非洲爪蟾的有效快速血液灌注

摘要

这里介绍的是一种有效的快速血液灌注方案，用于制备非洲爪蛙的组织样本，用于转录组学和蛋白质组学研究。

摘要

100多年来，非洲爪蟾一直是了解脊椎动物发育和疾病的强大模式生物。在这里，定义了非洲爪蟾的快速血液灌注方案，旨在一致和急剧地减少所有组织内的血液。通过将针头直接插入心脏心室并通过血管系统泵送肝素化磷酸盐缓冲盐水（PBS）来进行灌注。每只动物可以在大约 10 分钟内完成该过程。血液由一些高度丰富的蛋白质和细胞类型主导，由于这些蛋白质掩盖了大多数其他感兴趣的分子和细胞类型，因此会产生许多问题。使用定量蛋白质组学和单细胞转录组学对成人非洲爪蟾组织的可重复表征将受益于在器官取样之前应用该协议。组织取样的方案在配套论文中定义。这些程序旨在使不同性别、年龄和健康状况的非洲爪蟾的做法标准化，特别是非洲爪蟾和热带爪蟾。

引言

为了保存和固定的目的，常规完成两栖动物的全身灌注1，²，³，⁴，5^，6。然而，这些程序的发生速度限制了每只动物可以采集的新鲜样本数量。这项工作的目标是在非洲爪蟾中开发一种有效的血液灌注方案，优先考虑该技术的速度。对于热带X. laevis，每只动物需要不到10分钟，每只X. laevis动物需要不到15分钟。次要优先事项是易于复制和使用易于获取的设备，以便可以在非洲爪蟾实验室之间广泛共享高质量的样品。

非洲爪 蟾广泛用于生物医学研究，以研究跨物种保存的基本生物学和病理过程。这种四足动物与其他水生模型相比，与哺乳动物有更密切的进化关系，有肺、三腔心脏和带手指的四肢。国际社会有效地利用 非洲爪蟾 ，通过对疾病相关基因功能的深入疾病建模和分子分析，对人类疾病有了更深入的了解。 非洲爪蟾 作为动物模型的众多优点使其成为研究人类发育和疾病的分子基础的宝贵工具;这些优点包括....

研究方案

所有实验均按照哈佛医学院IACUC（机构动物护理和使用委员会）（IS 00001365_3）的规则和规定进行。

注意：尽管美国兽医协会¹²认为所描述的主要安乐死方法是一种可接受的安乐死技术，但尚未发现它会导致心跳停止¹³。即使是常用的二次双皮管方法也不能阻止这种情况，也不能从动物身上取出心脏。麻醉动物的放血被认为是成功安乐死的人道和有效的方法¹².由于通过安乐死维持新鲜组织是该协议的目标，因此心脏继续通过MS-222的初级安乐死跳动是有益的，并且灌注本身是通过放血的继发性安乐死方法。

1. 准备

1. 确保研究机构已批准本协议中描述的安乐死和灌注技术。
2. 制备5 g / L MS-222（甲磺酸三卡因）和5 g / L碳酸氢钠的溶液。体积应大于完全覆盖被安乐死动物所需的体积。检查pH值以确保其为≥7。
3. 每乳杆菌制备 500 μL 180 U/mL 肝素的磷酸盐缓冲盐水 （PBS），或每热带乳杆菌制备 200 μL。
4. 通过将 非洲爪蟾 放入该溶液中进行初级安乐死（从步骤1.2开始）;动物将保持浸没状态总共1小时。
....

讨论

该协议描述了用于进入腔腔的传统解剖技术。其他技术也是可以接受的，只要它们对组织造成的损害最小，心脏是可接近的，肺和胃是可见的。同样，列出的大多数解剖工具都可以很容易地用类似的项目代替。

虽然已经尝试优化该程序的功效，但结果可能会因一个人的经验和个体青蛙之间的变异性而异。血液灌注的一个有趣的方面仍然不在本文的范围之内，即该程序与接受?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying glass with LED light and stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable transfer pipets	VWR	414004-036
Dissecting fine-pointed forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Fine dissection pins	Living Systems Instrumentation	PIN-#3
General use hypodermic needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826-5A	for X. laevis
General use hypodermic needles, 25 G	Fisher Scientific	14-826AA	for X. tropicalis
Heparin, porcine intestinal mucosa	MilliporeSigma	37-505-410MG
Iridectomy scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring	amazon.com	B09PTX6M2Z	size will be dependant on the hosing of the pump used
Mayo-Hegar needle holder	Fisher Scinetific	08-966	mosquito forceps are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min	amazon.com	B07PWY4SM6	any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable
Sharpening stone	VWR	470150-112	optional; for dulling needles
Sodium bicarbonate, powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen forceps, serrated	VWR	82027-442
T-Pins for dissecting	Fisher Scinetific	S99385
Ultra-fine short insulin syringes, 31 G	VWR	BD328438
Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers	amazon.com	B087P191LP