一种微创、准确、高效的小鼠胸腺内注射技术

摘要

本协议描述了为小鼠胸腺内注射建立的介入放射学程序，以避免开放手术的风险并提高盲经皮注射的准确性。

摘要

小鼠模型中的胸腺内注射是研究胸腺和免疫功能（包括遗传和获得性T细胞疾病）的重要技术。这需要将试剂和/或细胞直接沉积到活小鼠胸腺中的方法。传统的胸腺内注射方法包括胸外科或微创经皮盲注，这两种方法都有明显的局限性。超高频超声成像装置使图像引导经皮注射在小鼠中成为可能，大大提高了经皮注射方法的注射精度，并使注射目标更小成为可能。然而，图像引导注射依赖于集成轨道系统的利用，这使得这是一个严格且耗时的过程。本文介绍了一种独特、安全、高效的小鼠经皮胸腺内注射方法，消除了对轨道系统注射的依赖。该技术依赖于使用高分辨率微超声单元对小鼠胸腺进行无创成像。使用徒手技术，放射科医生可以在超声指导下将针尖直接放入小鼠胸腺中。在成像前清洁和麻醉小鼠。对于擅长超声引导程序的经验丰富的放射科医生来说，所述技术的学习期很短，通常在一个会话内。该方法对小鼠的发病率和死亡率较低，并且比目前的经皮注射机械辅助技术快得多。它使研究者能够有效地对任何大小的胸腺（包括非常小的器官，如老年或免疫缺陷小鼠的胸腺）进行精确可靠的经皮注射，而对动物的压力最小。如果需要，该方法可以注射单个叶，并且由于该程序的省时性质，有助于大规模实验。

引言

胸腺在T细胞发育和免疫中起着至关重要的作用。T细胞缺乏症可由胸腺退化，遗传性疾病，感染和癌症治疗等因素引起，导致高死亡率和发病率1^，2。小鼠模型在基础和转化免疫学研究中都是必不可少的，几十年来一直用于研究胸腺生物学和T细胞发育，以及为患有胸腺功能障碍和T细胞缺陷的患者开发治疗方法3，^4，5。

胸腺研究的核心部分是心腺内注射生物材料，如小鼠模型⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，12中的细胞，基因或蛋白质。传统的胸腺内注射方法使用开胸术，然后在直接可视化下进行胸腔内注射或通过"盲"经皮注射到纵隔。手术方法会显著增加气胸风险等。此外，该手术期间升高的压力会导致免疫抑制，从而可能损害免疫学数据¹³。经验丰富的研究人员经过一些实践，可以执行盲注射技术，但这种方法不太准确，因此将实验对象限制在胸腺大的年轻小鼠身上。

超声引导的使用已被引入，作为传统胸腺内注射方法的精确和微创替代方案¹⁴。但是，当使用集成轨道系统而不是徒手技术时，此过程非常耗时。使用进样支架进行进样需要借助各种附件（如探头支架和支架、X、Y 和 Z 定位系统）对换能器进行仔细的成像优化和定位，以及熟练操作显微操作控制和导轨系统扩展。这里介绍了一种简单的替代技术，即超声引导胸腺注射，由放射科医生使用徒手方法¹⁵进行，这是上述方法的快速和准确的微创替代方案。重要的是，目前的方法可以使用任何高分辨率超声成像系统执行，而无需注射安装和集成导轨系统。它对于需要注射大量小鼠¹¹的研究，涉及注射两个胸腺叶的实验，或用于在老年，辐照或免疫功能低下的小鼠中准确注射小胸腺¹²特别有用。

研究方案

所有程序均按照发现与创新中心的动物护理指南（IACUC协议290）进行。对于本研究，C57BL / 6小鼠（雌性，4-6周龄），C57BL / 6小鼠（雌性，6个月大），J:NU雌性小鼠，NOD scid γ（NSG）雌性小鼠和B6;分别以CAG-luc、-GFP小鼠为幼鼠模型、老年小鼠模型、无胸腺裸体模型、免疫缺陷模型和生物发光细胞源。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。这个过程通常需要两个人（一个在进行注射时保持无菌，另一个处理小鼠）。

1. 动物制备

1. 使用3%-4%异氟烷气体诱导小鼠麻醉，并使用通过鼻锥和精密校准蒸发器施用的1%-3%异氟烷气体维持麻醉（参见材料表）。
2. 通过对后爪捏伤无反应来确认适当的麻醉深度/无意识。
3. 通过涂抹一层薄薄的脱毛膏少于1分钟，从小鼠的前胸部区域去除皮毛。使用湿纸巾将奶油与松散的皮毛一起完全去除。
   注意:涂抹过多的乳霜会导致胸部皮肤发炎。
4. 一次将一只小鼠仰卧在小动物超声成像站的加热平台上（见 材料表），鼻锥就位（图1）。
5. 在后肢和前肢用医用胶带将鼠标固定到载物台上（图1）。
6. 在双眼涂抹眼药膏以防止角膜干燥。
7. 使用葡萄糖酸氯己定涂抹器对无毛皮的上胸皮肤进行消毒（见 材料表）。

2.超声机和无菌场的准备

1. 激活可用的最高频率线性探针，通常是与被成像动物的大小具有最高空间分辨率的探针。通过点击启动屏幕后的相应按钮来激活探头。
   注意:对于小鼠的这种应用，使用的探针专门设计用于小鼠和小鼠（参见 材料表）。
2. 按照以下步骤优化成像和注射的超声设置。
   1. 通过调整屏幕右侧的垂直方向滑块，将视野深度调整为目标动物的适当大小（图2）。对于年轻小鼠，最大深度设置通常约为6-8毫米。
   2. 通过沿屏幕底部的水平条滑动按钮来调整灰度增益（图2）。目标是从比典型的"灰色"外观略暗的图像开始。
   3. 将焦点区域（屏幕右侧的蓝色箭头， 图2）调整到胸腺的预期水平。对于年轻小鼠，这将在4毫米左右的深度。
   4. 如果需要图像捕获，请测试存储图像和存储剪辑按钮的功能，以确保在整个过程中可以适当地保存图像。通过点击屏幕右下角的"保存剪辑"按钮或点击"冻结"按钮，然后点击"保存图像"（图2）来执行此操作。
3. 将少量（~1 mL）超声凝胶直立在换能器表面（见 材料表）上，放在超声机支架上或助手手中。
4. 在加热平台旁边准备一个小的无菌场。为此，最佳定位通常是在平台和超声机之间。
   1. 将这些物品倒入无菌区域:无菌探头盖，橡皮筋，无菌手套和无菌超声凝胶（见 材料表）。
   2. 设置无菌区域并放置物品后，戴上无菌手套。
   3. 小心地将无菌探头盖放在超声换能器上（以及最初放在探头上的凝胶上）。保持无菌，只接触无菌盖，别无他物。将无菌橡皮筋滑过无菌探头盖以将其固定到位。
      注意:无论大小，气灶都会干扰超声成像。因此，必须在换能器和无菌探头盖之间以及探头盖顶部应用超声凝胶，以确保超声探头和动物之间的无空气界面。
   4. 将适量（2-3 mL）无菌超声凝胶滴在换能器上。
      注意:用户现在已准备好对麻醉鼠标进行映像。

3. 胸腺成像和定位

1. 在保持无菌的同时，将超声凝胶顶探头垂直放置在小鼠前胸壁的消毒部分进行初始成像。
   1. 花点时间查看超声图像并进一步优化。返回到步骤 2.2 并进行调整以获得类似于 图 3 的外观。
2. 在横向平面上扫描鼠标的前胸部。为此，垂直握住换能器，并以画笔状或"扫荡"的动作将其从颈部上下移动到腹部。
   注意:心脏将是胸部最容易识别的结构，因为它的快速运动和"腔室"外观。一旦心脏定位，这可以用作获取胸腺图像的参考点。
3. 使心脏以视野为中心，将换能器稍微向颈部扫过。胸腺仅次于心脏，通常会遇到胸腺。
4. 将胸腺可视化为双叶，锥体，低回声（屏幕上出现的"黑暗"或"黑色"）结构，该结构位于中线中心，主动脉前方和胸骨后部（图3A）。
5. 记下上胸部两侧的两个圆形成对的黑色（即"低回声"）结构。
   注意:这些是双侧腔静脉。主动脉是位于两个腔静脉之间的中线的类似曲线低回声结构。这些很容易通过它们的脉动运动来识别。

4. 胸腺注射

1. 如果需要，在换能器上涂抹更多（2-3 mL）无菌超声凝胶。
   注意:换能器上相对大量的无菌凝胶（与小鼠胸部的大小相比）将充当小鼠胸壁周围的"凝胶垫"。这将减少视野内空气产生的超声波伪影的数量。
2. 使用超声探头，定位胸腺的最宽部分，这通常是理想的注射目标部位。预测所选位置的水平指针轨迹。
   1. 注意主要血管（SVC和主动脉）在该部位的位置。在注射过程中避免这些。
   2. 血管将是低回声、脉动结构，如步骤3.7所述。如果不确定，请使用彩色多普勒模式检查血管内的血流（图4A）。通过点击屏幕上 的颜色按钮激活 彩色多普勒模式。
   3. 如果预计其中一条主要血管（或心脏）将沿着预期的针头轨迹，请选择新的目标区域或找到不同的方法/轨迹。
3. 一只手握住换能器，另一只手拿着30 G胰岛素针（见 材料表），注射10μL。
   注意:注射液将根据实验设计而有所不同。本研究使用磷酸盐缓冲盐水、台盼蓝或D-荧光素（0.1 μg/ 10 μL）。
4. 要开始注射过程，请横向移动换能器，使胸腺在超声视野中偏离中心。确保视野的另一侧主要由超声凝胶组成，没有其他内容。
5. 将针尖放在换能器下方的凝胶中，慢慢移动针头，直到它靠近皮肤表面（图4B）。
6. 在超声下连续成像针头的同时，将针头以经皮轨迹插入胸腺，远离血管。
   1. 使用"十字胸腺"水平轨迹将针尖放置在入口部位对侧的胸腺叶中。这解释了沿针道的潜在泄漏（图5A）。
7. 一旦针尖进入胸腺的所需部分，在使用超声可视化的同时，从 30 G 注射器中快速注射内容物（例如 10 μL 台盼蓝或 D-荧光素，0.1 μg/10 μL）。
   1. 为了在针头插入和注射过程中稳定注射器，请将注射器夹在拇指和食指之间，并用食指控制注射器柱塞。
8. 将所有内容物沉积后取出针头。

5. 动物注射后监测

1. 将动物转移到空笼子中并观察，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
   注意:预计从麻醉中完全恢复将在 2 分钟内发生。
2. 再监测动物 10 分钟是否有痛苦、呼吸困难或出血的迹象。
   注意:预计不会有注射后疼痛，通常不需要注射后镇痛。
3. 一旦完全康复并经过平静的注射后观察期，将注射的动物送回其他动物的陪伴下。

结果

该技术的成功实施依赖于要遵循的几个关键步骤。首先，必须确保胸腺本身的可靠识别。在年轻小鼠中，由于腺体的尺寸很大，这很简单（图3A）。在老年小鼠或免疫缺陷小鼠中，它可能更具挑战性;但是，使用现代超声设备仍然非常可行（图3B，C）。其次，设置针头轨迹至关重要，以便在针尖穿过胸壁层并进入胸腺的过程中连续可视化。?...

讨论

超声引导徒手注射是一种高度准确的技术，以高效和无菌的方式将研究材料输送到胸腺。在注射部位对皮肤进行初始灭菌后，由于使用了无菌手套、无菌超声探头盖和无菌超声凝胶，因此在手术过程中保持无菌。与盲经皮入路¹⁰，¹⁷或依靠手术切口直接观察胸腺^18，19（这是小鼠胸腺内注射的常用方法）相比^，使用徒手...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform