使用癌细胞系的传递软骨Cybrid生成

摘要

该协议描述了一种从悬浮生长的癌细胞生成cybrid的技术，作为研究线粒体在致瘤过程中作用的工具。

摘要

近年来，致力于确定线粒体与癌症之间联系的研究数量显着增加。然而，仍然需要做出更多的努力来充分了解涉及线粒体改变和肿瘤发生的联系，以及识别与肿瘤相关的线粒体表型。例如，为了评估线粒体在肿瘤发生和转移过程中的贡献，必须了解线粒体在不同核环境中肿瘤细胞的影响。为此，一种可能的方法是将线粒体转移到不同的核背景中以获得所谓的cybrid细胞。在传统的细胞化技术中，缺乏mtDNA（ρ0^，核供体细胞）的细胞系被来自去核细胞或血小板的线粒体重新填充。然而，剜除过程需要良好的细胞粘附在培养板上，在许多情况下，侵袭性细胞会部分或完全失去这一特征。此外，传统方法中发现的另一个困难是从线粒体受体细胞系中完全去除内源性mtDNA，以获得纯核和线粒体DNA背景，避免在生成的cybrid中存在两种不同的mtDNA物种。在这项工作中，我们提出了一种应用于悬浮生长癌细胞的线粒体交换协议，该方案基于罗丹明6G预处理细胞与分离线粒体的重新繁殖。这种方法使我们能够克服传统方法的局限性，因此可以用作扩展对线粒体在癌症进展和转移中的作用的理解的工具。

引言

重编程能量代谢是癌症¹的标志，这是奥托·沃伯格（Otto Warburg）在1930^年代首次观察到的2。在有氧条件下，正常细胞将葡萄糖转化为丙酮酸，然后产生乙酰辅酶A，为线粒体机器提供燃料并促进细胞呼吸。然而，Warburg证明，即使在常氧条件下，大多数癌细胞将从糖酵解过程中获得的丙酮酸转化为乳酸，从而改变其获取能量的方式。这种代谢调节被称为“Warburg效应”，使一些癌细胞能够提供其快速生长和分裂的能量需求，尽管产生ATP的效率低于有氧过程³，^4，5。近几十年来，许多工作支持代谢重编程在癌症进展中的含义。因此，肿瘤能量学被认为是对抗癌症的有趣靶标¹。作为能量代谢和必需前体供应的中心枢纽，线粒体在这些细胞适应中起着关键作用，迄今为止，我们只部分了解这些细胞。

根据上述情况，线粒体DNA（mtDNA）突变已被提出为这种代谢重编程的可能原因之一，这可能导致电子传递链（ETC^{）性能受损}6，并解释为什么一些癌细胞增强其糖酵解代谢以存活。事实上，据报道mtDNA在癌细胞内积累突变，至少存在于50%的肿瘤

研究方案

注意： 表1中指定了所有培养基和缓冲液组合物。在cybrid生成之前，必须对来自供体和受体细胞的线粒体和核DNA图谱进行分型，以确认细胞系之间两个基因组中存在遗传差异。在这项研究中，使用了市售的L929细胞系及其衍生的细胞系L929dt，该细胞系是我们实验室自发产生的（更多信息见¹³ ）。这些细胞系在其 mt-Nd2 基因序列中存在两种差异，一旦细胞化过程完成，可用于确认mtDNA的纯度¹³。在这种情况下，核背景的纯度通过抗生素敏感性得到证实，因为与L929dt细胞相反，L929对遗传素具有抗性。

1.罗丹明6G处理（受体细胞）耗竭线粒体

注意：成功生成cybrid的第一步是完全和不可逆地消除受体细胞中的线粒体功能。为此，有必要事先确定每个细胞系的适当浓度和罗丹明6G的处理持续时间。这个足够的浓度应该略低于药物诱导的细胞死亡（在治疗过程中不会杀死细胞的最高浓度）。定义最佳条件后，执行以下操作。

1. 使用完整的培养基在6孔板中接种10⁶ 个细胞（详见 表1 ），并根据细胞系每天用最佳浓度的罗丹明6G处理3-10天。传统浓度范围为2至5μg/mL，持续3-10天

讨论

自从Otto Warburg报道癌细胞改变其新陈代谢并增强“有氧糖酵解”³，^4，同时减少线粒体呼吸以来^，对线粒体在癌症转化和进展中的作用的兴趣呈指数级增长。近年来，mtDNA突变和线粒体功能障碍已被假定为许多癌症类型的标志²⁵。迄今为止，许多研究已经分析了特定肿瘤6，26，²⁷，^28，29

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750