用于分离多功能循环肿瘤细胞的临床微流控芯片平台

摘要

临床微流控芯片是一种重要的生物医学分析技术，可简化临床患者血液样本预处理，并在芯片上原 位 对循环肿瘤细胞（CTC）进行免疫荧光染色，从而可以快速检测和鉴定单个CTC。

摘要

循环肿瘤细胞 （CTC） 在癌症预后、诊断和抗癌治疗中具有重要意义。CTC 计数对于确定患者疾病至关重要，因为 CTC 很少见且具有异质性。CTC从原发肿瘤分离，进入血液循环系统，并可能在远处生长，从而转移肿瘤。由于CTC携带与原发肿瘤相似的信息，因此CTC分离和随后的表征对于监测和诊断癌症至关重要。稀有CTC的计数、亲和力修饰和临床免疫荧光染色是CTC分离的有效方法，因为它们提供了具有高灵敏度的必要元素。微流控芯片提供了一种液体活检方法，对患者没有任何痛苦。在这项工作中，我们提出了临床微流控芯片的协议列表，这是一种多功能CTC分离平台，其中包含CTC分离，分析和早期诊断所需的一组功能和服务，从而促进生物分子分析和癌症治疗。该计划包括罕见肿瘤细胞计数，临床患者血液预处理，其中包括红细胞裂解，以及在微流控芯片上 原位 分离和识别CTC。该程序允许精确计数肿瘤细胞或CTC。 此外，该程序还包括一个工具，该工具将CTC分离与多功能微流控芯片相结合，并在芯片上进行 原位 免疫荧光鉴定，然后进行生物分子分析。

引言

循环肿瘤细胞 （CTC） 在癌症预后、诊断和抗癌治疗中具有重要意义。CTC 计数至关重要，因为 CTC 很少见且具有异质性。稀有CTC的计数、亲和力修饰和临床免疫荧光染色是CTC分离的强大技术，因为它们提供了具有高灵敏度的必要元素¹。罕见数量的肿瘤细胞与正常血液混合，与真实患者血液非常相似，因为 2-3 mL 的真实患者血液仅包含 1-10 个 CTC。为了解决一个关键的实验问题，与其使用PBS中引入的大量肿瘤细胞或与正常血液混合，不如使用稀有数量的肿瘤细胞为我们提供少量的血细胞，这在进行实验时更接近现实。

癌症是世界上导致死亡的主要原因².CTC是从原始肿瘤脱落的肿瘤细胞，在血液和淋巴^{循环系统中循环}3。当CTC移动到一个新的可存活环境时，它们会作为第二个肿瘤生长。这称为转移，占^{癌症患者死亡}的90%4。CTC 对于预后、早期诊断和了解癌症机制至关重要。然而，CTC在^{患者血液中极为}罕见且异质性^5,6。

微流控芯片提供不会侵入肿瘤的液体活检。它们具有便携、低成本和具有电池匹配规模的优点。用微流控芯片分离CTCs主要分为两种类型:亲和型，依靠抗原抗体结合^7,8,9，^是CTC分离的原始和应用最广泛的方法;和基于物理的芯片，利用肿瘤细胞和血细胞之间的大小和变形性差异^{10,11,12,13,14,15}，无标记^，易于操作。与其他技术相比，微流控芯片的优势在于，基于物理的大椭圆微滤子方法能够以高捕获效率牢固地捕获CTC。原因是椭圆微柱被组织成细长的线-线间隙隧道。线-线间隙不同于菱形微型柱等微柱形成的传统点-点间隙。基于波芯片的CTC捕获结合了基于物理性质和基于亲和力的分离。基于波浪芯片的捕获涉及30个波浪形阵列，抗EpCAM抗体包被在圆形微柱上。CTC被小间隙捕获，大间隙用于加速流速。错过的CTC必须通过下一个阵列中的小间隙，并被集成在芯片¹⁶内的基于亲和力的隔离捕获。

该协议的目标是证明稀有数量的肿瘤细胞的计数以及使用微流控芯片对CTC的临床分析。该协议描述了CTC分离步骤，如何获得少量肿瘤细胞，小椭圆过滤器，大椭圆过滤器和梯形过滤器的临床物理分离，亲和力修饰和富集¹⁷。

研究方案

患者血液样本由上海医科大学附属龙华医院提供，该方案遵循北京大学第三医院人类研究伦理委员会的指导方针。获得患者的知情同意，将样本用于研究目的。

1. 预实验以检查培养的肿瘤细胞的捕获效率

1. 培养肿瘤细胞MCF-7，MDA-MB-231和HeLa以确定捕获效率。稀释肿瘤细胞悬液，计数肿瘤细胞数，重复直至获得1mL PBS中所需数量的细胞。
   1. 在起始细胞数为 ~ 1 x 10 的细胞培养瓶中培养细胞，在 1 mL 补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养细胞。在37°C的加湿气氛中用5%CO₂气氛孵育。
   2. 当细胞系作为贴壁单层生长至95%汇合时，如Chen等人¹⁶中所述，用0.25%胰蛋白酶溶液将它们从培养皿中分离2分钟。
   3. 用钙黄绿素AM染色肿瘤细胞。将3μL钙黄绿素AM放入培养皿中，并将培养皿在培养箱中保持30分钟。然后，用胰蛋白酶消化所有细胞。
   4. 用细胞计数室计数PBS中培养的肿瘤细胞，并稀释至每1mL PBS获得100个肿瘤细胞。
      注意:为了精确枚举细胞数量，取50μL获得的细胞悬液，用显微镜观察其中的肿瘤细胞数量是否为5个。根据50μL细胞悬液中肿瘤细胞的实际数量，确定获得100个肿瘤细胞所需的细胞悬液体积。
2. 使用带有注射泵的注射器以 0.5 mL/h、1 mL/h、2 mL/h、3 mL/h、4 mL/h 和 5 mL/h 的不同流速将每 1 mL PBS 含有 100 个肿瘤细胞的细胞悬液引入微流控芯片。获得各种流速的捕获效率，并确定最佳流速。
   1. 计算芯片上捕获并从出口流出的肿瘤细胞的数量。捕获效率计算如下:
      捕获效率 = 捕获的细胞数/（捕获的细胞数 + 流出的细胞数） × 100%
   2. 重复以获得从10到100（10,20,30,40,50,60,70,80,90,100）的不同数量的肿瘤细胞的捕获效率。
3. 测试和验证微流控芯片的稀有数量肿瘤细胞。使用由微量移液器拉拔器制成的空心针将这 10 种样品悬浮液注入微流控芯片中，以吸出在 1 mL PBS 中稀释的 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 个肿瘤细胞。检测并枚举每个样品在芯片上捕获后的肿瘤细胞数量。
   注意:空心针长约3厘米，外径1毫米。
4. 对加标到正常血液样本中的肿瘤细胞进行临床实验前测试。
   1. 用钙黄绿素AM染色肿瘤细胞，然后在5μLPBS中枚举100个肿瘤细胞。将这些细胞加标到 1 mL 的全正常血液样本中。将这些细胞引入芯片中，并用绿色免疫荧光枚举芯片上捕获的肿瘤细胞数量。如上所述在芯片上进行 体内 计数，并计算捕获后的捕获效率。
   2. 对从10到90（10,20,30,40,50,60,70,80,90）的九种其他浓度的肿瘤细胞数重复步骤1.4.1。
   3. 如步骤1.3所述枚举1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个肿瘤细胞而不染色，加标到1mL全正常血液中，将这些样品引入微流控芯片中，并捕获芯片上的肿瘤细胞。
   4. 用Hoechst，CK-FITC和CD45-PE在芯片上染色。将 3-5 μL 荧光染料放入 20-30 μL PBS 中，然后用注射器将该溶液引入微流控芯片上。用蓝色和绿色免疫荧光枚举芯片上捕获的肿瘤细胞数量，以确定捕获效率。
5. 对微流控芯片进行修改，以基于亲和力捕获抗EpCAM。
   注意:由于波形芯片结合了基于亲和力和基于物理属性的隔离，因此请使用代理修改芯片。
   1. 用 100 μL 4% （v/v） 3-巯基丙基三甲氧基硅烷在室温下在乙醇中修饰芯片表面 45 分钟。小心而缓慢地将此溶液引入芯片中，以防它破坏芯片的内部结构，尤其是顶面和基板玻璃的粘合。
      注意:芯片表面使用巯基硅烷进行改性。芯片上发生的相互作用由化学键决定。建立化学键以实现抗体与抗原修饰的键合。芯片内部对各种试剂进行修饰，以建立相互连接的化学键。最后要修饰的试剂是抗上皮粘附分子（抗EpCAM）。EpCAM的肿瘤细胞表面抗原与芯片内部的抗EpCAM结合，实现CTC的捕获。
   2. 用乙醇洗涤3倍。在芯片上加入 100 μL 偶联剂 N-y-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯 （GMBS， 1 μM），并使其相互作用 30 分钟。
   3. 用PBS清洗3倍。使用注射器将 1 mL PBS 引入芯片进行清洗。
   4. 在室温下用 30-40 μL 10 μg/mL 中性粒蛋白处理芯片 30 分钟，导致细胞固定在 GMBS 上，然后用 PBS 冲洗以去除多余的亲和素。
   5. 用 3 μL 浓度为 10 μg/mL 的抗生物素化 EpCAM 抗体在 100 μL PBS 和 1% （w/v） BSA 中修改芯片。保持这个过夜。

2. 芯片上计数循环肿瘤细胞（CTC）的临床实验

1. 使用红细胞裂解 （RBCL） 溶液预处理临床癌症患者血液样本，或使用注射器将 2-3 mL 血液样本直接引入微流控芯片上。
   1. 执行预处理，大约需要 30 分钟。在抗凝管中收集全血样本。将 6-9 mL RBS 裂解液加入 2-3 mL 血液中。在室温下以111× g 离心5-8分钟，并丢弃上层红色透明液体。
2. 捕获、染色、识别和枚举芯片上的细胞，如下所述。
   1. 按照步骤1中所述捕获芯片上的细胞，对使用Hoechst，CK-FITC和CD45-PE捕获的CTC的芯片进行染色。CK-FITC是肿瘤细胞的特异性染色剂，CD45-PE是针对白细胞的。
   2. 将 3 μL CK-FITC 加入 20 μL PBS 中。将其引入注射器，并将稀释的CK-FITC泵送到芯片上。静置30分钟。将 300 μL PBS 引入芯片以清洗芯片。
   3. 将 3 μL CD45-PE 加入 20 μL PBS 中。将其引入注射器，并将稀释的CD45-PE泵送到芯片上。静置30分钟。将 300 μL PBS 引入芯片以清洗芯片。
   4. 用倒置荧光显微镜以20倍或40倍放大倍率识别CTC。CTC发出蓝色和绿色荧光，白细胞（WBC）发出蓝色和红色荧光。识别具有蓝色和绿色荧光的CTC以及具有蓝色和红色荧光的WBC。
   5. 从免疫荧光图像中，枚举芯片上捕获的CTC数量。将CTC枚举为Hoechst+/CK-FITC+/CD45−，将WBC枚举为Hoechst+/CK-FITC−/CD45+。
3. 通过与注射器相反方向用PBS冲洗到微流控芯片上来富集捕获的CTC，以从入口收集芯片上捕获的CTC。使用含有1mL PBS的注射器，从出口引入以在2-3分钟内富集芯片上捕获的CTC，并从入口收集它们。每个洗涤步骤使用 1 mL PBS，重复 3 次。
4. 如下所述对微流控芯片上捕获的肿瘤细胞或CTC进行染色。
   1. 使用钙黄绿素AM染色。将 5 μL 钙黄绿素 AM 加入 20 μL PBS 中，将细胞染色 30 分钟，然后在室温下以 111 x g 离心 2 分钟以获得肿瘤细胞，并悬浮在 1 mL PBS 中。
   2. 要鉴定细胞核，以大椭圆微滤片的最佳流速和梯形微滤片的最佳流速向芯片中加入 20 μL DAPI 溶液（10 μL DAPI 试剂在 20 μL PBS 中）。通过 20 μL 抗细胞角蛋白储备溶液（20 μL PBS 中的 3 μL 抗细胞角蛋白抗体）与芯片反应 30 分钟。
   3. 对芯片上捕获的白细胞进行染色。在芯片上捕获CTC后，向芯片中加入25μL抗CD45抗体溶液（20μL PBS中的5μL抗CD45溶液），并染色30分钟。用PBS洗涤，并用蓝色和绿色荧光鉴定上皮细胞。
5. 使用荧光显微镜进行免疫荧光鉴定，如下所述。
   1. 使用荧光显微镜并用蓝色激光激发样品。找到发出蓝色荧光的细胞，它们是有核细胞。使用以下放大倍率之一:10x、20x 或 40x。为肿瘤细胞找到一个清晰的区域。对于蓝色激光源，请使用420-485nm的激发板波长和515nm的发射板波长。
   2. 在不移动样品的情况下，使用另一个激光源。旋转荧光显微镜并用绿色激光激发样品。找到发出绿色荧光的细胞，这表明肿瘤细胞。使用此绿色激光源以相同的放大倍率拍摄同一视场的图像。同时发出蓝色和绿色荧光的细胞被认为是肿瘤细胞。对于绿色激光源，请使用460-550nm的激发板波长和590nm的发射板波长
   3. 在不移动样品的情况下，使用另一个激光源。旋转荧光显微镜并用红色激光激发样品。找到发出红色荧光的细胞。使用此红色激光源以相同的放大倍率拍摄同一视场的图像。同时发出蓝色和红色荧光的细胞被识别为白细胞。
   4. 保存图像，以便使用上面的每个激光源获得。用不同颜色的灯光拍摄同一场的几张图像。
   5. 使用激发板波长为330-400nm，发射板波长为425nm的紫外光。使用激发板波长为395-415nm，发射板波长为455nm的紫色光。
6. 如步骤1.2.1所示计算捕获效率。

结果

整个设置包括注射泵、注射器和微流体芯片。注射器中的细胞悬液连接到注射泵，并将细胞悬液引入微流控芯片以捕获细胞。所有使用的微流控芯片的捕获效率约为90%或更高。对于波浪芯片，我们设计了具有不同间隙的微结构。小间隙用于捕获CTC，大间隙用于加速流速。细胞悬液在大间隙区域快速流动。错过的CTC往往被后续阵列¹⁶中的小间隙捕获。对于椭圆芯片，我们设计了线-?...

讨论

癌症的预后和早期诊断对癌症治疗有显著影响¹.使用微流控芯片进行CTC分离可提供无侵入的液体活检。然而，CTC^{在血液中极为}罕见且异质性1，这使得分离CTC具有挑战性。因此，CTC在癌症转移中起着至关重要的作用¹。

所提出的协议允许使用微流控芯片对CTC分离进行完整分析。该协议包括与CTC隔离相关的所有关键程序。例如...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
calibrated microcapillary pipettes	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoclonal antibody
DMEM	HyClone	SH30081.05
fetal bovine serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicillin-streptomycin	Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010