从小鼠子宫建立3D子宫内膜类器官

摘要

该协议描述了建立小鼠子宫内膜上皮类器官以进行基因表达和组织学分析的方法。

摘要

子宫内膜组织排列在子宫内腔，并受到雌激素和孕激素的周期性控制。它是一种由管腔和腺体上皮、基质隔室、血管网络和复杂免疫细胞群组成的组织。小鼠模型一直是研究子宫内膜的有力工具，揭示了控制植入、胎盘和癌症的关键机制。3D子宫内膜类器官培养的最新发展提供了一个最先进的模型来剖析子宫内膜生物学的信号通路。从基因工程小鼠模型中建立子宫内膜类器官，分析其转录组并以单细胞分辨率可视化其形态是研究子宫内膜疾病的关键工具。本文概述了建立小鼠子宫内膜上皮3D培养的方法，并描述了量化基因表达和分析类器官组织学的技术。目标是提供可用于建立、培养和研究子宫内膜上皮类器官的基因表达和形态特征的资源。

引言

子宫内膜 - 子宫腔的内衬粘膜组织 - 是一种独特且高度动态的组织，在女性的生殖健康中起着关键作用。在生殖寿命期间，子宫内膜有可能经历数百个增殖，分化和分解的循环，由卵巢激素 - 雌激素和孕激素的协调作用协调。对基因工程小鼠的研究揭示了支撑子宫内膜对激素反应和控制胚胎植入、基质细胞蜕膜化和怀孕的基本生物学机制¹。然而，由于难以在传统的2D细胞培养物中维持未转化的原代小鼠子宫内膜组织，体外研究受到限制^2，3。子宫内膜组织培养为3D器官系统或类器官的最新进展为研究控制子宫内膜细胞再生和分化的生物学途径提供了新的机会。小鼠和人子宫内膜类器官系统已由封装在各种基质中的纯子宫内膜上皮4，⁵开发而人子宫内膜已培养为无支架上皮/基质共培养物⁶，^7，最近作为胶原封装的上皮/基质组合8 .上皮类器官培养物的生长和再生潜力得到了生长因子和小分子抑制剂的定义混合物的支持，这些生长因子和小分子抑制剂已被经验确定为最大化类器官的生长和再生4，^5，9。此外，冷冻和解冻子宫内膜类器官的能力允许长期储存来自小鼠和人类的子宫内膜类器官，用于未来的研究。

基因工程小鼠揭示了控制早期怀孕和蜕膜化的复杂信号通路，并已被用作妊娠丢失，子宫内膜癌和子宫内膜异位症的模型。这些遗传研究主要是通过使用在女性生殖组织中特别活跃的cre重组酶对loxP侧翼等位基因（"floxed"）的细胞特异性缺失来实现的。这些小鼠模型包括广泛使用的黄体酮受体-cre¹⁰，其在子宫内膜上皮和基质组织中具有很强的重组酶活性，乳铁蛋白i-cre，诱导成年小鼠子宫内膜上皮重组¹¹，或Wnt7a-cre，在Müllerian衍生组织中触发上皮特异性缺失¹².将基因工程小鼠模型中的子宫内膜组织培养为3D类器官为研究子宫内膜生物学提供了绝佳的机会，并促进了控制子宫内膜细胞更新和分化的生长因子和信号通路的鉴定^13，14。文献中描述了小鼠子宫内膜组织的分离和培养方法，并报道了使用各种酶促策略分离子宫上皮以随后培养子宫内膜上皮类器官^4。虽然以前的文献为子宫内膜上皮类器官培养方案提供了关键框架⁴，5，^6，但本文为生成，^维持，处理和分析这些类器官提供了一种清晰^，全面的方法。这些技术的标准化对于加速妇女生殖生物学领域的进步非常重要。在这里，我们报告了一种酶促和机械纯化小鼠子宫内膜上皮组织的详细方法，用于随后在凝胶基质支架中培养子宫内膜类器官。我们还描述了凝胶基质封装的小鼠子宫内膜上皮类器官的下游组织学和分子分析方法。

研究方案

小鼠处理和实验研究是根据贝勒医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议以及NIH实验动物护理和使用指南制定的指南进行的。

1.使用酶和机械方法从小鼠中分离子宫上皮

注意:本节描述了使用凝胶基质支架建立，传代，冷冻和解冻小鼠上皮子宫内膜类器官所需的步骤。先前的研究已经确定，小鼠子宫内膜类器官的最佳培养物是在发情期⁴期间从小鼠身上建立的，这可以通过阴道拭子的细胞学检查来确定¹⁵。成年雌性WT小鼠（6-8周龄，杂交C57BL / 6J和129S5 / SvEvBrd）用于所有实验。根据IACUC批准的指南，使用异氟醚镇静剂对小鼠进行人道安乐死，然后进行宫颈脱节。一旦小鼠被安乐死，应遵循以下步骤。有关此协议中使用的材料和溶液的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 使用前让凝胶基质在冰上解冻约1-2小时。
2. 要解剖小鼠，请使用剪刀在腹部做一个中线切口，然后轻轻剥开皮肤以露出下面的腹膜层。用镊子支撑腹膜层，用剪刀做侧切口，露出腹部内容物。
   1. 通过将腹部脂肪垫轻轻移到一边来定位子宫角。首先将它们放在颈交处并用剪刀沿着肠系膜脂肪切割来解剖它们。解剖小鼠子宫后，用小剪刀彻底去除子宫角上的脂肪组织。
      注意:通过使用前对所有手术工具进行消毒，在细胞分离期间保持无菌，用70%乙醇喷洒小鼠腹部，并在无菌组织培养罩下执行解剖后的所有步骤。
3. 将每个子宫角切成小碎片，每个碎片尺寸约为4-5毫米。
4. 将来自一个子宫的所有子宫碎片放入含有 0.5 mL 1% 胰蛋白酶的 24 孔板的一个孔中。允许酶溶液进入子宫腔，导致子宫内膜上皮与底层基质的酶促分离。
5. 将24孔板在37°C加湿的组织培养箱中孵育约1小时。
6. 孵育1小时后，将子宫碎片转移到含有1mL Dulbecco磷酸盐缓冲溶液（DPBS）的35mm组织培养板中。
7. 在解剖显微镜下，使用细镊子和 1 mL 移液管将子宫上皮与子宫管机械分离。用镊子按住子宫碎片的一端时，轻轻地将移液器尖端纵向穿过碎片，将上皮从子宫管的另一端挤出。在解剖显微镜下观察从子宫碎片分离的上皮片。
8. 使用 1 mL 移液器收集上皮片并将其轻轻转移到 1.5 mL 管中。
9. 对剩余的子宫碎片重复该过程，将所有上皮片转移到同一收集管中。
10. 通过以375× g离心5分钟来沉淀解离的上皮片。
11. 小心地除去上清液以避免干扰细胞沉淀。
12. 将细胞沉淀重悬于 0.5 mL 2.5 mg/mL 胶原酶 + 2 mg/mL 脱氧核糖核酸酶溶液中。上下移液约10倍，或直到达到单细胞悬液。
13. 加入 0.5 mL DMEM/F12 + 10% 胎牛血清 （FBS） + 抗生素，并以 375 × g 离心细胞 5 分钟。
    注意:有关用于细胞培养的广谱抗生素的更多信息，请参阅 材料表。
14. 小心地除去上清液并将细胞重悬于1mL DMEM / F12 + 10%FBS +抗生素中。将细胞以375× g离心5分钟。

2. 基质隔室的处理

注意:本节概述了分离小鼠子宫内膜基质室所需的方案。鉴于对上皮/基质共培养实验的兴趣日益浓厚，除了产生类器官的上皮细胞外，能够处理基质细胞群非常重要。

1. 一旦所有的上皮通过酶和机械方式与子宫碎片分离，剩下的管状结构就是"基质/肌层"隔室。在HBSS溶液中收集2.5mg / mL胶原酶+ 2mg / mL脱氧核糖核酸酶中的组织。
2. 将基质/肌层样品在37°C摇床上孵育15分钟。
3. 孵育后，每只小鼠加入 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素，并通过 40 μm 细胞过滤器过滤未解离的片段。
4. 通过以375× g离心5分钟来沉淀细胞。
5. 小心地除去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL DMEM / F12 + 10%FBS +抗生素中。将混合物滴加到 10 cm 细胞培养板中的 10 mL DMEM/F12 + 10% FBS + 抗生素中。将板在37°C下在加湿的细胞培养箱中孵育。
6. 为了产生小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的共培养物，请遵循使用无支架或胶原基^{质系统描述}的人子宫内膜类器官的方法6^，8。
   注意:虽然这些技术尚未在小鼠中发表，但它们可以根据已发表的人子宫内膜方案进行调整。

3.将子宫上皮包封成凝胶基质以建立类器官

注意:将凝胶基质放在冰上，直到准备好使用。

1. 除去上清液并将细胞沉淀重悬于细胞沉淀20倍的凝胶基质中（即，如果细胞沉淀为20μL，则用400μL凝胶基质重悬细胞）。小心地重悬颗粒以避免引入气泡。
2. 让凝胶基质/细胞悬液在室温下沉降~10分钟。
3. 一旦凝胶基质/细胞悬液变成半固体凝胶，使用宽口径 200 μL 吸头的 P200 微量移液器轻轻吸出 25 μL 凝胶基质/细胞悬液。在 12 孔板的每个孔中分配三个独立的 25 μL 圆顶，并使凝胶基质在 37 °C 加湿组织培养箱中固化 15 分钟。
4. 凝胶基质固化后，向每个含有凝胶基质圆顶的孔中加入 750 μL 类器官培养基。在37°C的加湿组织培养箱中孵育。
   注意:类器官培养基配方在 材料表中注明。类器官通常在初始培养后 4 天内形成。

4.雌二醇治疗后子宫内膜类器官的基因表达分析

注意:本节描述了在雌二醇治疗后使用实时qPCR分析子宫内膜上皮类器官基因表达的方法（E2;见表1）。由于子宫内膜处于卵巢激素E2的周期性控制之下，因此测试类器官对E2的反应性是生理功能的重要衡量标准。我们已经获得了高质量的RNA，并产生了足够的mRNA，可以使用来自子宫内膜上皮类器官的qPCR和/或RNA测序来分析基因表达。本节介绍如何收集类器官并对其进行处理，以便对基因表达进行下游分析。所选的治疗培养基反映了用于治疗培养的子宫内膜细胞的培养基。然而，应该注意的是，这种治疗培养基可以相应地优化，就像用激素⁸，^16，17治疗人子宫内膜3D培养物一样。

1. 如上所述培养子宫内膜类器官。
2. 取出类器官培养基，并在接种四天后用 750 μL 饥饿培养基替换。孵育过夜。
3. 第二天早上，取出饥饿介质。加入 750 μL 含有载体或 10 nM E2 的处理培养基。孵育48小时。
4. 按照试剂盒制造商的方案进行RNA分离。

5. 子宫内膜类器官的组织学分析

注意:对子宫内膜类器官的形态特征进行成像对于评估生长因子，遗传操作或小分子抑制剂的细胞效应至关重要。本节介绍使用组织学染色和抗体免疫荧光染色固定、处理和成像子宫内膜上皮类器官的技术。

1. 在 1x PBS 中制备含有 1 mL 4% 多聚甲醛的 1.5 mL 微量离心管。将它们放在冰上。
2. 从含有类器官的 12 孔板的孔中吸出培养基。
3. 使用带有切头的 1 mL 移液器吸头，将 500 μL 4% 多聚甲醛转移到每个孔中，并从板底部轻轻分离凝胶基质圆顶。
4. 将整个凝胶基质圆顶轻轻吸出到移液器吸头中，然后转移到 1.5 mL 微量离心管中。
5. 通过将类器官放在4°C的旋转器上过夜来固定类器官。
6. 第二天早上，将试管以600× g 离心5分钟以沉淀类器官。用移液管轻轻除去4%多聚甲醛溶液并丢弃。用70%乙醇洗涤类器官2倍。
7. 最后一次洗涤后，从管中取出除 50-100 μL 乙醇以外的所有乙醇。将试管放在一边。
8. 将一管样品处理凝胶放入水浴和微波炉中~30秒以熔化凝胶。通过监测凝胶的稠度，确保样品处理凝胶不会沸腾。
   注意:一旦样品处理凝胶融化，但不是沸腾的热，请快速封装类器官。
9. 转移足够的样品处理凝胶以覆盖模具的整个表面（约 250 μL）。
10. 当样品处理凝胶仍熔融时，快速转移含有类器官的 50 μL 70% 乙醇溶液。确保类器官凹陷或推到模具的底部。
11. 将组织学模具放在一桶冰上，让标本处理凝胶冷却并凝固。
12. 一旦样品处理凝胶完全干燥，小心地将样品处理凝胶方块转移到样品袋中，跟踪类器官所在的平面。
13. 将袋子放入组织学盒中，并使用用于福尔马林固定和组织石蜡包埋的标准方法进行处理¹⁸.
14. 固定并包埋在石蜡中后，使用切片机切成5μm切片¹⁹。继续进行标准的苏木精和伊红（H&E）染色或免疫染色程序，如下所述。

6. 苏木精和伊红染色

1. 脱蜡切片如下:二甲苯，2 x 10分钟;100%乙醇，2 x 3分钟;80%乙醇，3分钟;60%乙醇，3分钟;dH 2 O，₂x 3 分钟;苏木精1分钟;自来水（3 x 5 秒）;在伊红1分钟。
2. 脱水部分如下:60%乙醇，3分钟;80%乙醇，3分钟;95%乙醇，3分钟;100%乙醇，2 x 3分钟;二甲苯，2 x 15 分钟
3. 使用封片剂安装。

7. 免疫荧光染色

1. 按照步骤 6.1 中所述对切片进行脱蜡。
2. 进行抗原修复
   1. 将载玻片浸没在抗原修复溶液中，放入微波安全容器中。
   2. 微波高温20分钟，间隔5分钟，以确保溶液不会沸腾。
3. 20分钟抗原修复步骤完成后，让载玻片在冰上冷却40分钟，同时仍浸没在抗原修复缓冲液中。
4. 用 1x TBST 清洗载玻片 3 分钟
5. 通过在室温下在TBST中的3%BSA中孵育1小时来封闭载玻片。
6. 一抗孵育
   1. 在TBST中用3%BSA稀释抗体（1:50-1:1，000，取决于Ab）。
   2. 在加湿室中于4°C孵育过夜。
   3. 用TBST洗涤3 x 5分钟。
7. 二抗孵育
   1. 用 3% BSA（TBST）（1:250）或 5% 普通驴血清稀释抗体。
   2. 在室温（RT）下在黑暗中孵育1小时，因为抗体与荧光团偶联。
8. 核染色
   1. 在TBST中以1:1，000的比例稀释4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。
   2. 在室温下孵育5分钟。
   3. 用TBST洗涤2 x 5分钟。
9. 安装
   1. 使用一滴封片剂安装盖玻片。
   2. 第二天用指甲油密封盖玻片。

结果

小鼠子宫内膜类器官的相衬图像
我们从WT小鼠子宫内膜上皮建立了类器官，如所附方案所述（见 图1中的图表）。在对小鼠子宫内膜上皮进行酶解离后，将上皮片与子宫基质细胞机械分离，并进一步与胶原酶解离以产生单细胞悬液。如果正确执行，这种上皮和基质细胞分离方法应产生污染不超过相反细胞类型10%-15%的样品（参见 图2中的免...

讨论

在这里，我们描述了从小鼠子宫内膜生成子宫内膜上皮类器官的方法以及常规用于其下游分析的方案。子宫内膜类器官是研究控制子宫内膜相关疾病（如子宫内膜异位症、子宫内膜癌和植入失败）的机制的有力工具。2017年发表的具有里程碑意义的研究报告了长期和可再生培养小鼠和人类上皮子宫内膜类器官的条件4^，5。尽管类器官已被广泛用于研究其?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Organoid Media Formulation
Name	Company	Catalog Number	Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free	Corning	354230	100%
Trypsin from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	T1426-1G	1%
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634010	1X
N2 supplement	Life Technologies	17502048	1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A	Life Technologies	12587010	1X
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165-5G	1.25 mM
L-glutamine	Life Technologies	25030024	2 mM
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636-100G	10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01	Tocris	2939	500 nM
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	50 ng/mL
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C	100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1	Peprotech	120-38	500 ng/mL
Recombinant human FGF-10	Peprotech	100-26	100 ng/mL
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	50 ng/mL
WNT3a	R&D systems	5036-WN	200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name	Company	Catalog Number	Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C0130-1G	5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	DN25-100MG	2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190-250	1X
HBSS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14170112	1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)	Fisher Scientific	#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)	Fisher Scientific	#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm	Fisher Scientific	#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)	Genesee Scientific	11-331
Trizol reagent	Invitrogen	15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	ThermoFisher	11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped	Sigma Aldrich	F6765-500ML	2%
Estratiol (E2)	Sigma Aldrich	E1024-1G	10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade	VWR	15710	4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes	Fisher Scientific	1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds	Fisher Scientific	64-010-15
Ethanol, 200 proof (100%)	Fisher Scientific	22-032-601
Histoclear	Fisher Scientific	50-899-90147
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags	Fisher Scientific	6774010
HistoGel Specimen Processing Gel	VWR	83009-992
Hematoxylin solution Premium	VWR	95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium	VWR	95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4	GenDEPORT	T8054	1X
TBST (10X), pH 7.4	GenDEPORT	T8056	1X
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	S4641-500G
Tween20	Fisher Scientific	BP337-500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-100G	3%
DAPI Solution (1 mg/mL)	ThermoFisher	62248	1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Labs	H-1000-10
Clear Nail Polish	Fisher Scientific	NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	22037246
VWR Micro Cover Glasses	VWR	48393-106
SuperScript VILO Master Mix	ThermoFisher	11755050
SYBR Green PCR Master Mix	ThermoFisher	4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)	DSHB	TROMA-I	1:50 dilution
Vimentin Antobody	Cell Signaling	5741S	1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-21209	1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21206	1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope	ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera	ZEISS
Primer Sequence	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')	_
Lipocalin 2 (Lcn2)	GCAGGTGGTACGTTGTGGG	CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)	TGAGGCCCTTGGACTCTGT	ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)	CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC	TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)	CAATGTGTCCGTCGTGGATCT	GCCTGCTTCACCACCTTCTT