通过叶绿素荧光分析评估光呼吸突变体的光合效率

摘要

我们描述了一种使用叶绿素荧光测量低CO₂ 处理后植物光合效率变化的方法。

摘要

光合作用和光呼吸是植物初级代谢中最大的碳通量，是植物生存所必需的。几十年来，许多对光合作用和光呼吸很重要的酶和基因已经得到了很好的研究，但这些生化途径的某些方面及其与几个亚细胞过程的串扰尚未完全了解。许多确定植物代谢中重要基因和蛋白质的工作都是在高度受控的环境中进行的，这些环境可能无法最好地代表自然和农业环境中的光合作用和光呼吸功能。考虑到非生物胁迫导致光合作用效率受损，有必要开发一种可以监测非生物胁迫及其对光合作用影响的高通量屏幕。

因此，我们开发了一种相对快速的方法来筛选非生物胁迫诱导的光合效率变化，该方法可以使用叶绿素荧光分析和低CO₂ 筛选来识别在光呼吸中起作用的未表征基因。本文描述了一种研究 拟南芥中转移的DNA（T-DNA）敲除突变体光合效率变化的方法。相同的方法可用于筛选甲磺酸乙酯（EMS）诱导的突变体或抑制因子筛选。利用该方法可以鉴定候选基因，以进一步研究植物初级代谢和非生物胁迫反应。来自这种方法的数据可以深入了解基因功能，直到暴露于增加的压力环境之前可能无法识别。

引言

农民田间常见的非生物胁迫条件会降低光合效率，从而对作物产量产生负面影响。热浪、气候变化、干旱和土壤盐度等有害环境条件会导致非生物胁迫，从而改变 CO₂ 的可用性并降低植物对高光胁迫的反应。两个最大的陆地碳通量是光合作用和光呼吸，这对植物生长和作物产量至关重要。参与这些过程的许多重要蛋白质和酶已在实验室条件下进行了表征，并在遗传水平^上进行了鉴定1。尽管在了解光合作用和光呼吸方面取得了很大进展，但许多步骤，包括植物细胞器之间的运输，仍未表征^2，3。

光呼吸是植物中仅次于光合作用的第二大碳通量，当Rubisco酶将氧气而不是二氧化碳固定到核酮糖1，5二磷酸（RuBP）上，产生抑制性化合物2-磷酸乙醇酸酯（2PG）¹时开始。为了尽量减少2PG的抑制作用并回收先前固定的碳，C3植物已经进化出光呼吸的多器官过程。光呼吸将两个2PG分子转化为一个3-磷酸甘油酸（3PGA）分子，可以重新进入C3固碳循环¹。因此，光呼吸仅从2PG的产生中转换了先前固定碳的75%，并在此过程中消耗了ATP。因此，光呼吸过程对光合作用过程有10%-50%的显着拖累，具体取决于水分的可用性和生长季节的温度⁴。

几十年来，参与光呼吸的酶一直是研究重点领域，但只有少数转运蛋白在遗传水平上被表征，尽管该过程至少涉及25个转运步骤⁵，^6，7。直接参与光呼吸过程中产生的碳运动的两种转运蛋白是乙醇酸质体/甘油酸酯转运蛋白PLGG1和胆汁酸钠共转运蛋白BASS6，两者都参与从叶绿体^5，6输出乙醇酸。

在环境温度[CO₂]下，Rubisco将氧分子固定在RuBP上的时间约为20%^1。当植物受到低[CO 2]时，光呼吸速率增加，使低[CO₂]成为测试突变体的理想环境，这些突变体在升高的光呼吸胁迫下可能很重要。在低CO₂下测试其他假定的叶绿体转运蛋白T-DNA系24小时并测量叶绿素荧光的变化导致鉴定出显示光呼吸突变表型⁵的bass6-1植物系。进一步表征表明BASS6是叶绿体内膜中的乙醇酸酯转运蛋白。

本文详细描述了一种类似于最初用于将BASS6鉴定为光呼吸转运蛋白的方案，该方案来自位于叶绿^体膜内的 假定转运蛋白列表8该协议可用于表征拟南芥T-DNA突变体或EMS生成的突变植物的高通量实验，作为鉴定在一系列非生物胁迫（例如热）下维持光合作用效率的重要基因的一种方式， 高光胁迫、干旱和 CO₂ 可用性。过去曾使用叶绿素荧光筛选植物突变体来快速鉴定对初级代谢很重要的基因⁹。由于多达30%的拟南芥基因组包含编码功能未知或表征不佳的蛋白质的基因，胁迫诱导的光合效率分析可以提供在突变植物受控条件下未观察到的分子功能的见解¹⁰。该方法的目标是使用低CO₂ 筛选来鉴定光呼吸途径的突变体。我们提出了一种方法来识别暴露于低CO₂后破坏光呼吸的突变体。这种方法的一个优点是，它是可以在相对较短的时间内完成的幼苗的高通量筛选。视频协议部分详细介绍了种子制备和灭菌、植物生长和低 CO₂ 处理、荧光成像系统的配置、处理样品的量子产率测量、代表性结果和结论。

研究方案

1. 种子制备和灭菌

注意:种子制备包括种子吸收和种子灭菌。重要的是要注意，所有这些步骤都将在层流罩中进行，以保持无菌条件。所有必要的材料、试剂和生长培养基必须高压灭菌（参见 材料表）。

1. 种子吸收和分层
   注意:使用的种子系是 plgg1-1 （salk_053463）， abcb26 （salk_085232）和野生型（WT，Col-0）。
   1. 将种子分配到 1.5 mL 微量离心管中。将种子在层流罩中的无菌水中吸收，并在4°C下在黑暗中分层2天。
2. 种子灭菌
   1. 在无菌条件下，制备 10 mL 的 50% （v/v） 漂白剂溶液，并加入约 20 μL 吐温 20。对于种子灭菌，从吸收的种子中除去水，将1mL漂白剂溶液加入微量离心管中，并在室温下孵育5分钟。
   2. 用移液管取出漂白剂溶液。
   3. 用 1 mL 无菌水冲洗种子以重悬。种子沉降到底部后取出水。重复步骤 1.6 和步骤 1.7 七次。
   4. 将种子重悬于无菌0.1%琼脂糖溶液中。
3. 种子镀层
   1. 将 5.43 g 粉末加入 500 mL 蒸馏水中，制成 1 L 体积的含有维生素的 Murashige & Skoog 基础培养基和 1.0 g/L 的 2-（N-吗啉基）乙磺酸 （MS）。使用氢氧化钾 （KOH） 将 pH 值调节在 5.6 至 5.8 之间。使用蒸馏水填充至1升。
      1. 将液体溶液分成500mL，并将每一半放入装有磁力搅拌棒的1L烧瓶中。加入5g琼脂粉，每个烧瓶获得1%琼脂w / v溶液。
      2. 在121°C和15psi下高压灭菌30分钟;然后，置于室温下，同时缓慢搅拌。冷却后，将 25 mL MS 琼脂倒入方形培养皿中。让它凝固。
         注意:这些Murashige&Skoog基础培养基板含有1%含有维生素的MS培养基和1%琼脂，用于培养测试突变体。
   2. 用剃须刀片切割 200 μL 移液器吸头。使用 200 μL 微量移液器，将一颗种子放在方形 MS 板（图 1）的每个测试突变体或基因型（1 cm² 正方形）的指定方形网格的中心。
      注意:1 cm x 1 cm方形网格有助于保持幼苗之间的均匀距离并避免重叠，这在以后的荧光成像和分析中非常重要。
   3. 种子铺好后，用手术胶带缠绕盖子以密封，并在下述条件下将其放入生长室中。

2. 植物生长和低CO₂ 处理

1. 在120μmol·m−²s⁻¹ 的8小时光循环和18°C的黑暗16小时下，在20°C下生长7-9天。 在第6天检查植物，以确定它们是否足够大以进行成像。在电镀后第 8 天，将植物暴露在低_{CO 2} 下。
2. 低_{CO 2} 处理
   1. 7-9天后，将来自环境生长室条件的八个板中的四个放入20°C的光呼吸条件下，连续光照水平为200μmol·m−2 ^s-1，低CO₂为¹²小时。
   2. 使用密封的透明容器构建低CO₂条件，容器底部放置100克苏打石灰。将容器放在与对照相同的生长室内。将对照植物保持在环境CO₂中120μmol·m−2 s⁻¹下¹²h。

3. 配置荧光成像系统

1. 在荧光成像系统中以固定距离将测试板（根据第1节和第2节制备）放在相机下方的固定距离处。
2. 在仪器软件中，导航到 实时窗口 并选中 闪烁 框以打开非光化测量闪光。
3. 单击 缩放 和 对焦 工具，直到看到完整而清晰的图像。为此，使用舞台或架子来调整植物和相机之间的距离。在整个实验中，保持变焦、焦点和与相机的距离恒定。
4. 将 El. 快门 的值设置为 0 并调整 灵敏度 以获得 200-500 数字单位范围内的荧光信号。
   注意:较低的El.快门值（0-1）将确保测量闪光是非光化的，而较高的值（2）将提高图像的分辨率。
5. 将测光表放在用于调整相机设置的相同位置。
6. 在 实时窗口中，选中 超级 框以启动持续 800 毫秒的饱和脉冲。请记住每次选中该框以获取新的脉冲。
7. 使用滑块调整 超级脉冲的相对功率百分比 ，直到测光表读数为 6，000-8 ，000 μmol·m−²s⁻¹。

4. 设计量子良率计划

1. 导入成像系统的标准操作工具。
   包括默认.inc
   包括光.inc
   注意:本实验中用于参考的程序语法适用于FluorCam成像系统。
2. 根据配置的光源设置定义以下全局变量:
   快门 = 0
   灵敏度 = 40
   超级 = 65
3. 包括记录数据的时间步长:
   TS = 20ms
4. 通过在暗适应状态下采样荧光来收集Fo测量值。
   F0持续时间 = 2 秒;
   F0周期 = 200ms;
   注意: F0持续时间 定义了记录暗适应荧光的时间范围。 F0period 定义了重复暗适应荧光测量的时间间隔。
5. 将Fo测量值记录到数据表中。
   <0，F0周期..F0持续时间>=>mfmsub
   <0s>->检查点，"startFo"
   =>检查点，"endFo";
   其中 <，> 表示按时间索引的一组荧光值;=> 将测量值存储在系统文件中; MFMSUB 表示实验的整个数据集;检查 点 为特定度量（如 startFo）的数据创建一个子集。
6. 通过在饱和脉冲后对荧光进行采样来收集和存储 Fm 测量值。
   脉冲持续时间=960毫秒;##
   a1=F0持续时间 + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>卫星脉冲（脉冲持续时间）;
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>检查点，"startFm"
   =>检查点，"endFm"
   =>checkpoint，"timeVisual";
   其中 a1 和 a2 是将采样时间与饱和脉冲协调的变量; a1 表示 Fm 测量的开始时间; a2 表示脉冲的中点时间。

5. 测量处理样品的量子产率

1. 处理后，立即用铝箔覆盖板15分钟以进行黑暗适应。取下箔片，用脉冲振幅修正荧光计测量光系统 II 的量子产率。然后，将幼苗板直接放在相机下方，并运行 GitHub 存储库中的量子产量协议。
2. 从 GitHub 下载 quantum_yield 协议 （https://github.com/South-lab/fluorescent-screen） 或使用第 4 节中类似设计的程序。使用荧光计的软件通过单击文件夹图标并导航到文件位置来打开程序文件。
3. 通过单击 红色闪电图标运行量子产量程序。
4. 方案完成后，导航到 预分析 窗口。使用 选择工具 将板划分为单个幼苗，以突出显示板图像上每个幼苗的所有像素。单击 背景排除 以删除任何突出显示的背景像素，仅保留幼苗区域。
5. 单击 "分析 "以生成平板图像上每个幼苗的荧光数据。手动调整荧光值范围，以在所有板之间显示一致的最小值和最大值。
6. 单击"实验|"选项卡中的"数字平均值"出口|数字。选择"所有数据和按列"，然后单击"确定"以生成包含每个幼苗的 QY 测量值的文本文件。

6. 打开数据文件

1. 在电子表格中打开文本文件进行分析。在显示区域编号、像素大小、Fm、Ft、Fq 和 QY 的标题中，标识核心基因型（WT 或测试突变体）和 QYmax 的区域编号。对野生类型执行成对 t 检验以确定显著性。当 p 值低于 0.05 时，数据被解释为显著差异。

结果

结果显示了来自WT和测试突变体的环境和低CO₂筛选的原始和荧光图像的板图像。每个幼苗按面积编号标记，相应的荧光读数为QY。数据导出为文本文件，可以在电子表格中打开进行分析（请参阅补充表S1）。选择突变系plgg1-1和abcb26来证明与光呼吸应激相关的基因的阳性和阴性鉴定。PLGG1编码RuBP⁶氧合后通路中的第一个转运蛋白，而ABCB26被认为编码?...

讨论

本文概述的实验方法具有一些优点和局限性。一个优点是这种方法可以筛选许多植物幼苗，尽管必须采取一些预防措施以防止在电镀和生长过程中污染植物培养基板。因此，用手术胶带密封拟南芥板至关重要。该实验的另一个优点是，与先前^{发表的工作相比}，它具有更短的12小时光呼吸应激期8。治疗时间的减少是为了更好地区分WT和选定突变体之间的Fv/Fm差异。治疗时间可能需要...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization