 μm 请点击此处查看此图的大图。

讨论

这里的协议描述了iPSMG的非侵入性移植到小鼠大脑中。目前方案的独特之处在于，通过结合药理学PLX ON/OFF方法和鼻内移植，iPSMG可以无创地移植到免疫功能正常的小鼠大脑中。移植的iPSMG通过占据空置的壁龛长达60天但不在皮质中形成海马体和小脑中的大多数小胶质细胞。

iPSMG高效Tsn的关键点是（i）内源性小鼠小胶质细胞的消耗效率（ii）每12小时施用一次人细胞因子。小胶质细胞在大脑中保持自己的领土。需要有效消耗小鼠小胶质细胞，以便为移植iPSMG的植入提供利基。当内源性小鼠小胶质细胞的耗竭不足时，未观察到iPSMG对小鼠海马体和小脑的定植。小胶质细胞的存活率取决于CSF1R和TGFBR信号传导^19，21，22。据报道，hCSF1选择性地增加人小胶质细胞的活力，并且hTGF-β1是小胶质细胞活力所必需的，并且每12小时施用一次可抑制炎症^21，23，24。在没有外源性人类细胞因子的情况下，在小鼠大脑中未观察到iPSMG。此外，在Tsn之前，必须注意不要通过过度移液或任何其他方式机械地激活iPSMG，因为它不可逆转地改变了iPSMG特性以及移植效率。如果没有看到 iPSMG 令人满意的 Tsn，则必须确定移植前 iPSMG 的生存能力以及内源性小胶质细胞的耗竭。如果内源性小鼠小胶质细胞的耗竭不超过90%，可以修改PLX5622的进食时间以增加耗竭。

与传统的侵入性手术移植方法相比，Tsn允许以非侵入性，简单，稳定和容易的方式进行移植。此外，该方法允许将iPSMG移植到免疫功能正常的小鼠大脑中;因此，免疫功能正常的疾病模型小鼠可用于研究iPSMG的反应。

目前该方法的最大缺点是iPSMG嫁接的区域异质性。如果需要进行脑区域特异性iPSMG移植，则目前的方案不合适，因为移植的iPSMG仅在海马体和小脑中保持移植60天，而在皮层中不移植。此外，需要每12小时鼻内施用外源性人细胞因子也是当前方案的局限性，因为它需要大量的劳动力并且价格昂贵。

总之，提供了将iPSMG的Tsn放入免疫功能小鼠大脑的详细方案。当通过PLX5622与小鼠小胶质细胞的药理学开/关相结合时，该方案允许成功移植iPSMG。由于当应用外源性细胞因子时，可以在海马体和小脑中持续观察移植细胞，因此当前的方法对于评估人类小胶质细胞在这些区域的生理和病理状态中的作用可能是有价值的。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
Anti-Iba1 antibody	FUJIFILM	019–19741
Anti-STEM121 antibody	Takara Bioscience	Y40410
Butorphanol tartrate	Kyoritsu Seiyaku	8019
Confocal microscope	Olympus	FV1200
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Frozen iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratory for Drug Discovery and Disease Research
Human colony stimulating factor 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506
Medetomidine hydrochloride	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehyde	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipette	Eppendorf	3120000011
Pipette tip	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10	antifade mounting medium