使用突变蛋氨酸tRNA合成酶小鼠系从复杂组织中纯化和鉴定细胞类型特异性蛋白

摘要

该协议描述了如何使用表达突变L274G-蛋氨酸tRNA合成酶（MetRS *）的小鼠系使用叠氮金亮氨酸（ANL）进行细胞类型特异性蛋白质标记，以及标记细胞类型特异性蛋白质分离的必要步骤。我们通过（1）饮用水和（2）腹膜内注射概述了活小鼠中两种可能的ANL给药途径。

摘要

了解 体内 蛋白质稳态是了解细胞在生理和疾病条件下如何工作的关键。本协议描述了使用工程小鼠系对新合成的蛋白质进行 体内 标记和随后的纯化，以将蛋白质标记定向到特定的细胞群。它是L274G-蛋氨酸tRNA合成酶（MetRS*）的Cre重组酶表达的诱导系，使叠氮白氨酸（ANL）掺入蛋白质中，否则不会发生。使用此处描述的方法，可以纯化 体内 标记的细胞类型特异性蛋白质组，并检测由于样品复杂性降低而导致的蛋白质含量的细微变化。

引言

异常蛋白质稳态是由蛋白质合成和降解的不平衡引起的。几种疾病与蛋白质稳态的改变有关。某些疾病的标志是聚集体存在于不同的亚细胞位置和大脑区域。蛋白质稳态不仅在疾病中很重要，而且在正常器官和细胞功能中也起着至关重要的作用¹。例如，蛋白质合成对于许多形式的神经元可^塑性2，³是必需的^，这是通过使用阻断^{蛋白质合成的}化学抑制剂4来确定的。然而，既不清楚蛋白质组在哪种细胞类型中被改变以支持学习和记忆，也不清楚每种细胞类型中的哪些特定蛋白质在其合成或降解中增加或减少。因此，蛋白质稳态的综合研究需要能够区分来自特定细胞类型的蛋白质组。事实上，鉴定细胞类型特异性蛋白质组以研究多细胞环境中发生的细胞过程一直是蛋白质组学的一个重要障碍。出于这个原因，我们开发了一种使用MetRS*表达结合生物正交方法的技术，该技术已被证明是鉴定和纯化细胞类型特异性蛋白质组的有效方法，填补了这一空白⁵，^6，7。

突变体MetRS*（MetRS L274G）的表达允许将非规范蛋氨酸类似物ANL加载到相应的tRNA⁸，⁹中^，并随后将其掺入蛋白质中。当MetRS*表达被细胞类型特异性启动子调节时，非规范氨基酸将以细胞选择性方式掺入蛋白质中。一旦ANL掺入蛋白质中，就可以通过点击化学选择性地进行功能化，随后通过成像（FUNCAT）或蛋白质免疫印迹（BONCAT）进行可视化。或者，蛋白质可以通过质谱（MS）选择性纯化和鉴定。使用这项技术，我们在Cre重组酶的控制下创建了一个表达MetRS*蛋白的小鼠系。考虑到可用的Cre-mouse系数量不断增加，MetRS*系统可用于任何领域，以研究来自存在Cre系的任何组织的任何细胞类型。ANL的蛋白质标记可以在体外或体内进行，并且不会改变小鼠的行为或蛋白质完整性⁶。标记时间跨度可以适应每个研究人员的科学问题，标记新合成的蛋白质（较短的标记时间）或整个蛋白质组（较长的标记时间）。该技术的使用受到研究人员愿意研究的类型细胞数量的限制;因此，这种方法无法从低数量或低代谢率的细胞类型中分离蛋白质。所提出的方法的目标是鉴定体内标记的细胞类型特异性蛋白质/蛋白质组。在该协议中，我们描述了如何在活小鼠中用ANL标记细胞类型特异性蛋白质组并纯化标记的蛋白质。纯化后，蛋白质可以通过常规质谱方案^5，10进行鉴定。通过从特定细胞群中选择性纯化蛋白质，该方法降低了样品复杂性，使实验者能够检测蛋白质组的细微变化，例如响应环境变化。标记蛋白的纯化可以在~10天内实现，不包括MS分析或标记期。在这里，我们描述了两种向表达MetRS*的小鼠施用ANL的方法，即（1）在饮用水中添加氨基酸，和（2）通过腹膜内注射引入ANL。无论选择哪种方法进行ANL给药，分离和纯化步骤都是相同的（从步骤2开始）。

研究方案

所有动物实验均在德国（RP Darmstadt;协议:V54-19c20/15-F122/14、V54-19c20/15-F126/1012）或西班牙（UCM动物实验委员会和马德里市环境咨询委员会，协议号:PROEX 005.0/21）的许可下进行，并符合马克斯普朗克学会规则和西班牙法规，并遵循欧盟动物福利准则。

1 . ANL体内代谢标记

1. 饮用水:
   1. 将ANL和麦芽糖溶解在小鼠的常规饮用水中。推荐的麦芽糖浓度为0.7%（重量/体积）。添加到饮用水中的最大ANL量为1%（重量/体积）。混合物准备好后，通过过滤对其进行灭菌并将其储存在4°C。
   2. 将步骤1.1中制备的混合物提供给小鼠。经常更换瓶子（例如，每3天一次）以避免污染，并每天检查它们以寻找可能的污染或堵塞。通过称重来监测每天喝水量，以了解小鼠的ANL摄入量。
      注意:这里评估的最长标记期是 3 周，使用 ANL 在饮用水中的 1% 浓度，这导致大脑中可很好地检测到标记。良好的标签也可以在 2 周内实现。我们使用这种管理方法既没有研究较短的标记时间，也没有较长的时间点或其他ANL量，这并不意味着上述方法不起作用。ANL掺入率可能因研究的组织或细胞类型而异。标记的时间可能因科学问题而异;例如，如果要标记蛋白质组，则应根据所研究组织中蛋白质的平均半衰期来计算标记时间。如果兴趣只是识别新合成的蛋白质，则可以缩短时间。标记周期和ANL剂量必须针对每个实验条件和感兴趣的细胞类型进行经验测试。
2. 腹膜内给药:
   1. 将ANL溶解在生理NaCl溶液中至400 mM，磷酸盐缓冲液（PBS）或水中。
   2. 确保溶液的渗透压在生理范围内。在这里，向小鼠施用10mL / kg体重的ANL溶液。
      注意:通过每天腹膜内注射（IP）和400mM ANL成功获得大脑兴奋性神经元中的良好标记，持续1周。在本研究中，较低的ANL浓度或其他IP注入标记期均未进行测试，这并不意味着它们不起作用。ANL由一些公司以盐酸盐形式供应。在这种情况下，必须将溶液的pH调节到足够的pH值（取决于给药途径）。ANL也可以按照Link等人发表的方法合成¹¹ ，并进行一些修改⁵。可以使用其他 ANL 浓度、时间跨度和管理途径进行 ANL 标记。对于代谢率低的组织/细胞类型，可以使用低含量蛋氨酸饮食，始终在 ANL 给药前 1 周开始。当使用400mM ANL时，它在4°C储存时会沉淀;加热至37°C将ANL带回溶液中。注射前让它达到室温。在世界上大多数地区，对小鼠的ANL给药是一项动物实验，需要得到有关当局的批准。

2. 组织收获、裂解和蛋白质提取

1. 组织解剖:解剖含有感兴趣细胞类型的组织区域，并注意收集的组织块的重量。
   注意:样品可以在-80°C下储存数月（停止点）。在本协议中，解剖小鼠皮层和海马体。
2. 组织裂解:在室温下通过添加12-15倍于裂解缓冲液组织湿重的体积（PBS pH 7.4，1%重量/体积SDS，1%（体积/体积）Triton X-100，苯佐酶（1:1000体积/体积），蛋白酶抑制剂（PI）（EDTA游离1:4000））在室温下匀浆组织。例如，对于 20 mg 组织片，加入 240-300 μL 裂解缓冲液。研磨组织直至其均质化。
   注意:样品可以在-80°C下储存数月（停止点）。对于在 1.5 mL 管中直接匀浆，建议使用手持式电池供电均质器，尤其是在处理小块组织时。对于较大的工件，可以使用 Dounce 均质机。对于包含蛋白酶抑制剂（PI）的每种缓冲液，应在使用前立即添加，而不是更早添加。
3. 蛋白质变性:将匀浆加热至75°C15分钟，并在10°C下以17，000× g 离心15分钟。 将上清液转移到新管中。
4. 蛋白质含量测量:测量每个样品的蛋白质浓度，并将所有要比较的样品调整为相同的蛋白质浓度;通过添加裂解缓冲液来调节浓度。最佳浓度范围在 2-4 μg/μL 之间。
   注意:样品可以在-80°C下储存数月（停止点）。
5. 烷基化
   1. 将均质样品在PBS（pH 7.8）+ PI（不含EDTA的1:4000）中稀释2-3倍。
   2. 加入碘乙酰胺（IAA）至终浓度为20mM（储备溶液500mM）。
   3. 将样品在20°C下在黑暗中放置1-2小时。执行步骤 2.5.2-2.5.3 两次。
      注意:对于某些组织，如果阴性对照中的非特异性点击仍然很高，则可能需要在烷基化¹²之前执行还原步骤。在将IAA原液添加到样品中之前，请新鲜制备IAA原液。样品可在-80°C下储存数月（停止点）。
6. 缓冲液置换:使用点击化学交换缓冲液（PBS pH 7.8、0.04%（重量/体积）SDS、0.08%（体积/体积）Triton X-100和PI（1:4000））平衡缓冲液交换柱。按照制造商的说明进行操作。更换所有烷基化样品。
   注意:洗脱的样品可在-80°C下储存数月（停止点）。在此步骤中，消除了IAA，并通过点击化学缓冲液交换缓冲液。在缓冲液交换步骤后可以再次测量蛋白质，以确保蛋白质在缓冲液交换过程中不会丢失。根据用于缓冲液交换的色谱柱类型，蛋白质可能会大量丢失。使用推荐的色谱柱以避免蛋白质损失。对于样品储存，建议制备等分试样。
7. 单击反应以评估实验中的ANL掺入
   1. 在步骤 2.6 中取 40 μL 洗脱样品，并加入 PBS （pH 7.8） 至最终体积为 120 μL。
   2. 要设置点击化学反应，请按给定顺序添加以下试剂，并在每次加入后涡旋20秒:1.5 μL 三唑配体（库存 40 mM）、1.5 μL 生物素炔烃（库存 5 mM）和 1 μL 溴化铜（I）（库存 10 mg/mL，通过小心上下移液溶解在 DMSO 中， 不要涡旋）。尽快添加试剂。
   3. 将样品在4°C的黑暗中连续旋转孵育过夜。
   4. 将样品在4°C下以17，000× g离心5分钟。可以看到略带绿松石色的颗粒。将上清液转移到新管中。
      注意:使用前立即准备溴化铜（I）原料，以避免铜氧化。保持裂解样品与样品之间PBS之间的体积比恒定对于确保每个试管中的最终洗涤剂浓度相同至关重要。为了加快点击化学反应的组装，建议使用带有管架的工作台式涡旋器。将点击的样品在-80°C下储存数月，或在-20°C下储存数周，直到进一步处理（停止点）。
8. 蛋白质印迹分析以评估实验中的ANL掺入
   1. 使用来自点击化学反应的 20-40 μL 上清液运行 SDS-PAGE（步骤 2.7）。使用12%丙烯酰胺凝胶，在1%SDS，250 mM Tris-HCl，2 mM甘氨酸中运行。运行直到前面从凝胶中取出。
   2. 将蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜¹³上。
   3. 将膜在4°C下与GFP抗体（1:500，GFP蛋白与MetRS * ⁵共翻译）和生物素抗体（1:1000）孵育过夜，用于点击炔烃检测，其与生物素偶联。
   4. 洗涤一抗2次10分钟，加入二抗1.5小时。
   5. 洗涤二抗2次10分钟并扫描（如果使用荧光团偶联抗体）或暴露于薄膜（如果使用辣根过氧化物酶偶联抗体）。
   6. 使用 ImageJ 或类似软件量化生物素信号，评估实验每个样品的一般标记，并检测可能的异常值。评估实验的信噪比（ANL样品标记与阴性对照的背景），并检测未能吸收/合并ANL的可能动物。
      注意:对于ANL掺入率高的样品，理论上可以使用不可裂解的炔烃进行蛋白质纯化，例如本节中用于评估ANL掺入的炔烃。使用脑样品，使用不可裂解炔烃纯化蛋白质后MS在阴性对照中获得的背景过高¹⁴。因此，只有更易于处理、不可裂解的炔烃用于首次一般样品和实验评估。无论用于蛋白质纯化的炔烃类型如何，建议执行下一节（步骤2.9）中描述的炔烃剂量优化步骤。
9. 点击反应优化可裂解炔烃剂量
   1. 用 40 μL 一个代表性样品（在步骤 2.6 中获得并在步骤 2.8 中评估）制备四个试管，并将 PBS （pH 7.8） 加入到 120 μL 的最终体积中。
   2. 按照步骤2.7中的说明设置点击化学反应，但这次，添加四种不同量的DST-炔烃。对于所述炔烃，建议测试5μM，15μM，30μM和60μM。
   3. 重复步骤2.8，根据背景信号最高的标记效率和最低的背景信号，确定哪种炔烃剂量最适合正在研究的特定实验问题。
      注意:在对剩余样品进行点击反应之前，需要确定任何炔烃的最佳量。可以使用几种市售炔烃。它们在裂解方式上有所不同（例如，轻剂或还原剂）。使用菌株促进试剂（例如DBCO试剂）进行无铜点击化学也是可能的。炔烃或DBCO试剂量的微小变化通常会显着增加阴性对照（背景）中的信号。这里描述了使用具有可通过还原剂裂解的二硫键炔烃（二硫生物素炔烃或DST-炔烃¹⁵）的蛋白质纯化。使用DST炔烃运行时，为了运行SDS-PAGE（步骤8.1），请避免用强还原剂（如DTT或β-巯基乙醇）加载缓冲液，以防止炔烃裂解。在本研究中，在72°C下加热5分钟，在上样缓冲液中使用5mM的N-乙基马来酰亚胺（NEM）不影响DST-炔烃稳定性。步骤2.9.2可以重复，在观察到的最佳剂量范围内测试更细粒度的剂量。
10. 用于蛋白质纯化的制备型点击反应
    1. 使用步骤2.9中确定的最佳炔烃剂量单击步骤2.6中获得的所有样品，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析馏分（步骤2.8）。
       注意:确保移液器已正确校准，以确保样品升标精度。点击的样品可以在-80°C下储存数月（停止点）。

3. 蛋白质纯化

1. 缓冲液交换
   1. 如步骤2.6所述，将所有点击的样品置于缓冲液交换程序，但使用Neutravidin结合缓冲液作为平衡缓冲液（PBS pH 7.4，0.15%（重量/体积）SDS，1%（体积/体积）Triton X-100和PI（1:2000））。
      注意:洗脱的样品可在-80°C下储存数月（停止点）。在此步骤中，去除未点击的游离炔烃，并通过中性粒细胞素结合缓冲液交换缓冲液。
2. 与中性粒细胞蛋白珠结合
   1. 用中性粒细胞素结合缓冲液洗涤中性粒细胞素高容量珠子（参见步骤3.1）;将珠子与缓冲液混合，并以3000× g离心混合物5分钟，弃去上清液。重复三次。
   2. 通过加入相同体积的干珠和中性粒素结合缓冲液来制备 1:1 的中性粒细胞素珠浆液。
   3. 留出20-40μL的每个样品作为预纯化的裂解物，并将其储存在-20°C。
   4. 测量蛋白质浓度（参见步骤2.4），并将100μg蛋白质与步骤3.2.2中获得的4μL珠浆混合。
   5. 将混合物在4°C下连续旋转孵育过夜，使标记的蛋白质能够与磁珠结合。
      注意:对于点击化学反应，可以升级步骤3.2.4中描述的基本亲和纯化反应。例如，为了从海马体的兴奋性神经元中纯化蛋白质，将1mg蛋白质裂解物与40μL中性粒细胞素珠（1:1浆液）混合。Neutravidin 珠子的量可以根据每毫克总蛋白质的标记蛋白量放大或缩小，这将取决于所选的细胞类型和标记期，需要根据经验确定。
3. 中性粒蛋白珠洗涤和蛋白质洗脱
   1. 通过离心收集上清液（参见步骤3.2.1）。将每种上清液的20-40μl等分试样放在一边以供以后分析，并将其余液在-80°C冷冻。
   2. 通过添加缓冲液、沉淀珠子并丢弃上清液，用冷却的 Neutravidin 洗涤缓冲液 1（PBS pH 7.4、0.2%（重量/体积）SDS、1%（体积/体积）Triton X-100 和 PI （1:2000））洗涤珠子。重复此步骤三次。
   3. 然后，加入相同的缓冲液，并将珠子在4°C下连续旋转孵育10分钟，然后弃去上清液。重复此步骤三次。
   4. 按照步骤3.3.2-3.3.3中的说明洗涤珠子，但使用中性粒细胞素洗涤缓冲液2（1x PBS，pH 7.4和PI 1:2000）。
   5. 按照步骤3.3.2-3.3.3的解释洗涤珠子，但使用中性粒细胞素洗涤缓冲液3（50mM碳酸氢铵和PI 1:2000）。
   6. 通过将磁珠在20°C下孵育30分钟与对应于所用干珠体积的体积的Neutravidin洗脱缓冲液（5%（体积/体积）β-巯基乙醇和0.03%（wt/vol）SDS））洗脱点击的蛋白质。
   7. 在洗脱过程中通过在热块振荡器中连续搅拌（1000rpm）保持珠子悬浮。洗脱两次并合并两种洗脱液。
      注:如步骤3.2.1所述，用于分离浆料（珠子）和水相（上清液）的固体部分的离心装置适用于步骤3.3.1-3.3.7。如果蛋白质洗脱不完全，可以增加SDS量。然而，当量高于SDS的0.08%-0.1%时，与磁珠非特异性结合的蛋白质开始洗脱。β-巯基乙醇具有挥发性和毒性;建议在步骤3.3.6-3.3.7中使用罩。在步骤3.2.3和3.3.1中收集的样品应通过SDS-PAGE运行，并通过蛋白质印迹（参见步骤2.8）进行评估，以评估亲和纯化的效率（步骤3.3）。
4. 洗脱蛋白的评估
   1. 将1/3的洗脱样品加载到SDS-PAGE中（参见步骤2.8.1）。
   2. 使用高灵敏度方法（例如银染或荧光方法）对凝胶进行染色以可视化蛋白质。
   3. 如果样品具有预期的质量，这意味着ANL标记样品中的蛋白质比阴性对照多3-4倍，则可以通过常规质谱方法鉴定洗脱的蛋白质，如参考^文献5中解释的方法。

结果

按照所描述的方案（总结在图1中），通过每日腹膜内注射（400mM ANL 10mL / kg，Nex-Cre::MetRS*）7天或通过饮用水（0.7%麦芽糖，1%ANL，CamkII-Cre::MetRS*）给予小鼠ANL21天。标记后，对相应的脑区域进行解剖、裂解、烷基化和点击。点击反应通过SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹进行分析。实验的代表性图像如图2所示，用于通过IP注入进行ANL给药，

讨论

该协议的关键方面是;包括阴性对照，具有足够的生物学重复，ANL给药途径，数量和持续时间，样品的烷基化，炔烃浓度以及使用DST-炔烃时的β-巯基乙醇消除。

关键是要包括来自ANL标记动物的阴性对照样品，没有Cre驱动程序，因此没有MetRS*表达。这些样品必须与来自ANL标记的Cre诱导的MetRS*小鼠的样品并行进行协议中描述的每个步骤。未单击的样本不是有效的控件，因为仅使用...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Acrylamide gels	GenScript	SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830	Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood
ANL			Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)
ANL-HCl	IrishBotech	HAA1625.0500
Benzonase	Sigma	E1014
Biotin alkyne	Thermo,	B10185
Chicken antibody anti-GFP	Aves	1020
Complete EDTA-free protease inhibitor	Roche	4693132001	Toxic; use a lab coat and gloves.
Copper (I) bromide	Sigma	254185	99.999% (wt/wt)
Disulfide tag (DST)-alkyne			Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20
DMSO	Sigma	276855
Filters	Merk	SCGP00525
Iodo acetamide (IAA)	Sigma	I1149
IR anti chicken 800	LI-COR	IRDye 800CW	Donkey anti-Chicken Secondary Antibody
IR anti rabit 680	LI-COR	IRDye 680RD	Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody
Maltose	Sigma	M9171
Manual Mixer	BioSpec Products	1083
NaCl	Sigma	S9888
N-ethylmaleimide	Sigma	4259	Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
NeutrAvidin beads	Pierce	29200
Nitrocellulose membrane	Bio-rad	1620112
PBS 1X	Thermo	J62036.K2
PBS 1X pH 7.8			Preparation described in reference number 5
PD SpinTrap G-25 columns	GE Healthcare		Buffer exchange
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo,	23225	Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.
Polyclonal rabbit anti-biotin antibody	Cell Signaling	5597
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
SDS 10%	Sigma	71736
SDS-PAGE  Running buffer MOPS	GenScript	M00138
SYPRO Ruby stain	Sigma	S4942
Table automatic Vortexer	Eppendorf	Mixmate
Triazole ligand	Sigma	678937
Triton X-100	Sigma	T9284
Water	Sigma	W4502	Molecular biology grade