用于同步评估荧光生物传感器动力学和激素分泌谱的人假胰岛系统

摘要

该协议描述了一种使用环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器，cAMP原 位 差异检测器（cADDis）和微灌注系统的腺病毒递送，通过原代人假胰岛同步获取和共同注册细胞内信号转导事件以及胰岛素和胰高血糖素分泌的方法。

摘要

朗格汉斯胰岛是散布在整个胰腺中的特化内分泌和支持细胞的小型 3D 集合，通过降低血糖的 β 细胞分泌胰岛素和升高血糖的 α 细胞分泌胰高血糖素，在控制葡萄糖稳态方面发挥着核心作用。细胞内信号通路，包括由cAMP介导的信号通路，是调节α和β细胞激素分泌的关键。3D胰岛结构虽然对协调胰岛功能至关重要，但对原代人胰岛细胞细胞内信号通路的机制研究提出了实验挑战。为了克服这些挑战和局限性，该协议描述了一个集成的活细胞成像和微流体平台，该平台使用由非糖尿病供体产生的原代人假胰岛，其形态，组成和功能类似于天然胰岛。这些假胰岛通过原代人胰岛细胞的分散和再聚集过程进行大小控制。在分散状态下，胰岛细胞基因表达可以纵;例如，可以引入生物传感器，例如基因编码的cAMP生物传感器cADDis。一旦形成，表达基因编码生物传感器的假胰岛，结合共聚焦显微镜和微周灌注平台，可以同步评估荧光生物传感器动力学以及 α 和 β 细胞激素分泌谱，以更深入地了解细胞过程和功能。

引言

朗格汉斯胰岛是散布在整个胰腺中的微型器官，其功能对于维持葡萄糖稳态至关重要。胰岛素是在葡萄糖代谢、ATP/ADP 比值增加、ATP 敏感钾通道关闭、质膜去极化和细胞外钙流入后从 β 细胞分泌的¹。α 细胞分泌胰高血糖素知之甚少，但据推测，细胞内和旁分泌途径有助于胰高血糖素颗粒胞吐作用 ^2,3,4。1 型和 2 型糖尿病都与胰岛细胞功能障碍有关 ^5,6,7。因此，阐明介导胰岛激素分泌的细胞内信号通路对于理解胰岛的生理和病理机制至关重要。

胰岛的球形结构给实验带来了一定的障碍。这些挑战包括胰岛大小变化和胰岛的 3D 性质，这会减少胰岛核心内的病毒转导 ^8,9。为了克服这些挑战，开发了一种假胰岛系统，其中原代人类胰岛分散到单个细胞中，用编码目标靶标的构建体进行腺病毒转导，并重新聚集以形成大小可控的胰岛样结构，称为假胰岛

研究方案

人胰岛（N = 4 种制剂）是通过与综合胰岛分布计划、人类胰腺分析计划、Prodo Laboratories， Inc. 和 Imagine Pharma 合作获得的。范德比尔特大学机构审查委员会不认为去识别化的人类胰腺标本是人类受试者研究。如果没有器官捐献者、他们的家人和器官采购组织，这项工作是不可能的。捐助者人口统计信息见 表1 。从没有糖尿病的胰腺供体中分离出人胰岛，冷缺血时间少于 15 小时。

1.假胰岛形成（详见Walker等人。^七）

1. 使用P200移液器和台式显微镜获取并手动挑选原代人胰岛，密切注意不要污染胰岛培养基以外的任何表面上的移液器吸头（10%FBS，100μg/ mL链霉素，100U / mL青霉素，CMRL 1066中的2mM L-谷氨酰胺）。
2. 将原代胰岛转移到 15 mL 试管中，并在组织培养罩下执行以下所有假胰岛形成步骤，以防止污染。在室温下用P1000移液管在0.025%胰蛋白酶中缓慢解离原发胰岛7分钟。当胰岛开始分裂时，溶液将变得不透明。
   1. 对于这些研究，将 200-300 个直径约为 200 μm 的人工挑选的原代胰岛分散在 500 μL 的 0.025% 胰蛋白酶中，产生 1 至 2 个 96 孔板的假胰岛;确切的数量可能因平均胰岛大小和活力而....

讨论

微潜灌系统、表达生物传感器的假胰岛和激光扫描共聚焦显微镜的集成允许同步评估细胞内信号转导事件和动态激素分泌谱。动态微周灌注系统可以向假胰岛提供一系列明确的刺激，并允许收集流出物，其中胰岛素和胰高血糖素浓度可以通过市售的ELISA测量。同时，通过共聚焦显微镜平台对表达生物传感器的假胰岛进行活细胞成像，捕获实时生物传感器荧光活性，从而提供有关细胞内信号转导事?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component