区域特异性去细胞化肺组织的解剖和分离

摘要

这里介绍的是用于分离区域脱细胞肺组织的方案。该协议为研究细胞外基质和细胞-基质相互作用的复杂性提供了强大的工具。

摘要

肺移植通常是严重肺部疾病晚期患者的唯一选择，但由于合适的供体肺的供应以及移植后的急性和慢性排斥反应，这都是有限的。确定用于替代患病肺的新型生物工程方法对于提高患者生存率和避免与当前移植方法相关的并发症至关重要。另一种方法是使用缺乏细胞成分的去细胞化全肺，这些成分通常是急性和慢性排斥反应的原因。由于肺是一个如此复杂的器官，因此检查特定区域的细胞外基质成分（包括脉管系统，气道和肺泡组织）是有意义的。这种方法的目的是建立简单且可重复的方法，研究人员可以通过这些方法从完全脱细胞的肺中解剖和分离区域特异性组织。目前的方案是为猪和人类的肺设计的，但也可以应用于其他物种。对于该方案，指定了组织的四个区域：气道，脉管系统，肺泡和大量肺组织。与传统的批量分析方法相比，该程序允许获取更准确地代表去细胞化肺组织内容物的组织样本。

引言

肺部疾病，包括慢性阻塞性肺病（COPD），特发性肺纤维化（IPF）和囊性纤维化（CF），目前仍未治愈1,2,3,4。肺移植通常是晚期患者的唯一选择，但由于提供合适的供体肺以及移植后的急性和慢性排斥反应，这仍然是一个有限的选择^3,5,6。因此，迫切需要新的治疗策略。呼吸生物工程中一种有前途的方法是应用由去细胞化的天然肺组织制备的组织来源支架。由于无细胞全肺支架保留了天然细胞外基质（ECM）组成和生物活性的大部分复杂性，因此它们已被深入研究用于全器官工程，并作为研究肺部疾病机制的改进模型7,8,9,10。同时，人们越来越有兴趣利用来自不同器官（包括肺）的脱细胞组织作为水凝胶和其他底物来研究类器官和其他组织培养模型中的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用11,12,13,14,15,16,17.这些提供了比市售底物（例如来自肿瘤来源的基质胶）更相关的模型。然而，目前关于人肺源性水凝胶的信息相对有限。我们之前已经描述了来自脱细胞猪肺的水凝胶，并表征了它们的机械和材料特性，并证明了它们作为细胞培养模型的实用性^18,19。最近的一份报告详细介绍了源自脱细胞正常和患病（COPD，IPF）人肺的水凝胶的初始机械和粘弹性表征²⁰。我们还提供了表征去细胞正常肺和COPD人肺糖胺聚糖含量的初始数据，以及它们在研究细胞 - 细胞和细胞 - ECM相互作用中的适用性¹¹。

这些例子说明了将脱细胞人肺ECM用于调查目的的力量。然而，肺是一个复杂的器官，其结构和功能在肺的不同区域各不相同，包括ECM组成和其他特性，如硬度^21,22。因此，研究肺部各个区域的ECM是有意义的，包括气管和大气道，中型和小型气道和肺泡，以及大，中和小血管。为此，我们开发了一种可靠且可重复的方法，用于解剖脱细胞的人肺和猪肺，并随后分离出每个解剖区域。这使得可以对正常肺和患病肺中的区域蛋白质含量进行详细的差异分析²¹。

研究方案

所有动物研究均按照佛蒙特大学（UVM）的IACUC进行。所有人类肺均从UVM尸检服务中获得，并根据UVM的IRB指南进行相关研究。

注意：猪和人肺的去细胞化先前已由我们的^组7,8,9,10,21描述。简而言之，使用蠕动泵用一系列 2 L 洗涤剂和酶溶液对气道和脉管系统进行顺序灌注，使整个肺叶脱细胞：0.1% Triton-X 100、2% 脱氧胆酸钠、1 M 氯化钠、30 μg/mL 脱氧核糖核酸酶/1.3 mM MgSO 4/2 mM CaCl₂、0.1% 过氧乙酸/₄% 乙醇， 和去离子水清洗。确认有效去细胞化的标准方法包括通过凝胶电泳测定脱细胞肺内<50 ng / mg残留的双链DNA，以及通过苏木精和伊红（H&E）染色^9,21进行核染色。

1. 设置

1. 收集解剖程序所需的所有必要设备，包括玻璃砂锅，两对手术镊子，一对镊子和一对手术剪刀，并在使用前高压灭菌。
2. 获取一部分肺，将其放入玻璃砂锅中，并定向，以便可以清楚地看到气道的上端。
3. 确定脉管系统的近端，并保持其完整，直到后续步骤。脉管系统的末端应清晰可见，并且颜色完全不透明。
4. 使用一把镊子和手术剪刀，去除可能衬在肺外部的任何胸膜并丢弃。

2. 暴露气道

1. 使用手术剪刀的铺展技术，轻轻地工作以暴露额外的气道。
   1. 找到最大的气道，其直径通常约为 2-4 厘米。识别气道的另一种方法是通过观察软骨环，可以通过视觉或通过触诊组织 来 检测。
   2. 使用一对镊子，触诊气道的长度，以确定看不见的气道的位置，深度约为 1 英寸。
      注意：气道衬有软骨环，其特征是比其他肺组织更硬。因此，发现和触诊看不见的气道应该相对简单。
   3. 将手术剪刀平行于气道，将闭合的尖端插入直接围绕看不见的气道的组织中。
   4. 慢慢打开手术剪刀，轻轻拉开周围的膜。随后，取下手术剪刀，避免切割任何组织。
   5. 在整个解剖过程中间歇性地重复此过程以继续暴露气道。
2. 使用手术剪刀，在分支点切割气道并沿任一分支独立解剖。
   注意：分支点是一个气道分裂成两个独立气道的位置。
3. 一旦确信完整的末端仍然可识别并易于定位以进行进一步解剖，气道的切断区域就会被切断。
4. 将气道的切断区域放入相应的管中。切断区域的大小将根据样品而有所不同，但通常长度在 1-5 厘米之间。宽度根据沿气道树的相对位置而变化，远端区域的宽度比更近端的区域保持较小的宽度。

3. 暴露和切除脉管系统区域

1. 对脉管系统施加温和的压力，然后慢慢远离气道。让脉管系统稍微伸展，并使用手术剪刀进一步将脉管系统与气道分开。
   注意：压力过大会撕裂脉管系统。如果脉管系统撕裂，只需将该部分脉管系统放入相应的标记管中并识别其完整端。
2. 当维管树中的分支点暴露时，使用手术剪刀和镊子暴露脉管系统的更多下部区域。
   1. 首先将手术剪刀的闭合尖端插入分支点下方和两个相应的脉管系统区域之间。
   2. 慢慢打开剪刀，将下面的组织分开。
   3. 间歇性地使用一把镊子去除使用手术剪刀散开的组织，以及直接围绕脉管系统的任何其他组织。
3. 当脉管系统覆盖气道区域或对夹层操作中的任何步骤变得繁琐时，在分支点切割脉管系统，然后沿任一分支独立进一步解剖。
4. 一旦确信完整的末端将保持可识别并易于定位以进行进一步解剖，脉管系统的切断区域。

4.识别和切除肺泡组织

1. 使用一对镊子或镊子，捏住然后轻轻撕下牙槽组织的小区域。
   1. 定位不在气道或脉管系统的直接附近的组织区域。
   2. 使用镊子捏一小块似乎没有任何脉管系统或气道的组织区域。
   3. 从肺部撕裂组织的受压区域。
2. 观察切除的组织区域并确认它是否是肺泡组织。
   注意：肺泡组织存在于整个肺部，因此可以并且应该在整个解剖过程中将其去除。任何不容易识别为主要肺泡、脉管系统或气道的组织都应归类为散装组织，并放置在相应的标记管中。

结果

该协议的总体原理图如图1所示。一旦掌握，脱细胞肺组织的区域解剖很容易重现。确定每个切断组织样本的分类对于解剖程序的成功至关重要。血管组织比气道更具弹性，因此使用镊子拉伸组织通常是特定样本是脉管系统还是气道的有力指标。通常，血管组织平行于气道（图2A）。血管组织也往往比气道组织（图2C）更白和不透?...

讨论

来自人类和其他物种的脱细胞组织经常被用作生物材料，用于研究离体培养模型中的ECM组成以及细胞-ECM相互作用，包括3D水凝胶^12,13。与其他器官类似，脱细胞肺以前已被用于确定健康肺与患病（即肺气肿和IPF）肺中的ECM组成差异，并且越来越多地用作研究ECM动力学和细胞 - ECM相互作用的水凝胶7,8,9,10,11,14,15,16,1...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10